Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, In Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili

Özet

Arabidopsis thaliana'da polen hidrasyon profillerini ölçmek için geliştirilmiş bir yöntem burada açıklanmaktadır. Yeni yöntem daha yüksek çözünürlük sunar, invaziv değildir ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Protokol, tozlaşmanın erken aşamalarını düzenleyen süreçlerin daha ince bir diseksiyonu için yeni bir aracı temsil etmektedir.

Özet

Çiçekli bitkilerde cinsel üreme, polen tanesi ile etkileşime giren ortaklar arasında moleküler bir diyaloğun kurulduğu stigmatik yüzey arasındaki ilk etkileşimi gerektirir. Bir dizi tür üzerinde yapılan çalışmalar, bir dizi moleküler kontrol noktasının, yalnızca uyumlu, genellikle intraspesifik polenlerin döllenmeyi etkilemede başarılı olmasını sağlamak için polen-damgalama etkileşimini düzenlediğini ortaya koymuştur. Arabidopsis thaliana model bitkisi gibi 'kuru damgalamaya' sahip türlerde, tozlaşma sonrası ilk prezigotik uyumluluk kontrol noktası polen hidrasyonunun kurulmasıdır.

Bu tozlaşma aşaması sıkı bir şekilde düzenlenir, böylece polen tanesinden gelen sinyaller damgalamadan suyun salınımını sağlar, böylece polen hidrasyonuna izin verir. Polen hidrasyonunu zaman içinde doğru bir şekilde ölçme ve izleme yeteneği, üremedeki bu kritik adımın düzenlenmesini anlamaya yönelik deneylerin tasarımının anahtarıdır. Yayınlanan protokoller sıklıkla ana bitkiden eksize edilmiş, sıvı veya katı ortamlarda tutulan ve toplu olarak tozlaşan çiçekleri kullanır.

Bu yazıda, bireysel A. thaliana polen tanelerinin yüksek çözünürlükte dakika dakika hidrasyon takibine izin veren invaziv olmayan, in vivo tozlaşma biyotahlili açıklanmaktadır. Tahlil oldukça tekrarlanabilir, polen hidrasyon profillerinin çok ince varyasyonlarını tespit edebilir ve bu nedenle tozlaşmayı düzenleyen yolları etkileyen mutantların analizi için uygundur. Protokol, toplu tozlaşmalar için tarif edilenlerden daha uzun olmasına rağmen, sağladığı hassasiyet ve tekrarlanabilirlik, in vivo doğası ile birlikte, tozlaşma fenotiplerinin ayrıntılı diseksiyonu için idealdir.

Giriş

Anjiyospermlerde başarılı cinsel üreme tipik olarak, intraspesifik polen tanelerinin anterden stigmaya, bireylerin içinde veya arasında (yani tozlaşma) aktarılmasına dayanır. Polen tanelerinin alıcı bir çiçeğe bu transferine genellikle tozlayıcılar veya abiyotik faktörler aracılık eder; Bu nedenle, bu aynı zamanda sıklıkla doğal koşullar altında heterospesifik polenlerin birikmesine neden olur. Birkaç istisna dışında, heterospesifik polen tarafından tozlaşmanın ilerlemesi evrimsel olarak dezavantajlıdır, kayıp çiftleşme fırsatları yoluyla üreme uygunluğunu azaltır, sonuçta ortaya çıkan melez döllerin çoğu ya uygun şekilde gelişemez ya da steril olur¹. Böylece, 'uyumsuz' heterospesifik polen² ile tozlaşmayı engellemek için mekanizmalar gelişmiştir. Bu nedenle, uyumlu polenlerin hızlı bir şekilde tanınması, birçok çiçekli bitkide cinsel üremenin erken aşamalarında tartışmasız en önemli süreçtir.

Stigmaların 'kuru' tipte olduğu Brassicaceae familyasında, bir dizi moleküler kontrol noktası, tozlaşmayı düzenleyen üreme sürecinde birçok aşamada hareket eder, böylece yalnızca uyumlu polenler başarılı olur. Polen hidrasyonu en önemli kontrol noktalarından biridir (Şekil 1), çünkü hidratlanamayan polenler bir polen tüpü üretmek için ilerleyemez ve daha sonra dişi gametofitlere sperm veremez. Sıklıkla, uyumsuz taneler bu ilk tozlaşma kontrol noktasını geçemez ve bu nedenle damgalama suyuna erişemezler³. Brassicaceae familyasının üyeleri arasında, polenlerin tanınması hızlı bir şekilde gerçekleşir ve polen tanesinin pistil ^4,5'e bağlanmasından birkaç dakika sonra uyumluluk sağlanır. Son yıllarda çok ilerleme kaydedildi ve şimdi kilit tozlaşma kontrol noktalarını düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamaya başlıyoruz.

Şekil 1: Uyumlu tozlaşma sırasındaki önemli olaylara genel bakış. Polen hidrasyonu ve polen tüpü çimlenmesi gibi bu aşamalar, uyumlu tozlaşmayı etkilemek için başarılı bir şekilde yönlendirilmesi gereken tozlaşma 'kontrol noktaları'dır. Diyagram, Brassicaceae familyası ^2,20'den türlere özgü olan 'kuru' tip bir damgalamayı temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

'Kendini' polenin tanındığı ve reddedildiği Brassica öz-uyumsuzluk (SI) sistemi üzerine yapılan öncü araştırmalar, Brassicaceae ^{6,7,8,9,10'da} polen-damgalama tanıma paradigmasını oluşturmuştur. Brassica ve akrabalarındaki SI, polen yüzeyinde ve stigmatik plazma zarında bulunan ve etkileşim üzerine polen reddine yol açan 'tanıma' proteinleri aracılık eder. SI polen reddi, uyumlu polen algısı ile tamamen aktive edildiğinde, stigma tarafından hedeflenen sekresyona yol açan ve böylece polen hidrasyonunu tetikleyen bazal polen-stigma uyumluluk sisteminin bozulmasıyla çalışır (polen uyumluluk mekanizmasının gözden geçirilmesi için bkz.^11,12). SI örneğinde, polen kaynaklı ligand küçük bir sistein bakımından zengin protein, S-lokus sistein bakımından zengin (SCR / SP11) ve stigmatik reseptör S-lokus reseptör kinazdır (SRK).

Son zamanlarda, Arabidopsis thaliana'da, başka bir küçük sistein bakımından zengin polen kaynaklı protein grubu, polen kaplama proteini sınıf Bs (PCP-Bs'de), polen hidrasyonunun aktivasyonu yoluyla polen kabulünün önemli düzenleyicileri olduğu bulunmuştur¹³. AtPCP-Bs'nin stigmatik reseptörleri ve aşağı akış düzenleyici yolunun yönleri de yakın zamanda^{tanımlanmıştır 14,15}. İlginçtir ki, polen hidrasyonunun potansiyel polen kaynaklı ve stigmatik sinyal aracılarını kodlayan genlerin mutasyonel çalışmaları (PCP-B'lerde dahil), polen hidrasyon kontrol noktasına tam bir bloğa sahip bitkiler üretememiştir. Bu, polen hidrasyonunun düzenlenmesinde diğer birçok henüz keşfedilmemiş faktörün rol oynadığını kuvvetle göstermektedir. İlk olarak Wang ve ^ark.13 tarafından tanımlanan yönteme dayanarak, burada aday mutant A. thaliana hatlarındaki ince polen hidrasyon kusurlarının tanımlanması için uygun, geliştirilmiş yüksek çözünürlüklü in vivo biyotahlili tarif ediyoruz.

Protokol

1. Bitki büyümesi ve çiçeklerin hazırlanması

1. A. thaliana tohumlarını 4 ° C'de 3 gün boyunca% 0.1 agaroz veya steril suda veya -20 ° C'de 16-24 saat kuru tohum olarak tabakalaştırın (uNASC, kişisel iletişim).
2. Tabakalaşmış tohumları kompost saksılarına aktarın ve çevre kontrollü bir büyüme odasına yerleştirin. Floresan tüpler (130 μmol ^{m-2 s-1}) tarafından sağlanan 16:8 saat, ışık: karanlık fotoperiyot ile bitkileri çoğaltın. Sıcaklığı yaklaşık %40 bağıl nem ile 21 ± 2 °C'de tutun.
3. Polen donör ve alıcı bitkilerin, diğer uygun 'kontrol' bitki hatlarıyla birlikte, senkronize çiçeklenmeyi sağlamak için birlikte ekildiğinden emin olun. Çiçeklenme iyice kurulana kadar bitkileri yaklaşık 6 hafta boyunca yayın.
4. Emaskülasyon için biyotahlilin yapılmasından 1 gün önce polen alıcı bitki üzerinde 12. aşama çiçek tomurcuklarını seçin 16,17-bunlar çiçek açılımını ve anter ayrışmasını tamamlayacak açılmamış çiçek tomurcuklarıdır ertesi gün ¹⁸.
   NOT: Ana çiçeklenme döneminde üretilen ilk üç çiçekten kaçının, çünkü bunlar tipik olarak olağandışı üreme davranışı sergiler. Çalışma için mevcut ve uygunsa, anterlerin 19'u olgunlaştıramadığı A. thaliana (katılım Col-0) pA9-barnaz hattı gibi bir erkek steril bitki hattı kullanın.
5. Polen alıcısının çiçeklerini iğdiş etmek için, bitkiyi saksısına, yanına yerleştirin. Bitki sapını, iğdiş edilecek çiçeklere yakın bölgede, stereo diseksiyon mikroskobu altında bulunan bir cam slayta bantlayın.
6. Bir çift ince uçlu forseps kullanarak, çiçek tomurcuğunu dikkatlice açın ve tüm çiçek yapraklarını ve anterlerini çıkarın. Pistilin zarar görmediğinden ve damgalamanın kirletici polen içermediğinden emin olun.
   NOT: Erkek steril bitki hatları iğdiş etme gerektirmez.
7. Bitkileri büyüme odasına geri döndürün ve iğdiş edilmiş çiçeklerin diğer bitkilerle veya yabancı cisimlerle temas etmediğinden emin olun.

2. Polen hidrasyon tahlili-ham veri toplama

1. Ertesi sabah, bitkileri büyüme odasından çıkarın. Polen alıcı bitkiyi yan tarafına koyun ve çiçeği ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin (Şekil 2), böylece damgalama açıkça görüntülenebilir.
2. Maskeleme bandı şeritleri kullanarak sapı bir cam slayda hareketsiz hale getirerek görüntülenecek çiçeğin konumunu sabitleyin. Sıcaklığı 18 °C ile 25 °C arasında ve bağıl nemi %60'ın altında tutun.
   NOT: pA9-barnaz erkek steril bitki hattı için, tahlilin çiçeklerin açıldığı ve yaprakların görüş alanını engellemediği sabah yapılması en uygunudur.
3. Ardından, polen donörü bitkisinden sağlıklı ve taze açılmış bir çiçeği çıkarın. Diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve anterlere hafifçe dokunarak temiz ince uçlu forsepslerin ucunda birkaç polen tanesi toplayın (Şekil 3A). Kısa bir çubuğa bantlanmış bir kirpik de polen toplamak ve aktarmak için etkili bir araçtır (Şekil 3C).
4. Forsepslerin ucunda tek katmanlı bir polen taneleri oluşana kadar, polen tanelerinin toplandığı çiçeklerin yapraklarına hafifçe dokunarak fazla polenleri forsepslerden çıkarın.
   NOT: İnce uçlu forsepslerin ucundaki tek katmanlı polen taneleri, sonraki adımlarda tek tane transferini önemli ölçüde kolaylaştıracaktır. Bu teknikle forseps üzerinde tek bir polen tanesi elde etmek de mümkündür (Ek Video S1).
5. Polen alıcı tesise geri dönün ve düşük güçlü bir objektif lens kullanarak (örneğin, 10x objektif lens; Şekil 3B), ters çevrilmiş mikroskobu tozlaşacak damgalamaya odaklayın.
6. Forsepsleri forsepslerin kolları arasındaki açıklık boyunca tutarak (Şekil 4), tozlaşmamış ('bakire') stigmatik bir papilla hücresine dikkatlice yaklaşın.
   NOT: Forsepsleri tutmanın bu yönteminin el becerisine yardımcı olduğunu ve el sıkışmanın etkisini azalttığını bulduk. Bir mikromanipülatör, daha az deneyimli olan veya tek bir polen tanesini elle tam olarak uygulamakta zorluk çeken kullanıcılar için kullanılabilir.
7. Stigmaya transfer için forseps üzerinde uygun şekilde yerleştirilmiş bir polen tanesi seçin. Seçilen polen tanesi yüzeyiyle hafif temas edene kadar tozlaşmamış stigmatik papilla hücresine yaklaşmaya devam edin. Forsepsleri yavaşça geri çekin ve polen bağlanmasını onaylayın (Şekil 5).
   NOT: Ek Video S1 ve Ek Video S2, forsepslerde bulunan hem tek hem de çoklu polen taneleri ile bu adımı göstermektedir.
8. Polen tanesinin, ekvator ekseni açıkça görülebilecek ve keskin bir şekilde odaklanacak şekilde yönlendirildiğinden emin olun. Hemen daha yüksek güçlü bir objektif lense (örneğin, 20x) geçin ve polen tanesinin görüntüsünü yakalayın. Bu ilk görüntü T = 0'dır. Toplam 10 dakika boyunca 1 dakikalık aralıklarla daha fazla görüntü yakalamaya devam edin.
9. Polen tanesi veya damgalamadaki küçük hareketlere uyum sağlamak için odağı gerektiği gibi ayarlayın. Deneysel kopyalar arasında gelecekteki karşılaştırmalara izin vermek için odanın ortam sıcaklığını ve bağıl nemini her 2 dakikada bir kaydedin.
10. Tüm görüntüler yakalandıktan sonra, bunları üreticinin tescilli biçimi veya TIFF'ler gibi kayıpsız bir biçimde kaydedin.
    NOT: Örneklenen polen tanesi başına 11 görüntü olacaktır (Ek Şekil S1). Çoğu tescilli görüntü yakalama yazılımındaki otomatik/manuel hızlandırılmış çekim ayarları, her zaman serisinin organizasyonunu kolaylaştırmak için kullanışlı özelliklerdir.
11. Ek polen taneleri için 2.4 ile 2.9 arasındaki adımları tekrarlayın. Neredeyse eşdeğer sayıda kontrol (vahşi tip [WT]) ve deneysel tozlaşmalar için veri edinin.

Şekil 2: Polen hidrasyon biyotahlili için kullanılan ekipman kurulumu. Bu örnekte, bir pA9-barnaz erkek steril bitki hattı polen alıcısıydı. Bitki, tenceresinin içinde, yan tarafına yerleştirildi ve sap, mikroskop sahnesine yerleştirilmiş bir cam slayta bantlandı. Mekanik stresi azaltmak ve tesisin konumlandırılmasına yardımcı olmak için, bitki saksısını desteklemek için ayarlanabilir bir platform kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Polen donör çiçeğinden polen tanelerinin toplanması. Görüntüler (A) ince uçlu forseps ve (C) bir kirpik parçasının kullanımını göstermektedir. Polen kümeleri (kırmızı ok), tek katmanlı bir polen tanesi elde edilene kadar (yeşil ok) donör çiçeklerinin yapraklarına hafifçe dokunarak çıkarılmalıdır. (B) Polen hidrasyon biyotahlili için uygun gelişim aşamasına ulaşmış tozlaşmamış bir A. thaliana (Col-0) pA9-barnaz erkek steril çizgi stigmasının yüksek çözünürlüklü görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm (B). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Polenleri alıcı damgasına aktarırken forseps tutma yöntemi. (A) Forsepsleri tutmak için yanlış yönlendirme; (B) Forsepsleri tutmak için doğru oryantasyon. Forsepslerin bu konfigürasyonda yana doğru tutulması, başparmağın forsepsin kolları arasındaki konumu ile belirtildiği gibi, polen tanelerinin tozlaşmamış stigmatik papillalara transferini kolaylaştırmak için daha fazla stabilite sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Tek bir polen tanesinin bir çift forsepsin ucundan, bir pA9-barnaz erkek steril bitkisinin tozlaşmamış ('bakire') stigmatik papilla hücresine aktarılması. (A) Papilla hücresine karşı dikkatli yaklaşım. (B) Uygun şekilde yerleştirilmiş bir polen tanesinin (mavi ok) papilla hücresine (turuncu ok) bağlanması. (C) Forsepslerin çekilmesi ve polen ekinin görsel olarak doğrulanması (mor ok). A-C panelleri 10x objektif lensle (10,5 mm çalışma mesafesi; 0,25 sayısal diyafram açıklığı) görüntülenmiştir ve Ek Video S1'de sunulan video klipten türetilen anlık görüntülerdir. (D) Bir zaman serisinde görüntü yakalamanın başlatılması için 20x objektif lense (2,1 mm çalışma mesafesi; 0,5 sayısal diyafram açıklığı) geçiş. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Polen hidrasyon tahlili-ölçümleri

1. Polen hidrasyon oranını, polen tanesinin (yani ekvator yarıçapının) yarı minör ekseninin (Şekil 6) uzunluğunun zaman içindeki değişimi olarak tanımlayın ve bunu yüzde değişim olarak sunun (denklem [1]):
   (1)
2. Görüntü analiz yazılımını kullanarak, deney serisindeki her polen tanesi için yarı minör eksen değerlerini kaydedin.
   NOT: Bu ölçüm seçeneğinin adı, 'Döndürülmüş Elips' veya '5 noktalı elips' gibi yazılıma bağımlıdır.
3. Ölçülecek diğer tüm polen taneleri için 3.1-3.2 arasındaki adımları tekrarlayın. Tutarlılık için, veri kümelerindeki tüm ölçümler için 'polen sınırını' tanımlamak üzere aynı derecede dijital yakınlaştırma ve aynı yaklaşımı uygulayın.
4. Bir zaman serisi için tüm ölçümler tamamlandıktan sonra, her görüntü yığınının ham yarı ikincil eksen değerlerini bir elektronik tabloya dışa aktarın ve verileri görüntü yığını başına sütunlar halinde sunun. Her bitki hattı için analize en az 15 hidratlanmış polen tanesinden elde edilen verilerin dahil edilmesini sağlayın (Ek Tablo S1).
5. Az sayıda polen tanesinin beklenenden çok daha yavaş hidratlanması veya hidratlanması alışılmadık bir durum değildir. Bu 'dud' taneleri, tahıl ve papilla hücresi arasındaki zayıf temasın sonucu olabilir veya polen canlılığı ile ilgili olabilir. Deneysel tasarımlarında gerekli olmadıkça bunları arayın ve veri kümesinden hariç tutun.
6. Tesis hattı başına her zaman noktası için ortalama değerleri hesaplayın. Her zaman noktasında WT ve mutant hatlarından hidrasyon verilerinin istatistiksel analizi için eşlenmemiş t-testleri ve tek yönlü ANOVA kullanın. WT ve mutant çizgiler arasındaki araçların birden fazla zaman noktasında eşzamanlı olarak karşılaştırılması için çoklu t-testi kullanın.
   NOT: XY grafikleri, karşılaştırılan bitki hatları arasındaki polen hidrasyonunun genel eğilimini görselleştirmek için de çok yararlıdır.

Şekil 6: A. thaliana'nın stigmatik bir papilla hücresi üzerinde nemlenen WT polen tanesi (Col-0; pA9-barnaz erkek steril hattı). (A) Zaman noktası sıfır, 0 (0 MAP) ve (B) 10 MAP. Polen tanesinin etrafındaki kırmızı daire, görüntü analiz yazılımı kullanılarak operatör tarafından tanımlanan ve çizilen "polen sınırı" dır. Polenlerin içindeki yeşil ve koyu kırmızı çizgiler sırasıyla yarı majör ve yarı minör eksenleri temsil eder. Yarı minör eksenin uzunluğu, polen hidrasyon derecesini hesaplamak için kullanılır. Bu veri kümesinin tam zamanlı serileri Ek Şekil S1'de bulunabilir. Görüntü 20x objektif lensle (2,1 mm çalışma mesafesi; 0,5 sayısal diyafram açıklığı) çekilmiştir. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: MAP = min-after-pollination. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Çiçekli bitkiler için, cinsel üremenin çok erken aşamaları tartışmasız en önemlisidir. Polen-stigma etkileşimi düzeyinde, etkileşime giren ortakların 'uyumluluğunu' belirleyen moleküler kararlar alınır. Bu tür kararlar, doğru bir şekilde verilirse, üreme uygunluğunu etkileyebilecek kaynakların israfını önler²¹. Bu nedenle, sadece uyumlu polenlerin döllenmeyi etkilemesine izin vermek, iyi adapte olmuş genotiplerin korunmasının ve dolayısıyla türlerin evrimsel başarısının önemli bir bileşenidir. Model bitki A. thaliana ile yapılan araştırmalar, bu süreç hakkındaki anlayışımızı derinleştirmede son derece değerli olmuştur. Son birkaç on yılda yapılan bir dizi çalışma, polen katında, polenlerin hidrasyonuna izin vermek için damgalama suyuna eriştiği ilk uyumluluk 'kontrol noktasında' hareket eden faktörlerin varlığını ortaya koymuştur¹³. Polen-damgalama uyumluluğunu düzenleyen mekanizmalara ilişkin bu ilk görüşlere rağmen, bu süreci anlamamızda hala birçok boşluk var. Bugüne kadar, polen hidrasyonunu etkilediği bilinen polen kaynaklı ligandların veya stigmatik reseptörlerin hiçbir mutantı, diğer keşfedilmemiş polen hidrasyon belirleyicilerinin varlığını düşündüren uyumlu tozlaşmayı tamamen engelleyemez. İlgilenilen fenotipi kolayca gözlemleyebilerek, burada açıklanan polen hidrasyon biyotahlili, tozlaşmayı düzenleyen potansiyel mutantları incelemek için en basit tekniklerden biridir.

Polen hidrasyonunu ölçmek için mevcut metodolojiler genellikle toplu tozlaşmaları kullanır ve daha az zaman noktası 14,22,23 bildirir ve bu nedenle önemli ince hidrasyon profili fenotiplerini kaçırabilir. Örneğin, Wang ve ^ark.13 tarafından yapılan çalışma, laboratuarımızdaki diğer polen kaplama protein mutantları üzerindeki çalışmalarla birlikte (yayınlanmamış gözlemler), mutantlar arasındaki hidrasyon profillerinde ilginç farklılıklar ortaya koymuştur. Bu tür ince farklılıklar, uyumlu tozlaşmanın altında yatan düzenleyici mekanizmalara dair önemli ipuçları tutabilir.

Burada açıklanan yöntem, veri kümelerindeki varyasyonu azaltmak için metodolojik hassasiyete vurgu yaparak, mutant ve WT bitki hatları arasında nispeten az sayıda ölçüm elde edilmesine odaklanmaktadır. Bu yöntem yüksek oranda tekrarlanabilir olsa da ( Şekil 7'de gösterildiği gibi), sıcaklık ve nemin yeterince kontrol edildiğini varsayarsak, varyasyon potansiyelini daha da azaltmak için aynı gün içinde neredeyse eşit sayıda WT ve mutant polen için hidrasyon verilerinin toplanması önemlidir. Veriler daha sonra gerekirse farklı günlerde bir araya getirilebilir. Ek olarak, uygun WT kontrol tesislerinin seçilmesi, hidrasyon sonuçlarının doğru yorumlanması için hayati öneme sahiptir. Polen alıcısı için, hem WT kontrolünü hem de mutant polen tanelerini almak için aynı bitki hattı kullanılmalıdır.

Örneğin, video protokolünde de yer alan pA9-barnaz erkek steril bitki hattını, T-DNA polen mutant hatlarını (Şekil 8'de açıklanan 'KD' mutantı gibi) araştırırken hem WT (kontrol) hem de mutant (deneysel) polen alıcısı olarak kullanıyoruz. Böyle bir erkek steril hattından gelen ve iğdiş edilmesi gerekmeyen verilerin, manuel olarak iğdiş edilmiş bir kontrol hattından toplananlarla karıştırılmasından kaçınılmalıdır, çünkü bu damgalamalar muhtemelen farklı davranacaktır. Benzer şekilde, iğdiş edilmiş mutant çizgiler, mümkün olduğunda iğdiş edilmiş bir WT (kontrol) hattı ile birlikte kullanılmalıdır. Aynı dikkat, incelenen bitkilerin genetik arka planı göz önüne alındığında da uygulanmalıdır. En popüler T-DNA mutant koleksiyonları Col-0 arka planında üretilirken, Institut national de la Recherche Agronomique'in (INRA) FLAG koleksiyonu gibi diğerleri Wassilewskija (WS) genetik arka planında^{mevcuttur 24,25}. Bu gibi durumlarda, ilgili ekotipin WT tesis hatlarının kontrol olarak kullanılması tavsiye edilir.

Burada polen-stigma etkileşiminin ilk 10 dakikasında polen hidrasyonuna odaklanmış olsak da, bu yöntem daha uzun bir zaman dilimini kapsayan hidrasyon profillerini kapsayacak şekilde uyarlanabilir. Protokolün önemli bir özelliği, çiçeklerin ana bitki akımına bağlı kalmasıdır yayınlanmış protokoller tipik olarak pistilin eksizyonunu ve deney süresi boyunca dokuyu sürdürmek için ortama yerleştirilmesini gerektirir^14,18,26. Böyle bir yarı in vivo yaklaşımın polen hidrasyonunu etkilediğini veya gerçekten de bu sürecin in vivo düzenlemesini değiştirdiğini gösteren doğrudan bir kanıt olmamasına rağmen, çiçeklerin ana bitkiden eksizyonunun tozlaşmayı etkileyebileceği düşünülebilir. Böylece, bu protokol, bitkinin yapısal bütünlüğünün korunduğu polen-stigma etkileşiminin incelenmesi için gerçek bir in vivo ortam sağlar.

Tek polen tanelerinin 'bakire' stigmatik papillalara transferi, muhtemelen bu protokolde açıklanan en zorlu işlemlerden biridir. Polen taneleri kümelerini yanlışlıkla aktarmak nadir değildir. Bununla birlikte, bunun meydana gelme şansı, forsepslerde sadece tek katmanlı bir polen bulunmasının sağlanmasıyla büyük ölçüde azaltılabilir (Şekil 3A) (veya hatta sadece tek bir polen tanesi; Şekil 5) ve/veya zaten yönlendirilmiş polen tanelerini kullanarak, forsepsin ucundaki diğerlerinden 'çıkıntı yapacak' şekilde. Deneyimli bir operatörün, tek bir polenin stigmatik bir papilla hücresine transferini yaklaşık 3 dakika içinde başarıyla tamamlayabildiğini ve 1 saatlik bir süre boyunca beş polen tanesine kadar veri kaydedebildiğini bulduk. Böylece, 2-4 günlük bir süre boyunca, incelenen tesis hatlarının anlamlı istatistiksel analizi için yeterli veri toplanabilir.

İnsan hatası, bu protokolü kullanan çalışmalardan elde edilen veri kümelerinin analizinde potansiyel olarak en büyük varyasyon kaynağıdır. Örneğin, görüntü analizi sırasında 'polen sınırı' tanımı, bireysel araştırmacının kararına bağlıdır. Bu nedenle, farklı araştırmacılar tarafından yapılan ölçümlerin, aynı veri kümesinde bile, varyasyon üretme potansiyeli vardır. Mümkün olan her yerde, örnekleme hatalarını en aza indirmek için ölçümleri tek bir araştırmacı yapmalıdır. Ek olarak, WT ve mutant veri kümelerinin analizinin aynı operatör tarafından birleştirilmesi, 'polen sınırı' ve operatörler arası varyasyonun potansiyel olarak öznel tanımını reddeder.

Sonuç olarak, model organizma A. thaliana'daki polen hidrasyon profillerini ölçmek için sofistike ancak doğru bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokolü kullanarak, A. thaliana için son derece tutarlı polen hidrasyon verilerinin kolayca elde edilebileceğini gösterdik. Farklı günlerde elde edilen WT tozlaşmaları için üç bağımsız veri grubu, tüm zaman noktalarında% <3'lük tutarlı küçük sapmalar göstermiştir (Şekil 7 ve Ek Tablo S1). Burada sunulan biyotahlil, mevcut protokollerin çoğundan biraz daha karmaşık olmasına rağmen, üretilen verilerin çözünürlüğü, uyumlu tozlaşmayı düzenleyen yolları etkileyen yeni mutantların tanımlanması ve karakterizasyonu için üstün ve uygundur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
A9-barnase line	University of Bath	Courtsey of Prof. Rod Scott	Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0
Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm	Fisher	Dumont 500342	Tweezer uses for transfer of pollen grain
GraphPad Prsim (version 8.0.2)	Dotmatics	Prism	Comprehensive data analysis, graphing and statistics software
JMP (version 17)	JMP Statistical Discovery LLC	JMP 17	Statistical analysis software
Levington F2S seed & modular compost (with sand)	Levington	LEV75F2SMS	General-purpose compost for plant growth
Micromanipulator	Singer instrument Co. LTD.	Singer Micromanipulator	Micromanipulator to aid transfer of pollen grain
Nikon Digit sight DS-U1	Nikon	DS-U1	Microscope camera (coupletd to SMZ1500)
Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	TE2000-S	Inverted microscope
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon	SMZ1500	Stereomicroscope
Nikon DS-Fi3 microscope camera	Nikon	DS-Fi3	Microscope camera (coupletd to TE2000-S)
Nikon NIS-Elements Basic Research	Nikon	NIS-Elements BR	Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3)
Nikon NIS-Elements F	Nikon	NIS-Elements F	Image accquisition and analysis software (for DS-U1)
WT Col-0 plant line	NASC	N700000	Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0