Cirurgia e Testes Comportamentais no Modelo de Transposição do Neuroma Tibial em Ratos

Resumo

Este protocolo descreve o modelo de transposição do neuroma tibial, que envolve uma lesão do nervo tibial com subsequente transposição da extremidade proximal do nervo para uma posição subcutânea pré-tibial ou lateral. O teste comportamental da dor do neuroma e da hiperalgesia plantar é quantificado usando monofilamentos de Von Frey.

Resumo

A transposição do neuroma tibial (TNT) é um modelo de rato no qual a alodínia no sítio do neuroma (nervo tibial) pode ser avaliada independentemente da alodínia na superfície plantar da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto. Esse modelo de TNT é adequado para testar terapias para a dor do neuroma, como a potencial superioridade de certas terapias cirúrgicas já utilizadas na clínica, ou para avaliar novos fármacos e seu efeito nas duas modalidades de dor no mesmo animal. Nesse modelo, uma lesão distal (neurotmese) é feita no nervo tibial, e a extremidade proximal do nervo é transposta e fixada subcutânea e pré-tibialmente para permitir a avaliação do sítio do neuroma com um monofilamento de Von Frey de 15 g. Para avaliar a alodínia sobre o nervo sural, os monofilamentos de Von Frey podem ser usados pelo método ascendente-descendente na região lateral plantar da pata traseira. Após o corte do nervo tibial, a hipersensibilidade mecânica se desenvolve no local do neuroma dentro de 1 semana após a cirurgia e persiste pelo menos até 12 semanas após a cirurgia. A alodínia na superfície plantar inervada sural desenvolve-se dentro de 3 semanas após a cirurgia em comparação com o membro contralateral. Com 12 semanas, um neuroma se forma na extremidade proximal do nervo tibial seccionado, indicado por dispersão e turbilhonamento de axônios. Para a cirurgia modelo TNT, múltiplos passos críticos (micro)cirúrgicos precisam ser seguidos, e alguma prática cirúrgica sob anestesia terminal é aconselhada. Em comparação com outros modelos de dor neuropática, como o modelo de lesão nervosa poupada, a alodínia sobre o sítio do neuroma pode ser testada independentemente da hipersensibilidade do nervo sural no modelo TNT. No entanto, o sítio do neuroma pode ser testado apenas em ratos, não em camundongos. As dicas e orientações fornecidas neste protocolo podem ajudar grupos de pesquisa que trabalham com dor a implementar com sucesso o modelo de TNT em seu serviço.

Introdução

Cada ferida, variando de simples lacerações a amputação de membros inteiros, é acompanhada por graus variados de lesão nervosa periférica. Tal lesão nervosa pode resultar na formação de um neuroma, um emaranhamento desorganizado de fibras nervosas brotantes. Os neuromas tornam-se dolorosos em 8%-30% dos pacientes, afetando severamente sua qualidade de vida 1,2,3,4,5. Após a amputação do membro, a dor do neuroma desenvolve-se em 50% dos pacientes ^6,7,8. Os sintomas relatados incluem sensibilidade, dor espontânea, alodínia, hiperalgesia e hipersensibilidade mecânica ou térmica na área inervada⁹. Quando não tratada adequadamente em 1 ano, a dor do neuroma pode evoluir para um estado de dor crônica, resultando em alta carga social e custos médicos associados 10,11,12,13,14. Devido à baixa eficácia das intervenções farmacológicas atuais, a dor do neuroma é tratada preferencialmente pela remoção cirúrgica do neuroma doloroso, e o nervo tratado por várias técnicas cirúrgicas, como descrito na literatura¹⁵. É importante ressaltar que o alívio completo da dor é raro, a dor geralmente piora com o tempo e 40% dos pacientes não se beneficiam da cirurgia, indicando que novos tratamentos são necessários ^1,16.

Um modelo padronizado de dor no rato auxilia na compreensão dos mecanismos que conduzem a dor do neuroma e pode ajudar a identificar novos tratamentos ou avaliar os já existentes usados na clínica. O modelo de transposição do neuroma tibial (TNT) foi descrito pela primeira vez por Dorsi e col. em 2008¹⁷ e tem sido utilizado por diferentes grupos de pesquisa^18,19,20. O objetivo geral deste método é ser capaz de testar diferentes técnicas de tratamento para a dor do neuroma. A vantagem do modelo sobre, por exemplo, o modelo de lesão nervosa poupada (SNI)²¹, é que ele permite testar a alodínia no sítio do neuroma. Isso porque o modelo envolve a transposição da terminação nervosa proximal do nervo tibial para uma posição pré-tibial subcutânea, onde pode ser sondado com monofilamentos de von Frey. Além disso, a alodínia se desenvolve na superfície plantar da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto, o que pode ser avaliado independentemente da dor do neuroma no mesmo animal. Isso é semelhante aos sintomas de dor do neuroma em pacientes, onde a dor neuropática persistente após a remoção de um neuroma doloroso às vezes é causada pelos nervos vizinhos²². Além disso, a alodínia sobre um nervo seccionado com neuroma é uma modalidade de dor diferente da alodínia sobre o nervo vizinho intacto. Assim, esse modelo facilita a avaliação do efeito de novas terapias tanto na alodínia presente no sítio do neuroma quanto na dor neuropática mais disseminada testada na superfície plantar da pata traseira. Como a cirurgia realizada para criar o modelo TNT pode ser desafiadora, este artigo elabora o procedimento para apoiar os pesquisadores na implementação do modelo em suas instalações.

Protocolo

Esta pesquisa foi realizada de acordo com o IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) e as diretrizes para pesquisa animal, projeto número AVD1150020198824.

1. Medições basais de Von Frey

1. Antes da cirurgia, realizar as medidas basais de acordo com o procedimento de teste de Von Frey, descrito abaixo nas seções 5 e 6.

2. Anestesia e preparo

NOTA: Este estudo foi realizado em 15 ratos machos Sprague Dawley com 12 semanas de idade.

1. Anestesiar os animais por indução com isoflurano a 5% e manter a anestesia com isoflurano a 2%-3%.
   OBS: A manutenção com isoflurano a 2% geralmente resulta em anestesia suficiente e respiração espontânea, sem a necessidade de intubação traqueal ou ventilação mecânica.
2. Verifique os reflexos dos animais apertando o pé com uma pinça. Certifique-se de que o animal não responde antes de prosseguir. Faça a barba do campo operatório do joelho ao tornozelo com um barbeador elétrico e aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento. Injetar 0,5 mg/kg de carprofeno analgésico por via subcutânea na região abdominal.
3. Coloque o rato anestesiado de costas com a cabeça para a esquerda ou para a direita e a perna a ser operada perto do cirurgião. Exorotar o membro posterior inferior de modo que o maléolo medial fique voltado para cima. Colocar o rato sob um microscópio cirúrgico estéreo com aumento de 6x.
4. Desinfetar a área raspada com três rodadas alternadas de esfoliação à base de iodo seguidas de álcool. Coloque uma folha estéril com um orifício operatório sobre a perna, para que apenas o campo operatório seja visível. Certifique-se de manter essas condições estéreis durante a cirurgia.

3. Cirurgia

1. Coloque um pequeno cotonete abaixo do tornozelo para manter o campo operatório horizontal. Localize o joelho e faça suavemente uma incisão longitudinal de 1-2 cm usando um bisturi sobre o lado medial da pata traseira do meio da panturrilha até o tornozelo. Se necessário, abra ainda mais a pele e subcutis com micro tesoura até que as camadas musculares fiquem visíveis.
2. Identificar o feixe neurovascular superficial como dois ou três brancos e uma linha roxa/vermelha mais espessa, às vezes com ramos menores, que podem mover-se livremente sobre as camadas musculares. Usando um eletrocautério (ver Tabela de Materiais), coagule qualquer sangramento ativo ou exsudação no campo operatório. Tenha cuidado para não danificar o feixe neurovascular.
3. Dissecar com firmeza para abrir a fáscia entre os músculos gastrocnêmios, logo posterior ao feixe neurovascular superficial de 3,2. Entre a fáscia dos músculos, encontra-se o nervo tibial. O nervo tibial tem cerca de três vezes o tamanho do nervo superficial no feixe vasculonervoso. Use o osso tibial como um ponto de referência adicional (o nervo tibial fica logo posterior ao osso tibial).
4. Identificar o nervo tibial e sua bifurcação.
   NOTA: A bifurcação é geralmente visível com uma linha mais clara longitudinalmente sobre o nervo.
5. Dissecar cuidadosamente o nervo tibial livre dos feixes vasculares circundantes. Realizar a dissecção movendo bruscamente o nervo tibial e cortando o tecido exposto que apresenta algum estiramento durante a movimentação do nervo tibial.
   NOTA: Se o nervo tibial estiver ligado às veias de cruzamento após a dissecção, essas veias podem ser coaguladas para expor todo o nervo tibial. Tenha cuidado para não coagular o feixe tibial em si.
6. Expor proximalmente o nervo tibial até que ele desapareça sob uma camada muscular transversal. Nesse ponto, o nervo tibial parece mergulhar mais profundamente na pata traseira em direção ao joelho. Expor o nervo tibial distalmente até o tornozelo.
   NOTA: Quando o nervo tibial é exposto mais distalmente, a quantidade de fibras colágenas cruzadas (ou seja, fibras perpendiculares à direção das fibras nervosas) aumentará. Essas fibras colágenas precisam ser cortadas para permitir comprimento suficiente para transpor o nervo tibial.
   1. Quando todo o nervo tibial estiver exposto, coloque as camadas musculares de volta para evitar a desidratação do nervo. Se o nervo desidratar (ou seja, ficar mais rígido, sem brilho e enrugado), e cobrir com camadas musculares não for suficiente, adicione gotas de soro fisiológico para hidratá-lo.
7. Com uma ferramenta de microcirurgia romba, de preferência um porta-microagulhas, disseque a pele pré-tibial da camada muscular subcutânea para fazer um túnel subcutâneo. Para fazer isso, segure a pele e empurre a ponta romba para dentro do tecido, paralelamente à pele. Certifique-se de que a extremidade do túnel esteja localizada pré-tibialmente ou mais lateralmente para garantir fácil acessibilidade da área para teste do neuroma.
8. Aumentar o isoflurano para 5%. Retornar ao nervo tibial e expô-lo (ou seja, voltar ao local descrito no passo 3.6). Cortar o nervo tibial (ou seja, ambos os ramos plantares) no nível mais distal próximo ao tornozelo. Diminuir o isoflurano para o nível normal de 2%-3%.
9. Mude a ampliação do microscópio para 10x ou 16x. Identificar o epineuro do nervo tibial proximal ao corte realizado no passo 3.8, ou, no caso de uma bifurcação mais proximal do nervo tibial, identificar o epineuro de ambos os ramos plantares medial e lateral proximal ao corte no passo 3.8.
   NOTA: O epineuro é mais branco e firme em comparação com as fibras nervosas internas, que são mais amarelas e macias.
10. Coloque cuidadosamente um 8-0 sutura de náilon (ver Tabela de Materiais) através do epineuro da extremidade proximal do nervo, segurando cuidadosamente o epineuro com uma pinça e colocando a agulha entre o nervo e o epineuro com uma mordida de aproximadamente 0,5 mm. Puxar a sutura e dar uma mordida com a agulha por via subcutânea no final do túnel subcutâneo confeccionado no passo 3.7. Faça um nó, que irá transpor o nervo lateralmente para o túnel subcutâneo.
    NOTA: Se ambos os ramos plantares compartilham um epineuro comum, uma sutura deve ser suficiente. Se ambos os ramos plantares tiverem seu próprio epineuro, cada epineuro deve ser fixado individualmente. Evitar colocar a sutura através da pele; apenas consertá-lo subcutaneamente.
11. Coloque uma sutura mais espessa e de cor escura (de preferência uma sutura azul ou preta 4-0) até a extremidade nervosa fixada, não penetrando na pele. Certifique-se de que a sutura é visível do lado de fora da pele. Verifique se o nervo permanece no lugar depois de mover a pata e os músculos. Corte as extremidades da sutura com uma extremidade de sutura ligeiramente mais longa no 4-0 do que no 8-0 sutura.
12. Altere a ampliação do microscópio de volta para 6x. Fechar a pele com suturas intraepidérmicas utilizando o 8-0 sutura e limpeza suave da pele com NaCl 0,9% com um cotonete.

4. Tratamento pós-cirúrgico

1. Coloque o rato em uma gaiola limpa sob um papel toalha em uma posição confortável. Se a sala estiver fria, coloque uma almofada térmica sob uma parte da gaiola (apenas sob uma parte da gaiola, pois o animal deve ser capaz de escapar do calor quando necessário). Garanta fácil acesso a alimentos e água.
2. Não deixe o rato pós-cirúrgico sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. O rato pode ser devolvido à companhia de outros animais quando tiver se recuperado totalmente da anestesia após a cirurgia. Isso geralmente ocorre após 1 h e quando o rato exibe seu padrão de marcha e comportamento normais.
3. Em 24 h e 48 h após a cirurgia, administrar uma dose de 0,5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea (região abdominal) para tratar a dor pós-cirúrgica.

5. Teste de Von Frey da face plantar das patas traseiras

NOTA: O teste de Von Frey (passos 5 e 6) é realizado antes da cirurgia (para medição basal) e a partir de 3 dias após a cirurgia.

1. Coloque os ratos em gaiolas de fundo de arame de malha 1 semana antes da medição basal, ou 2 semanas antes da cirurgia, para garantir a aclimatação ao ambiente de teste.
2. Comece com as medidas basais pelo menos 1 semana antes da cirurgia. Certifique-se de que três medições basais independentes sejam realizadas em dias separados.
3. Verifique se os ratos estão calmos nas gaiolas de fundo com arame de malha. Aplicar uma série de monofilamentos de Von Frey com escala logarítmica perpendicular à superfície plantar da pata traseira.
   1. Para estimular o nervo sural (hipersensibilidade), aplique o monofilamento na lateral próxima à borda do cabelo. Evite tocar nas almofadas dos pés, pois estas são mais sensíveis.
   2. Para estimular o nervo tibial (hipossensibilidade), aplique o monofilamento no meio da superfície plantar da pata traseira. Se o monofilamento for aplicado na área mais medial, isso também pode estimular o nervo safeno, um ramo do nervo femoral (Figura 1). Evite tocar nas almofadas dos pés.
4. Comece com o monofilamento de 4 g. Aplique força suficiente no monofilamento para que o pelo fique dobrando e segure por 3 s e, em seguida, verifique as respostas do animal sobre o monofilamento. Uma resposta positiva é a retirada súbita da pata, o vacilo súbito, a lambida súbita da pata ou a vocalização. Em alguns casos, o rato se move e tenta encontrar/atacar o monofilamento.
5. Escolha o próximo monofilamento dependendo da resposta ao estímulo pelo método up-down²³. Por exemplo, se o rato responder, estimule em seguida com o monofilamento de 2 g; Se o rato não responder, estimule com o monofilamento de 6 g e assim por diante. No total, aplique de 5 a 10 estímulos dependendo da reação.

6. Teste de Von Frey no sítio do neuroma

1. Manusear os animais diariamente por um mínimo de 5-7 dias antes das medidas basais ou 2 semanas antes da cirurgia. Certifique-se de que os animais estão detidos como descrito no passo 6.2, para que estejam confortáveis com a posição.
2. Segure os ratos com o nariz apontado para a prega do cotovelo. Se o rato for segurado na mão direita, sua pata traseira esquerda deve ficar pendurada livremente entre o polegar direito e o indicador (primeiro espaço na web). Se o rato for segurado na mão esquerda, a pata traseira direita deve ficar pendurada livremente entre o polegar esquerdo e o indicador.
3. Comece com as medidas basais pelo menos 1 semana antes da cirurgia. Certifique-se de que três medições basais independentes sejam realizadas em dias separados.
4. Verifique se os ratos estão calmos e confortáveis enquanto estão sendo segurados. Na linha de base, coloque o monofilamento de 15 g suavemente sobre a superfície pré-tibial da pata traseira exposta. Após a cirurgia, colocar o monofilamento de 15 g sobre a sutura visível (por exemplo, no local do neuroma). Aplique força suficiente no monofilamento para que o cabelo fique dobrando e segure por 1 s.
   1. Registre a reação a cada estímulo. As opções de reação incluem nenhuma reação, retirada lenta, retirada rápida e vocalização. Registre a resposta como 0 pontos para nenhuma reação e um ponto para retirada lenta, retirada rápida ou vocalização.
5. Repetir cinco clusters de cinco aplicações do monofilamento, com 2-3 s entre cada aplicação e 2-3 min ou mais entre os cinco clusters. No total, cada pata traseira deve ter 25 aplicações do monofilamento com respostas registradas.

7. Recuperação de espécimes para histologia e preparo

NOTA: O exame histológico é realizado 12 semanas após a cirurgia inicial.

1. Induzir a anestesia e preparar os animais conforme descrito nos passos 2.2, 2.3 e 2.4.
2. Faça suavemente uma incisão de 2-3 cm usando um bisturi sobre a cicatriz que foi feita pela cirurgia inicial, mas tenha cuidado para não cortar muito profundamente, pois o nervo é colocado superficialmente.
3. Determinar a posição do neuroma, dissecar cuidadosamente o neuroma e o nervo livre do tecido cicatricial circundante e colocar o neuroma retirado no fixador. Para avaliar a morfologia do neuroma, o tecido é preferencialmente incluído longitudinalmente em parafina ou resina epóxi, como descrito por Tork et ^al.18.
4. Após a retirada do tecido, eutanasiar os ratos sob anestesia terminal (isoflurano a 5%) por punção cardíaca ou decapitação.
   NOTA: É aconselhável primeiro colher o neuroma antes de matar os ratos, porque então é mais fácil distinguir o neuroma de seu tecido circundante in vivo.

Resultados

A avaliação no sítio do neuroma mostrou aumento da sensibilidade à aplicação do monofilamento de von Frey 15 g. No início do estudo, os ratos tipicamente responderam a 10%-15% (± 13%) das 25 aplicações de um monofilamento de 15 g. A taxa de resposta aumentou para 45%-50% (± 24%) 1 semana após a cirurgia de TNT. No lado contralateral, o número de respostas após a cirurgia foi semelhante ao basal (Figura 2A). Cerca de 20% dos ratos não desenvolveram neuroma doloroso; a taxa de r...

Discussão

Etapas críticas do protocolo
O modelo TNT envolve cortar o nervo tibial e transpô-lo lateral e subcutaneamente para um local pré-tibial para permitir o teste de sensibilidade do neuroma, além de hiperalgesia plantar sobre o nervo sural. No modelo TNT, é fundamental que o local do neuroma seja visível para os pesquisadores. Portanto, uma cepa de rato albino é preferida porque as suturas subcutâneas são facilmente visíveis através da pele e a cor da sutura deve ser preferencialmente azul escu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aesthesio	Linton Instrumentation	514007 until 514015	0.6 g until 15 g monofilaments
Carprofen	Local Veterinary Pharmacy	n/a	The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution
Cotton swabs	Nobamed	974255
Electrocautery	Fine Science Tools	18010-00
Ethanol 70%	Interchema BV	400406
Ethilon 4.0	Johnson & Johnson	1854G	IMPORTANT: the color should be blue or black
Ethilon 8.0	Johnson & Johnson	BV130-5
Isoflo, isoflurane Zoetis	Dechra Veterinary Products	B506
Mesh bottom cages	StoeltingCo	57816 and 57824
Micro forceps	Fine Science Tools	11251-35
Micro needle holder	Fine Science Tools	12076-12
Micro scissors	Fine Science Tools	15019-10
Micro tweezers	Fine Science Tools	11254-20
NaCl 0.9%	Trademed	H7 1000-FRE
Needle holder	Fine Science Tools	12004-16
Ophthalmic ointment	Local Veterinary Pharmacy	n/a	The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scissors	Fine Science Tools	14001-12
Stereo surgical microscope	Leica	A60 F
Sterile sheet with hole	Evercare OneMed	1555-01
Surgical blade nr.15	Fine Science Tools	10015-00
Tweezers	Fine Science Tools	11617-12