JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) yoluyla insan dışkısından zenginleştirilmiş bakteriyel hücre dışı vezikülleri (BEV'ler) izole etmek ve saflaştırmak için bir yöntemi açıklamakta, BEV'lerin fiziksel özelliklerini morfoloji, partikül boyutu ve konsantrasyondan tanımlamakta ve DGC yaklaşımının klinik ve bilimsel araştırmalardaki potansiyel uygulamalarını tartışmaktadır.

Özet

Bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV'ler), ana bakterilerden miras alınan proteinler, lipitler ve nükleik asitler gibi biyoaktif molekülleri aktaran, bakteri-bakteri ve bakteri-konakçı iletişiminde aktif rol oynayan bakterilerden türetilen nanoveziküllerdir. Bağırsak mikrobiyotasından türetilen BEV'lerin gastrointestinal sistem içinde etkileri vardır ve uzak organlara ulaşabilir, bu da fizyoloji ve patoloji için önemli etkilere neden olur. İnsan dışkısından elde edilen BEV'lerin türlerini, miktarlarını ve rollerini araştıran teorik araştırmalar, bağırsak mikrobiyotasından BEV'lerin salgılanmasını ve işlevini anlamak için çok önemlidir. Bu araştırmalar aynı zamanda BEV'leri izole etmek ve saflaştırmak için mevcut stratejide bir iyileştirme gerektirmektedir.

Bu çalışma, iki yoğunluk gradyanlı santrifüj (DGC) modu oluşturarak BEV'lerin izolasyon ve saflaştırma sürecini optimize etti: Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya. BEV'lerin zenginleştirilmiş dağılımı 6 ila 8 (F6-F8) fraksiyonlarında belirlendi. Yaklaşımın etkinliği, partikül morfolojisi, boyutu, konsantrasyonu ve protein içeriğine göre değerlendirildi. Partikül ve protein geri kazanım oranları hesaplandı ve iki DGC modunun geri kazanımını ve saflığını karşılaştırmak için spesifik belirteçlerin varlığı analiz edildi. Sonuçlar, Yukarıdan aşağıya santrifüj modunun daha düşük kontaminasyon seviyelerine sahip olduğunu ve Aşağıdan yukarıya modelinkine benzer bir geri kazanım oranı ve saflığa ulaştığını gösterdi. 108 / mg'lık bir fekal BEV konsantrasyonu elde etmek için 7 saatlik bir santrifüj süresi yeterliydi.

Bu yöntem, dışkı dışında, bileşenlerdeki ve viskozitedeki farklılıklara göre uygun modifikasyonla diğer vücut sıvısı tiplerine de uygulanabilir. Sonuç olarak, bu ayrıntılı ve güvenilir protokol, BEV'lerin standartlaştırılmış izolasyonunu ve saflaştırılmasını kolaylaştıracak ve böylece sonraki multi-omik analiz ve fonksiyonel deneyler için bir temel oluşturacaktır.

Giriş

Bağırsak, insan vücudunda en bol bulunan mikrobiyal toplulukları barındıran organ olarak kabul edilmektedir ve bakterilerin %90'ından fazlası kolonizasyon ve çoğalmadarol oynar 1,2. Kapsamlı kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının bağırsak mikroçevresini modüle ettiğini ve aynı zamanda, öncelikle bozulmuş bir bağırsak bariyeri 3,4 yoluyla uzak organlardaki işlev bozukluğu ile etkileşime girdiğini göstermiştir. Artan kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının dengesizliği ile inflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) ilerlemesi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir5,6 ve ayrıca bağırsak-beyin ekseni 5,6,7,8 yoluyla bilişsel bozukluklar. Bakteriler tarafından üretilen bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV'ler) bu patolojik süreçlerde önemli rol oynar.

BEV'ler, çapları 20 ila 400 nm arasında değişen, bakteri türevlerini kapsülleyen nano ölçekli parçacıklardır. Bakteriler ve konakçı organizmalar arasındaki etkileşimleri kolaylaştırdıkları gösterilmiştir 9,10. Görünmez olmalarına rağmen, bu parçacıklar, tanısal biyobelirteçler, terapötik hedefler ve ilaç dağıtım araçları olarak ileriye dönük geniş uygulamaları nedeniyle araştırmacıların artan ilgisini çekmiştir11. Ağırlıklı olarak bağırsak bakterilerinden elde edilen BEV'leri incelemek için genellikle biyonumune olarak kullanılan insan dışkısı, diğerleri arasında su, bakteri, lipitler, proteinler, sindirilmemiş gıda artıkları ve pul pul dökülmüş epitel hücrelerinin karmaşık bir karışımını içerir. Karmaşık dışkı bileşimi, BEV'lerin izolasyonu ve saflığı için zorluklar yaratır ve böylece BEV'lerin kapsamlı, objektif ve gerçekçi bir analizini engeller. Bu nedenle, kirletici bileşenlerden kaynaklanan paraziti en aza indirmek ve BEV'lerin verimini artırmak için etkili stratejiler, derhal ilgilenilmesi gereken kritik konular olarak ortaya çıkmıştır.

Mevcut izolasyon stratejileri büyük ölçüde ultra yüksek hızlı santrifüjleme (UC), yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) gibi tekniklere dayanmaktadır12,13,14,15,16,17. Şu anda DGC, numunenin ilk yükleme konumu tarafından belirlenen "Yukarıdan aşağıya" ve "Aşağıdan yukarıya" olmak üzere iki sedimantasyon-yüzer modu kapsayan, BEV ayırma alanında en yaygın olarak uygulanan yöntemlerden biridir. Bu metodolojiler, hücre dışı vezikülleri (EV'ler) boyut ve yoğunluk eşitsizliklerine dayalı olarak diğer bileşenlerden ayırarak değişken saflık ve geri kazanım oranları sağlar. Önceki araştırmalar, EV'leri kandakilipoprotein 18 ve idrardaki Tamm-Horsfall proteini19 gibi vücut sıvısı örneklerinde çözünür proteinlerden yeterince ayırmak için tek yaklaşımlı stratejilerin yetersiz olduğunu göstermiştir. Ek olarak, ökaryotik hücre dışı veziküllerin (EEV'ler) boyut dağılımı genellikle BEV'lerinkiyle örtüşür ve bu nedenle BEV verimini optimize etmek için daha fazla metodolojik geliştirme gerektirir. Sonuç olarak, BEV'lerin çalışmasını ilerletmek, etkili ayırma ve saflaştırma metodolojilerinin geliştirilmesine bağlıdır. Özellikle, Tulkens ve ark.15, fekal BEV'leri EEV'lerden ayırmak için ortogonal bir biyofiziksel strateji kullandılar, burada Aşağıdan yukarıya DGC modunun santrifüjleme süresi 18 saate kadardı. Buna karşılık, bu çalışma bunu 7 saate düşürdü, gradyan-ultrasantrifüj süresinden büyük ölçüde tasarruf sağladı ve süreci basitleştirdi.

Bu çalışmada, BEV'leri düşükten aşırı yüksek hıza kadar bir dizi diferansiyel santrifüj hızıyla zenginleştirdikten sonra, optimize edilmiş tampon koşulları altında iki DGC modu kullanan fekal BEV'leri izole ettik ve saflaştırdık. Morfolojiye, partikül boyutuna ve konsantrasyona dayalı değerlendirmeler, bu gelişmiş yöntemle övgüye değer bir performans gösterdi. Bu çalışma, gelecekteki araştırmalar için temel oluşturabilir, uygulamalarını daha geniş bir alana genişletebilir ve insan vücudundaki BEV'lerin heterojenliği hakkında fikir verebilir. Ayrıca BEV ayırma ve analiz tekniklerinin standardizasyonuna da katkıda bulunur.

Protokol

Güney Tıp Üniversitesi Nanfang Hastanesi Etik Kurulu, katılımcıların bilgilendirilmiş onamıyla yürütülen bu çalışmayı onayladı. Burada kullanılan tüm yöntemler, Uluslararası İnsan Mikrobiyom Standartları (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/) tarafından sağlanan standart çalışma yönergelerine bağlı kalmıştır. Sonraki tüm sıvı işleme prosedürlerinin bir biyogüvenlik kabini veya ultra temiz bir tezgah içinde gerçekleştirilmesi zorunlu kılındı.

1. Dışkı örneklerinin toplanması ve alıntılanması

  1. Bir dışkı örnekleyici, kapalı bir torba ve bir buzlu kutu dağıtın ve katılımcılara örneklerin nasıl temin edileceği ve korunacağı konusunda kapsamlı talimatlar verin.
  2. Her katılımcıya, sağlanan örnekleyiciyi kullanarak dışkı örneğini toplamasını ve 24 saatlik bir pencere içinde 4 °C sıcaklıkta laboratuvara taşımasını söyleyin.
  3. Laboratuvarda alındıktan sonra, önceden tartılmış 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 3,5 g'dan daha az dışkıyı ayırmak için steril bir kaşık kullanın. Sonraki ön işlem prosedürleri için dışkı örneğinin ağırlığını tüp üzerine not edin.
    DURAKLAMA NOKTASI: Numunelerin hemen işlenmesi mümkün değilse, numuneyi uygun notasyondan sonra -80 °C'de uzun süreli depolama için tahsis edin.

2. Dışkı numunesi hazırlama

  1. 500 mL fosfat tamponlu salini (PBS) 4 °C'de soğutun. Önceden soğutulmuş PBS'yi 50 mL'lik bir şırınga kullanarak 0,22 μm Polietersülfon (PES) filtresinden on adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne filtreleyin.
  2. Her biri 3,5 g dışkı örneği içeren iki adet 50 mL'lik tüpü buz üzerine yerleştirin. Her tüpe 35 mL PBS ekleyin.
    NOT: Dışkı çözünmesi için gerekli PBS miktarını hesaplayın ve maksimum numune konsantrasyonunun %10 (a/h) olmasını sağlayın. Ek numuneler işliyorsanız, gerektiğinde daha fazla tüp kullanın.
  3. S'yi çalkalayınamps 300 rpm'de 2 °C'de 4 saat veya dışkı tamamen görünür şekilde tamamen süspanse olana kadar en az 4 °C'de 8 saat yerleştirin.

3. Diferansiyel hızlı santrifüjleme

  1. Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjü 4 °C'ye soğutun.
  2. Adım 2.3'te hazırlanan numuneleri içeren iki tüpün ağırlığını PBS ile toplam 0.1 g ağırlığa ulaşacak şekilde ayarlayın.
  3. Numuneleri 3.000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı, peletin yaklaşık 1 mL üzerinde bırakacak şekilde iki temiz 50 mL santrifüj tüpüne dikkatlice pipetleyin. Bu işlem için tek kullanımlık plastik bir Pasteur pipeti kullanın.
  5. Toplam ağırlığa ± 0,1 g içinde ulaşmak için PBS ile iki tüpün ağırlığını ayarlayın.
  6. Transfer edilen süpernatanı 12.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı 20 mL'lik bir şırınga kullanarak aspire edin, şırınga iğnesini çıkarın ve 0.22 μm filtrelerden 50 mL'lik tüplere süzün. Bu noktada, süpernatan hacmi yaklaşık 30 mL olmalıdır.
    NOT: 12.000 × g santrifüjlemeden sonra hala önemli miktarda kirlilik görünüyorsa, santrifüj adımını 12.000 × g'da 4 °C'de 30 dakika tekrarlamak gerekir. Bunun yapılmaması, filtrasyon sırasında gözenek tıkanması nedeniyle önemli bir BEV kaybına neden olabilir.

4. Ultra yüksek hızlı santrifüjleme

  1. Kalan kontaminasyonu ortadan kaldırmak için rotoru ve kovayı %75 (h/h) alkolle silerek temizleyin.
  2. Tüp tutucuya 38.5 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin.
    NOT: Numune hacmine göre uygun ultrasantrifüj tüpünü seçin. Ürün kılavuzunda belirtildiği gibi santrifüj tüpleri sterilize etmek için ultraviyole radyasyondan ve uygun olmayan kimyasal reaktiflerden kaçının.
  3. Filtrelenmiş fekal süpernatantın yaklaşık 30 mL'sini Adım 3.7'den ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
  4. Ultrasantrifüj tüpünü, tüpün açıklığından 3 mm boşluk bırakarak yaklaşık 8 mL PBS ile doldurun.
  5. İki ultrasantrifüj tüpünü numunelerle birlikte karşılıklı ultrasantrifüj kovalarına yerleştirin, örneğin kova 1, 4 (1-4), 2-5, 3-6'ya karşılık gelir.
  6. Toplam ağırlığı ± 0,005 g olacak şekilde PBS ile iki kovanın ağırlığını ayarlayın.
  7. Boruların yüklü olup olmadığına bakılmaksızın tüm kovaları rotora takın.
  8. Vakumu başlatın ve numuneleri 160.000 × g'da 4 °C'de 70 dakika santrifüjleyin.
  9. Hazne vakumunu serbest bırakın ve cihazın Ana sayfasında Hazır görüntülendiğinde kapıyı açın.
  10. Rotoru ultrasantrifüjden çıkarın.
  11. Kovaları rotordan rafa taşıyın ve bir pense kullanarak boruları alın.
  12. Altta görünür kahverengi topaklar içerecek olan süpernatanı atın.
  13. Peletleri, tamamen askıya alınana kadar 1 mL önceden soğutulmuş (4 °C) PBS ile 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Tüpü yaklaşık 37 mL PBS ile doldurun ve açıklıktan 3 mm boşluk bırakın.
  14. Kısmen bağlı kirletici bileşenleri tüp duvarlarından çıkarmak için 4.5 ° C'de 4.11 dakika boyunca 160,000 × g'da 4-4 adımlarını izleyerek başka bir ultrasantrifüjleme gerçekleştirin.
  15. Süpernatanı atın, iki ultrasantrifüj tüpünü 5 dakika ters çevirin ve iç duvarda kalan çözeltiyi silecekler ile temizleyin.
    NOT: İç duvarın temizlenmesi, ultrasantrifüj tüpü duvarına yapışan artık kontaminasyondan kaynaklanan paraziti en aza indirir. Özellikle partikül boyutu ile ilgili olarak BEV analizini etkilemeyecek silecekleri seçin.
  16. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak 1,2 mL önceden soğutulmuş (4 °C) PBS ile yukarı ve aşağı pipetleyerek her tüpteki peletleri yeniden süspanse edin.
  17. 1.2 mL PBS / BEV çözeltisini bir ultrasantrifüj tüpünden temiz bir 1.5 mL mikrotüpe aktarın.
    DURAKLAMA NOKTASI: Bir ultrasantrifüj tüpünden toplanan PBS/BEV çözeltisi Adım 6'ya geçebilir. Diğer tüpteki çözeltiyi -80 °C'de saklayın.

5. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için çözelti hazırlama

  1. 0,02 M HEPES tamponunun hazırlanması
    1. 0.477 g HEPES tozu ve 0.8 g NaCl'yi 90 mL otoklavlanmış deiyonize su ile birleştirin.
    2. 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek pH'ı 7,2'ye ayarlayın. Deiyonize su ile hacmi 100 mL'ye getirin ve çözeltiyi 0.22 μm PES membranlarından süzün.
      DİKKAT: Sodyum hidroksit güçlü bir kostik alkalidir. Operatörler bunu bir çeker ocakta dikkatli bir şekilde tutmalı ve hazırlamalıdır.
  2. Yoğunluk gradyan tamponunun hazırlanması
    1. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için ultrasantrifüj tüplerinin sayısına bağlı olarak her bir yoğunluk gradyan tamponunun gerekli hacmini hesaplayın (Adım 6) (Bu protokolde, %60, %50, %40, %20 ve %10 gradyan çözeltileri için hacimler sırasıyla 2.5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 mL ve 6 mL idi).
    2. % 50 (a / h) iyodiksanol çalışma çözeltisinin hazırlanması için, 0.02 M HEPES tamponunu ve% 60 (a / h) iyodiksanol stok çözeltisini 1: 5 (0.5 mL: 2.5 mL) hacim oranında karıştırın.
      NOT: İodiksanol stok çözeltisini geri çekmek ve hava girmesini önlemek için tek kullanımlık 20 mL'lik bir şırınga kullanın.
    3. Farklı konsantrasyonlarda iyodiksanol tamponları hazırlamak için, Adım 5.2.2'deki %50 iyodiksanol çalışma solüsyonunu, Tablo 1'de gösterilen oranlara göre 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak Adım 5.1'de elde edilen HEPES tamponu ile birleştirin.
      NOT: Adım 5'i ışıklar kapalıyken ultra temiz bir tezgahta gerçekleştirin. Bakteri üremesini önlemek için açılmış iyodiksanol stok çözeltisini buzdolabında 4 °C'de saklayın. İodiksanol çözeltisini ve HEPES tamponunu ışıktan koruyun.

6. Yoğunluk gradyanlı santrifüj sisteminin kurulması

  1. Yukarıdan aşağıya DGC modu
    1. Adım 4'ten izole edilen 500 μL PBS / BEV çözeltisini 3 mL PBS ile birleştirin. 3,5 mL PBS/BEV çözeltisi elde etmek için çözeltileri 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın.
    2. 31 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpünü delikli bir köpük plaka üzerine yerleştirin ve "↓" olarak etiketleyin.
    3. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak tüpün dibine dikey olarak 3 mL% 50 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
    4. Tüpü 70°'lik bir açıyla eğin ve köpük plaka seviyesinin biraz üstüne, tüpün açıklığının altına bir tüp tutucu veya başka bir destek yerleştirin.
    5. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak %50 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL %40 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
    6. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak% 40 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL% 20 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
    7. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak %20 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL %10 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
    8. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak% 10 iyodiksanol çözeltisinin üzerine Adım 6.1.1'den 3,5 mL PBS / BEV çözeltisi ekleyin.
    9. Tüpleri yavaşça dik konuma getirin.
      NOT: Pipetlemeden sonra tabakalaşma görünür olmalıdır.
  2. Aşağıdan yukarıya DGC modu
    1. Delikli bir köpük plaka üzerine 31 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve "↑" olarak etiketleyin.
    2. Tüpün dibine dikey olarak 2.5 mL% 60 iyodiksanol stok çözeltisi ekleyin. 3 mL %50 iyodiksanol/BEV çözeltisi elde etmek için 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak Adım 4'ten izole edilen 500 μL PBS/BEV çözeltisi ile hafifçe karıştırın.
    3. Tüpü 70°'lik bir açıyla eğin ve köpük plaka seviyesinin biraz üstüne, tüpün açıklığının altına bir tüp tutucu veya başka bir destek yerleştirin.
    4. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak %50 iyodiksanol/BEV çözeltisinin üzerine 3 mL %40 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
    5. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak %40 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL %20 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
    6. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak% 20 iyodiksanol çözeltisinin üzerine% 10 iyodiksanol çözeltisinden 3 mL ekleyin.
    7. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak% 10 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3,5 mL PBS ekleyin.
    8. Tüpleri yavaşça dik konuma getirin.
    9. Bu noktada, Adım 4.17'de elde edilen süspansiyonun 200 μL'si kaldı ve bu daha sonra "UC" adlı bir grup olarak analiz edilebilir.
      NOT: Adım 6'da çözeltileri aktarırken, pipet ucunu her zaman tüpün eksenine dik olarak ultrasantrifüj tüpü duvarına karşı tutun.

7. Yoğunluk gradyan santrifüjleme ve fraksiyon toplama

  1. Toplam ağırlığı ± 0,005 g olacak şekilde PBS ile iki tüpün ağırlığını ayarlayın.
  2. Tüpleri Adım 4.5'e göre kovalara yerleştirin ve 4 °C'de 7 saat boyunca 160.000 × g'da santrifüjlemeye tabi tutun.
  3. Fraksiyonları bir pipetleyici (1000 μL) kullanarak yukarıdan aşağıya yan duvara şu sırayla toplayın: 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1.5 mL ve 3 mL, 38.5 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpünde.
    NOT: Görüş hattını sıvı yüzeyiyle aynı seviyede tutun.
  4. Adım 4'e göre Adım 7.3'te elde edilen her fraksiyon için 160.000 × g'da 4 ° C'de 70 dakika boyunca ultrasantrifüjleme gerçekleştirin.
  5. Süpernatanı çıkarın ve ultrasantrifüj tüplerini 5 dakika boyunca ters çevirin.
  6. Peletleri 200 μL'lik bir pipet kullanarak 200 μL önceden soğutulmuş (4 °C) PBS'de yeniden süspanse edin.
  7. PBS/BEV çözeltisini temiz bir 1,5 mL mikrotüpe aktarın.
  8. F1'den F10'a kadar olan kesirleri etiketleyin ve Adım 8'e göre analiz edin.
    DURAKLAMA NOKTASI: Adım 7.8'de elde edilen numuneler hemen işlenemiyorsa, -80 °C'de saklayın.

8. Toplanan kesirlerin karakterizasyonu ve kantitatif analizi

  1. Karşılık gelen yoğunluklarını hesaplamak için boş kontrollü bir mikroplaka dedektörü kullanarak her bir fraksiyonun absorbans değerlerini (OD 340 nm) belirleyin.
    NOT: Boş bir kontrol oluşturmak için PBS/BEV çözümünü (Adım 6.1.1 ve Adım 6.2.2) PBS ile değiştirin.
    1. Sırasıyla 1.0058 g/mL, 1.0318 g/mL, 1.058 g/mL, 1.0708 g/mL ve 1.111 g/mL yoğunluklara karşılık gelen standartlar olarak %50 stok çözeltisine (Adım 5.2.2) dayalı olarak 0,%5, %10, %12,5 ve %20 iyodiksanol çözeltisinin her biri 100 μL hazırlayın.
    2. 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarını çoğaltmak için boş kontrolden (Adım 7.3'te hazırlanan) her fraksiyondan 50 μL ve her standart çözeltiden (Adım 8.1.1'de hazırlanan) 50 μL ekleyin.
    3. Dalga boyunu 340 nm'ye ayarlayın, uç nokta optik yoğunluğunu ölçün ve her bir fraksiyonun yoğunluğunu hesaplayın.
    4. F4-F9'u yoğunluklarına göre BEV kesirlerinin aralığı olarak tanımlayın.
  2. Bikinkoninik asit tahlili (BCA) kullanarak BEV fraksiyonlarının protein konsantrasyonunu belirleyin.
    1. 0.5 μg / μL standart protein çözeltisi hazırlamak için üretici tarafından sağlanan PBS'deki maddeyi on kat seyreltin.
    2. Reaktif talimatlarına göre değişen hacimlerde standart protein çözeltisini (Adım 8.2.1'de hazırlanan) ekleyin ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunu PBS ile toplam 20 μL hacme tamamlayın.
    3. Her bir kuyucuğa Adım 7.8'de hazırlanan numunelerden 20 μL ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneler ilave edilir.
    4. A ve B reaktiflerini 50:1 oranında karıştırın ve her bir oyuğa 200 μL aktarın.
    5. Plakayı 37 °C su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
    6. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbans değerini ölçün, protein konsantrasyonunu (μg/μL) hesaplayın ve Adım 8.2.2'de seyreltilmiş standart çözeltilerin değerlerinden üretilen standart eğriye (x: optik yoğunluk; y: protein konsantrasyonu) dayalı olarak numunelerin protein içeriğini (μg) belirleyin.
  3. BEV'lerin varlığını doğrulamak için transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak Adım 8.1.4'te tanımlanan BEV fraksiyonlarını karakterize edin. Aşağıdaki tüm işlemler buz üzerinde yapılmalıdır.
    1. Adım 7.8'den izole edilen her bir F4-F9 fraksiyonundan 10 μL uygulayın ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneleri 20 dakika boyunca Formvar/Karbon destekli bakır ızgaralara uygulayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
    2. Numuneleri 100 μL PBS ile her biri 1 dakika boyunca üç kez durulayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
    3. Numuneleri 100 μL %1 (a/h) glutaraldehit ile 5 dakika sabitleyin ve filtre kağıdı ile kurulayın.
    4. Izgaraları 100 μL PBS ile her biri 2 dakika boyunca on kez yıkayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
    5. Izgaraları 50 μL% 1.5 (a / h) uranil asetat ile 10 dakika boyayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
      DİKKAT: Uranil asetat radyoaktiftir ve cilt ile temas ettiğinde veya solunduğunda son derece toksiktir. Uranil asetat içeren çözeltileri bir çeker ocakta tutun ve uygun güvenlik önlemlerini alın.
    6. Izgaraları 5 dakika boyunca %1 (a/h) metilselüloz damlasına aktarın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
    7. Havayla kurutulmuş ızgaraları gözlemleyene kadar karanlık, tozsuz bir ortamda saklayın.
    8. Görüntüleri yakalayın ve bir TEM kullanarak analiz edin.
  4. Partikül sayısını saymak için nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanarak Adım 8.1.4'te tanımlanan BEV fraksiyonlarını karakterize edin.
    1. Sistemi 110 nm polistiren parçacıkları kullanarak kalibre edin.
    2. Numune havuzunu PBS kullanarak yıkayın.
    3. Adım 7.8'de elde edilen farklı fraksiyonlardan alınan numuneleri ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneleri, optimize edilmiş 107 partikül / mL konsantrasyonla 105-10 9 partikül / mL aralığında bir konsantrasyona seyreltin.
    4. Sıcaklığı 23-30 °C civarında tutarak üç çoğaltma ile 11 konumda kaydedin ve analiz edin.
  5. Örneklerin protein içeriklerini coomassie parlak mavi boyama (CBBS) ve batı lekeleme (WB) ile analiz edin.
    1. Adım 7.8'de elde edilen farklı fraksiyonlardan BEV numunelerini ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneleri, PBS ve 5 × yükleme tamponu kullanarak 0.5 veya 1 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin, miktar tayini gerekiyorsa, Adım 8.5.2'de her bir kuyucuktan 20 μL (10 μg veya 20 μg) yeterli numune yüklemesi sağlayın. Numuneleri 95 °C'de 10 dakika kaynatın.
    2. Prefabrike poliakrilamid jeli elektroforez tankına monte edin ve numuneleri kuyucuklara aktarın.
    3. Aşağıdaki parametrelerle dikey elektroforez yapın: 50 dakika boyunca 160 V.
    4. Jeli Coomassie parlak mavi solüsyonunda 1 saat boyayın, mavi arka plan aydınlanana kadar deiyonize suda durulayın ve bir kamera ile görüntü yakalayın.
    5. Aşağıdaki parametrelerle diğer jeller için protein lekeleme prosedürleri uygulayın: 20 dakika boyunca 400 mA.
    6. Kurutma membranlarını oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 (a/h) BSA çözeltisi ile bloke edin.
    7. Membranları TBST tamponunda her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    8. Membranları primer antikorlarla inkübe edin (BEV belirteçleri: LPS, OmpA, LTA; EEV belirteçleri: CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1; Diğer kontaminasyon belirteçleri: Flagellin, Calnexin) 4 ° C'de 8-12 saat.
    9. Membranları TBST tamponunda her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    10. Membranları oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin.
    11. Adım 8.5.9'u gerçekleştirin.
    12. Bir kemilüminesans aparatı kullanarak lekelemeyi geliştirin.
    13. Pozitif bir kontrol oluşturmak için PBS/BEV çözeltisini (Adım 6.1.1 ve Adım 6.2.2) Escherichia coli'den elde edilen BEV'lerle değiştirin (ham E. coli-BEV'leri izole etme prosedürü için Malzeme Tablosuna bakın) ve BEV'leri karakterize etmek için yukarıdaki tüm deneyleri gerçekleştirin.
      DURAKLAMA NOKTASI: Fekal BEV'ler için yukarıda açıklanan karakterizasyonun sonuçlarına dayalı olarak FEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların dağılımı olarak F6-F8'i belirleyin ve sonraki analizler için bu daraltılmış aralığı kullanın.
  6. İki DGC modunun verimliliğini değerlendirmek için geri kazanım oranlarını parçacıklar ve proteinler açısından hesaplayın. Aşağıdaki sonuçlar yüzde olarak sunulmuştur.
    1. Yukarıdan aşağıya modda parçacıkların geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam parçacıklar/Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonraki parçacıklar.
    2. Aşağıdan yukarıya modda parçacıkların geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam parçacıklar/Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonraki parçacıklar.
    3. Yukarıdan aşağıya modda proteinlerin geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam protein içeriği (μg)/Adım 6.2.9'da (μg) tanımlanan UC'den sonraki protein içeriği.
    4. Aşağıdan yukarıya modda proteinlerin geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam protein içeriği (μg)/Adım 6.2.9'da (μg) tanımlanan UC'den sonraki protein içeriği.
  7. UC ve iki DGC modunun geleneksel olarak tanımlanan saflığını değerlendirmek için parçacık/protein oranını hesaplayın ve aşağıdaki sonuçların tümü yüzde olarak sunulmuştur.
    1. Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra parçacık/protein oranı: UC'den sonra partiküller/UC'den sonra protein içeriği (μg).
    2. Yukarıdan aşağıya modda parçacık/protein oranı: F6-F8'deki toplam parçacık/F6-F8'deki protein içeriği (μg).
    3. Aşağıdan yukarıya modda parçacık/protein oranı: F6-F8'deki toplam parçacık/F6-F8'deki protein içeriği (μg).
  8. Fekal BEV saflaştırması ve gelecekteki analizler için en uygun santrifüj modunu (protokolde yukarıdan aşağıya mod seçilmiştir) seçin.

Sonuçlar

BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların dağılımını belirleyin
Bakteriyel hücre dışı veziküllerin (BEV'ler) zenginleştirilmiş fraksiyonlarının dağılımını belirlemek için, OD 340 nm'deki absorbans değerlerini ölçmek için boş bir kontrol kuruldu ve her fraksiyonun yoğunluğu ölçümlere ve iyodiksanol yönergelerine göre hesaplandı (Adım 8.1). Tablo 2 , F4 ila F9 fraksiyonlarının, tipik olarak hücre dışı veziküllerle ilişkili aralıkta yoğunlukl...

Tartışmalar

Bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV'ler), bakteriler tarafından salgılanan, çok sayıda protein, lipit, nükleik asit ve diğer biyoaktif molekülleri taşıyan, bakterilerin fonksiyonel etkilerine aracılık etmeye katkıda bulunan lipid-çift katmanlı nanopartiküllerdir20. Bağırsaktan elde edilen BEV'lerin inflamatuar bağırsak hastalığı, Crohn hastalığı ve kolorektal kanser gibi hastalıkların gelişiminde rol oynadığı ve ayrıca genel metabolizmayı etkilediği ve bozu...

Açıklamalar

Yazarlar çatışan hiçbir çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (82230080) Anahtar projesi olan Seçkin Genç Akademisyenler için Ulusal Bilim Fonu (82025024) tarafından desteklenmiştir;Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFA1300604); Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81871735, 82272438 ve 82002245); Seçkin Genç Akademisyenler için Guangdong Doğa Bilimleri Fonu (2023B1515020058); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2021A1515011639); Çin'deki Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'nın Büyük Devlet Temel Araştırma Geliştirme Programı (ZR2020ZD11); Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2022M720059); Güney Tıp Üniversitesi, Nanfang Hastanesi'nin Üstün Gençlik Geliştirme Programı (2022J001).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)ACMECAP1126Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)Sigma-AldrichM7027Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)Polysciences21447-25Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL PipetteKIRGENKG1313, KG1212, KG1011Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer)Fdbio scienceFD0030Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading bufferFdbio scienceFD006Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcoholLIRCONLIRCON-500 mLSurface disinfection
96-well plateRarA8096Measure the absorbance values 
Anti-Calnexin antibodyAbcamab92573Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibodyAbcamab134045Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibodyAbcamab236630Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibodySino Biological40067-MM06Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibodyAbcamab30394Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibodyThermo FisherMA1-83152Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibodyThermo Fisher MA1-7402Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibodyCUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibodyAbcamab133267Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibodyAbcamab125011Western blotting (Primary Antibody)
AutoclaveZEALWAYGR110DPSterilization for supplies and mediums used in the experiment
BalanceMettler ToledoAL104Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay Fdbio scienceFD2001Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRenderBioRenderhttps://app.biorender.comMake the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinetHaierHR1200- II B2Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38Eppendorf5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence ApparatusBIO-OIOI600SE-MFUsed in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5BioTekF01Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values 
Dil-labled low density lipoproteinACMECAC12038Definition of distribution of interfering components 
Electrophoresis equipmentBio-rad1658033Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP Fdbio scienceFD8020Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli American Type Culture CollectionATCC8739Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).    
Falcon tubes 50 mLKIRGENKG2811Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining BufferAbsciab.001.50Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paperBiosharpBS-TFP-070BMorphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids Sigma-AldrichTEM-FCF200CU50Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powderMeilunbioMB6078Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Fdbio scienceFDM007Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fdbio scienceFDR007Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shakerQiangwenDHZ-LCultivate Escherichia coli 
Kimwipes™ Delicate Task WipesKimtech Science34155Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB brothHopebioHB0128Cultivate Escherichia coli 
Low temperature freezer (-80 °C)HaierDW-86L338JStore the samples
MethanolAlalddinM116118Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mLKIRGENKG2211Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mLKIRGENKG2911Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mLBBIF610888-0001Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader Thermo Fisher Multiskan MK3Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μmMerck milliporeSLGP033RBFiltration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaClGHTECH1.01307.040Density gradient centrifugation solution
NaOHGHTECH1.01394.068Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100Beckman CoulterA94469Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™Serumwerk Bernburg AG1893Density gradient centrifugation stock solution
Orbital ShakerYouningCS-100Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered salineProcellPB180327Dissolve feces at Step 2
PipettorEppendorf3120000267, 3120000259Transfer the solution
Plastic pasteur pipetteABCbioABC217003-4Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranesMilliporeISEQ00010, IPVH00010Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 WellsACEF15420GelUsed in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluentFdbio scienceFD0040Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladderFdbio scienceFD0672Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solutionUBIOUW0500Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter369650Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL JetwayZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mLTransfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powderFdbio scienceFD1021Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM)Hitachi H-7650Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20Fdbio scienceFD0020Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tubeBeckman326823, 355642Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean benchAIRTECHSW-CJ-2FDPeform the procedures about liquid handling
Water bathBluepardCU600Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaViewParticle MetrixS/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7)Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4

Referanslar

  1. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  2. Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
  3. de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  4. Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
  5. Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
  6. Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
  7. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  8. Morais, L. H., Schreiber, H. L. t., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  9. Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
  10. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  11. Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
  14. Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
  15. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
  16. Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
  17. Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
  18. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  19. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
  20. Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
  21. Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
  22. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
  23. Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
  24. Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
  25. Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
  26. Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
  27. Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
  28. Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
  29. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  30. Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
  31. Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
  32. Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

zolasyon ve Safla t rmaBakteriyel H cre D Vezik llernsan D k sYo unluk Gradyanl Santrif jlemeBa rsak MikrobiyotasBiyoaktif Molek llerProteinlerLipitlerN kleik AsitlerFizyolojiPatolojiSekresyonFonksiyonOptimizasyonYukar dan A a ya Santrif j ModuA a dan Yukar ya Santrif j ModuPartik l MorfolojisiBoyutKonsantrasyonProtein eri iGeri Kazan m OranlarSafl k Seviyeleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır