Хирургическое и поведенческое тестирование в модели транспозиции нериномы большеберцовой кости у крыс

Резюме

Этот протокол описывает модель транспозиции невриномы большеберцовой кости, которая влечет за собой поражение большеберцового нерва с последующей транспозицией проксимального нервного конца в подкожное претибиальное или латеральное положение. Поведенческое тестирование боли при невриноме и подошвенной гипералгезии количественно оценивается с использованием монофиламентов фон Фрея.

Аннотация

Транспозиция невриномы большеберцовой кости (TNT) представляет собой модель крысы, в которой аллодиния в месте невриномы (большеберцовый нерв) может быть независимо оценена от аллодинии на подошвенной поверхности задней лапы, иннервируемой интактным икроножным нервом. Эта модель TNT подходит для тестирования методов лечения боли при невриноме, таких как потенциальное превосходство определенных хирургических методов лечения, которые уже используются в клинике, или для оценки новых лекарств и их влияния на оба метода боли у одного и того же животного. В этой модели дистальное поражение (нейротмезис) делается в большеберцовом нерве, а проксимальный нервный конец транспонируется и фиксируется подкожно и претибиально, чтобы можно было оценить участок невриномы с помощью мононити фон Фрея 15 г. Для оценки аллодинии над икроножным нервом монофиламенты фон Фрея можно использовать методом вверх-вниз на подошвенной латеральной области задней лапы. После перерезания большеберцового нерва механическая гиперчувствительность развивается в месте невриномы в течение 1 недели после операции и сохраняется, по крайней мере, до 12 недель после операции. Аллодиния на икроножной иннервированной подошвенной поверхности развивается в течение 3 недель после операции по сравнению с контралатеральной конечностью. На 12 неделе на проксимальном конце разорванного большеберцового нерва образуется невринома, о чем свидетельствует дисперсия и закрученность аксонов. Для хирургии модели TNT необходимо выполнить несколько критических (микро)хирургических шагов, и рекомендуется некоторая хирургическая практика под терминальной анестезией. По сравнению с другими моделями нейропатической боли, такими как модель спасенного повреждения нерва, аллодиния над участком невриномы может быть независимо протестирована на гиперчувствительность икроножного нерва в модели TNT. Тем не менее, сайт невриномы может быть протестирован только на крысах, а не на мышах. Советы и указания, представленные в этом протоколе, могут помочь исследовательским группам, работающим с болью, успешно внедрить модель TNT в своем учреждении.

Введение

Каждая рана, варьирующаяся от простых рваных ран до ампутации всей конечности, сопровождается различной степенью повреждения периферических нервов. Такое повреждение нерва может привести к образованию невриномы, дезорганизованной запутанности прорастающих нервных волокон. Невриномы становятся болезненными у 8-30% пациентов, серьезно влияя на качество их жизни 1,2,3,4,5. После ампутации конечности боль при невриноме развивается у 50% пациентов ^6,7,8. Зарегистрированные симптомы включают болезненность, спонтанную боль, аллодинию, гипералгезию и механическую или термическую гиперчувствительность в иннервируемой области⁹. При отсутствии адекватного лечения в течение 1 года боль при невриноме может перейти в состояние хронической боли, что приводит к высокому социальному бремени и связанным с этим медицинским расходам ^{10,11,12,13,14}. Из-за низкой эффективности современных фармакологических вмешательств боль при невриноме предпочтительно лечат хирургическим удалением болезненной невриномы, а нерв лечат различными хирургическими методами, как описано в литературе¹⁵. Важно отметить, что полное обезболивание встречается редко, боль часто усиливается с течением времени, и 40% пациентов не получают пользы от операции, что указывает на необходимость новых методов лечения ^1,16.

Стандартизированная модель боли в невриноме на крысах помогает понять механизмы, которые вызывают боль в невриноме, и может помочь определить новые методы лечения или оценить существующие, используемые в клинике. Модель транспозиции невриномы большеберцовой кости (TNT) была впервые описана Dorsi et al. в 2008 году¹⁷ и использовалась различными исследовательскими группами^18,19,20. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы иметь возможность тестировать различные методы лечения боли при невриноме. Преимущество модели по сравнению, например, с травмой избавленного нерва (SNI) модели²¹, заключается в том, что она позволяет тестировать аллодинию в месте невриномы. Это связано с тем, что модель включает в себя транспонирование проксимального нервного окончания большеберцового нерва в подкожное претибиальное положение, где его можно исследовать с помощью монофиламентов фон Фрея. Кроме того, аллодиния развивается на подошвенной поверхности задней лапы, иннервируемой интактным икроножным нервом, что может быть оценено независимо от боли при невриноме у того же животного. Это похоже на симптомы боли при невриноме у пациентов, у которых постоянная нейропатическая боль после удаления болезненной невриномы иногда вызвана соседними нервами²². Более того, аллодиния над разорванным нервом с невриномой - это другой метод боли, чем аллодиния над интактным соседним нервом. Таким образом, эта модель облегчает оценку влияния новых методов лечения как на аллодинию, присутствующую в месте невриномы, так и на более распространенную невропатическую боль, протестированную на подошвенной поверхности задней лапы. Поскольку операция, выполняемая для создания модели TNT, может быть сложной, в этой статье подробно описывается процедура поддержки исследователей, внедряющих модель в своем учреждении.

протокол

Это исследование было выполнено в соответствии с IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) и руководством по исследованиям на животных, номер проекта AVD1150020198824.

1. Базовые измерения фон Фрея

1. Перед операцией проведите базовые измерения в соответствии с процедурой тестирования фон Фрея, описанной ниже в разделе 5 и разделе 6.

2. Анестезия и подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование было проведено на 15 самцах крыс Sprague Dawley в возрасте 12 недель.

1. Анестезируйте животных индукцией 5% изофлурана и поддерживайте анестезию 2%-3% изофлураном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживающая терапия 2% изофлураном обычно приводит к достаточной анестезии и спонтанному дыханию без необходимости интубации трахеи или искусственной вентиляции легких.
2. Проверьте рефлексы животных, ущипнув лапу пинцетом. Прежде чем продолжить, убедитесь, что животное не реагирует. Побрейте операционное поле от колена до лодыжки электробритвой и нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость. Вводят 0,5 мг/кг обезболивающего карпрофена подкожно в область живота.
3. Положите анестезированную крысу на спину так, чтобы ее голова была влево или вправо, а нога, подлежащая операции, находилась рядом с хирургом. Экзовращайте нижнюю заднюю конечность так, чтобы медиальная лодыжка была обращена вверх. Поместите крысу под стереохирургический микроскоп с 6-кратным увеличением.
4. Продезинфицируйте выбритый участок тремя чередующимися раундами скраба на основе йода, а затем спиртом. Положите стерильную простыню с операционным отверстием на ногу, чтобы было видно только операционное поле. Убедитесь, что эти стерильные условия поддерживаются во время операции.

3. Хирургия

1. Поместите небольшой ватный тампон под лодыжку, чтобы операционное поле было горизонтальным. Найдите колено и аккуратно сделайте продольный разрез 1-2 см с помощью скальпеля по медиальной стороне задней лапы от середины голени до лодыжки. При необходимости вскрывайте кожу и подкожную клетчатку микроножницами, пока не станут видны мышечные слои.
2. Определите поверхностный сосудисто-нервный пучок как два или три белых и более толстую фиолетово-красную линию, иногда с небольшими ветвями, которые могут свободно перемещаться по мышечным слоям. С помощью электрокоагуляции (см. Таблицу материалов) коагулируют любое активное кровотечение или сочащееся в операционном поле. Будьте осторожны, чтобы не повредить сосудисто-нервный пучок.
3. Тупо рассекают, чтобы открыть фасцию между икроножными мышцами, чуть позади поверхностного сосудисто-нервного пучка 3,2. Между фасциями мышц может находиться большеберцовый нерв. Большеберцовый нерв примерно в три раза больше поверхностного нерва в сосудисто-нервном пучке. Используйте большеберцовую кость в качестве дополнительного ориентира (большеберцовый нерв лежит чуть позади большеберцовой кости).
4. Определите большеберцовый нерв и его раздвоение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бифуркация обычно видна более светлой линией в продольном направлении над нервом.
5. Осторожно рассеките большеберцовый нерв, освободив его от окружающих сосудистых пучков. Выполните рассечение, тупо перемещая большеберцовый нерв и разрезая открытую ткань, которая показывает некоторое растяжение при движении большеберцового нерва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если большеберцовый нерв прикреплен к пересекающимся венам после рассечения, эти вены могут быть коагулированы, чтобы обнажить весь большеберцовый нерв. Будьте осторожны, чтобы не коагулировать сам пучок большеберцовой кости.
6. Обнажайте большеберцовый нерв проксимально, пока он не исчезнет под пересекающимся мышечным слоем. В этот момент большеберцовый нерв, кажется, глубже погружается в заднюю лапу к колену. Обнажить большеберцовый нерв дистально до лодыжки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда большеберцовый нерв обнажается более дистально, количество пересекающихся коллагеновых волокон (т.е. волокон, перпендикулярных направлению нервных волокон) увеличивается. Эти коллагеновые волокна необходимо разрезать, чтобы обеспечить достаточную длину для транспонирования большеберцового нерва.
   1. Когда весь большеберцовый нерв обнажен, поместите мышечные слои обратно, чтобы избежать обезвоживания нерва. Если нерв обезвоживается (т.е. становится более жестким, тусклым и морщинистым), а покрытия мышечными слоями недостаточно, добавьте капли физиологического раствора, чтобы увлажнить его.
7. Используя тупой микрохирургический инструмент, предпочтительно держатель микроиглы, рассеките претибиальную кожу от подкожного мышечного слоя, чтобы сделать подкожный туннель. Для этого удерживают кожу вверх и проталкивают тупой кончик в ткань, параллельно коже. Убедитесь, что конец туннеля расположен претибиально или более латерально, чтобы обеспечить легкий доступ к области для тестирования невриномы.
8. Увеличьте изофлуран до 5%. Вернитесь к большеберцовому нерву и обнаживите его (т. е. вернитесь в место, описанное в шаге 3.6). Перережьте большеберцовый нерв (т.е. обе подошвенные ветви) на самом дистальном уровне возле лодыжки. Снижение изофлурана до нормального уровня 2%-3%.
9. Измените увеличение микроскопа на 10-кратное или 16-кратное. Определите эпиневрий большеберцового нерва, проксимальный разрезу, сделанному на шаге 3.8, или, в случае более проксимального раздвоения большеберцового нерва, определите эпиневрий как медиальной, так и латеральной подошвенной ветвей проксимальнее разреза на шаге 3.8.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эпиневрий белее и тверже по сравнению с нервными волокнами внутри, которые более желтые и мягкие.
10. Аккуратно поставьте 8-0 нейлоновый шов (см. Таблицу материалов) через эпиневрий проксимального нервного окончания, осторожно придерживая пинцетом эпиневрий и вставляя иглу между нервом и эпиневрием с прикусом примерно 0,5 мм. Протяните шов и прикусите иглой подкожно в конце подкожного туннеля, сделанного на шаге 3.7. Сделайте узел, который будет транспонировать нерв латерально в подкожный туннель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если обе подошвенные ветви имеют общий эпиневрий, одного шва должно быть достаточно. Если обе подошвенные ветви имеют свой эпиневрий, каждый эпиневрий следует фиксировать индивидуально. Избегайте наложения шва через кожу; Только зафиксируйте его подкожно.
11. Накладывают более толстый шов темного цвета (желательно синий или черный шов 4-0) вровень с фиксируемым нервным концом, не проникая в кожу. Убедитесь, что шов виден снаружи кожи. Проверьте, остается ли нерв на месте после движения лапы и мышц. Отрежьте концы швов чуть более длинным концом шва на 4-0, чем на 8-0 шов.
12. Измените увеличение микроскопа обратно на 6x. Закройте кожу внутриэпидермальными швами с помощью 8-0 Наложите швы и аккуратно очистите кожу 0,9% NaCl с помощью ватного тампона.

4. Послеоперационное лечение

1. Поместите крысу в чистую клетку под бумажное полотенце в удобном положении. Если в помещении холодно, поместите грелку под часть клетки (только под часть клетки, так как животное должно иметь возможность избежать тепла, когда это необходимо). Обеспечьте легкий доступ к пище и воде.
2. Не оставляйте послеоперационную крысу без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание достаточно для поддержания лежачего положения на грудине. Крысу можно вернуть в компанию других животных, когда она полностью оправится от наркоза после операции. Обычно это происходит через 1 час, когда крыса проявляет свою нормальную модель ходьбы и поведение.
3. Через 24 ч и 48 ч после операции вводят дозу 0,5 мг/кг карпрофена подкожно (абдоминальная область) для лечения послеоперационной боли.

5. Тест фон Фрея на подошвенную сторону задних лап

ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование фон Фрея (шаги 5 и 6) проводится до операции (для исходного измерения) и через 3 дня после операции.

1. Поместите крыс в клетки из сетчатой проволоки за 1 неделю до исходного измерения или за 2 недели до операции, чтобы обеспечить акклиматизацию к тестовой среде.
2. Начните с исходных показателей не менее чем за 1 неделю до операции. Убедитесь, что три независимых базовых измерения выполняются в разные дни.
3. Убедитесь, что крысы спокойны в сетчатых проволочных нижних клетках. Нанесите серию мононитей фон Фрея с логарифмической шкалой, перпендикулярной подошвенной поверхности задней лапы.
   1. Чтобы стимулировать икроножный нерв (гиперчувствительность), наложите мононить на боковую сторону близко к границе волоса. Не прикасайтесь к подушечкам ног, так как они более чувствительны.
   2. Для стимуляции большеберцового нерва (гипочувствительность) накладывают мононить на середину подошвенной поверхности задней лапы. Если мононить применяется в самой медиальной области, это может также стимулировать подкожный нерв, ветвь бедренного нерва (рис. 1). Не прикасайтесь к подушечкам ног.
4. Начните с 4 г мононити. Приложите достаточное усилие к монофиламенту, чтобы волосы сгибались, и удерживайте в течение 3 с, а затем проверьте реакцию животного на мононить. Положительным ответом является внезапное отдергивание лапы, внезапное вздрагивание, внезапное облизывание лап или вокализация. В некоторых случаях крыса двигается и пытается найти/атаковать мононить.
5. Выберите следующую мононить в зависимости от реакции на стимул с помощью метода²³ вверх-вниз. Например, если крыса реагирует, стимулируйте затем 2 г мононити; Если крыса не реагирует, стимулируют мононитью 6 г и так далее. Всего применяют 5-10 стимулов в зависимости от реакции.

6. Тестирование фон Фрея на месте невриномы

1. Обрабатывайте животных ежедневно в течение как минимум 5-7 дней до исходных мер или за 2 недели до операции. Убедитесь, что животные держатся, как описано в шаге 6.2, чтобы им было удобно в этом положении.
2. Держите крыс носом, направленным к локтевому сгибу. Если крысу держат в правой руке, ее левая задняя лапа должна свободно висеть между большим и указательным пальцами правой руки (первое пространство паутины). Если крысу держат в левой руке, ее правая задняя лапа должна свободно висеть между большим и указательным пальцами левой руки.
3. Начните с исходных показателей не менее чем за 1 неделю до операции. Убедитесь, что три независимых базовых измерения выполняются в разные дни.
4. Убедитесь, что крысы спокойны и чувствуют себя комфортно во время удержания. В начале исследования аккуратно положите 15 г мононити на пребербиальную поверхность обнаженной задней лапы. После операции поместите мононить весом 15 г на видимый шов (например, в месте расположения невриномы). Приложите достаточное усилие к монофиламенту, чтобы волосы сгибались, и удерживайте в течение 1 с.
   1. Записывайте реакцию на каждый раздражитель. Варианты реакции включают отсутствие реакции, медленный уход, быстрый вывод и вокализацию. Запишите ответ как 0 баллов за отсутствие реакции и один балл за медленный уход, быстрый вывод или вокализацию.
5. Повторите пять кластеров по пять применений мононити, с 2-3 с между каждым нанесением и 2-3 мин или более между пятью кластерами. В общей сложности каждая задняя лапа должна иметь 25 применений мононити с записанными ответами.

7. Забор образцов для гистологии и подготовки

ПРИМЕЧАНИЕ: Гистологическое исследование проводится через 12 недель после первоначальной операции.

1. Индуцируют анестезию и подготавливают животных, как описано в шагах 2.2, 2.3 и 2.4.
2. Аккуратно сделайте разрез в 2-3 см с помощью скальпеля над шрамом, который был сделан во время первоначальной операции, но будьте осторожны, чтобы не разрезать слишком глубоко, так как нерв расположен поверхностно.
3. Определите положение невриномы, тщательно рассеките невриному и нерв, свободные от окружающей рубцовой ткани, и поместите собранную невриному в фиксатор. Для оценки морфологии невриномы ткань предпочтительно продольно встраивают в парафин или эпоксидную смолу, как описано Tork et ^al.18.
4. После сбора ткани усыпьте крыс под терминальной анестезией (5% изофлурана) с помощью пункции сердца или обезглавливания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала собрать невриному перед убийством крыс, потому что тогда легче отличить невриному от окружающих ее тканей in vivo.

Результаты

Оценка в месте невриномы показала повышенную чувствительность к применению монофиламента фон Фрея 15 г. В начале исследования крысы обычно реагировали на 10-15% (± 13%) из 25 применений 15-граммовой мононити. Частота ответа увеличилась до 45-50% (± 24%) через 1 неделю после операции TNT. На контралате?...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Модель TNT включает в себя разрезание большеберцового нерва и транспонирование его латерально и подкожно в претибиальное расположение, чтобы обеспечить тестирование чувствительности невриномы в дополнение к подошвенной гипералгезии над икроно...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aesthesio	Linton Instrumentation	514007 until 514015	0.6 g until 15 g monofilaments
Carprofen	Local Veterinary Pharmacy	n/a	The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution
Cotton swabs	Nobamed	974255
Electrocautery	Fine Science Tools	18010-00
Ethanol 70%	Interchema BV	400406
Ethilon 4.0	Johnson & Johnson	1854G	IMPORTANT: the color should be blue or black
Ethilon 8.0	Johnson & Johnson	BV130-5
Isoflo, isoflurane Zoetis	Dechra Veterinary Products	B506
Mesh bottom cages	StoeltingCo	57816 and 57824
Micro forceps	Fine Science Tools	11251-35
Micro needle holder	Fine Science Tools	12076-12
Micro scissors	Fine Science Tools	15019-10
Micro tweezers	Fine Science Tools	11254-20
NaCl 0.9%	Trademed	H7 1000-FRE
Needle holder	Fine Science Tools	12004-16
Ophthalmic ointment	Local Veterinary Pharmacy	n/a	The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scissors	Fine Science Tools	14001-12
Stereo surgical microscope	Leica	A60 F
Sterile sheet with hole	Evercare OneMed	1555-01
Surgical blade nr.15	Fine Science Tools	10015-00
Tweezers	Fine Science Tools	11617-12