Isolamento e purificazione di vescicole extracellulari batteriche da feci umane mediante centrifugazione a gradiente di densità

Riepilogo

Questo studio descrive un metodo per isolare e purificare le vescicole extracellulari batteriche (BEV) arricchite da feci umane tramite centrifugazione a gradiente di densità (DGC), identifica le caratteristiche fisiche dei BEV dalla morfologia, dalla dimensione delle particelle e dalla concentrazione e discute le potenziali applicazioni dell'approccio DGC nella ricerca clinica e scientifica.

Abstract

Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanovescicole derivate da batteri che svolgono un ruolo attivo nella comunicazione batterio-batterio e batterio-ospite, trasferendo molecole bioattive come proteine, lipidi e acidi nucleici ereditati dai batteri genitori. I BEV derivati dal microbiota intestinale hanno effetti all'interno del tratto gastrointestinale e possono raggiungere organi distanti, con conseguenti implicazioni significative per la fisiologia e la patologia. Le indagini teoriche che esplorano i tipi, le quantità e i ruoli dei BEV derivati dalle feci umane sono fondamentali per comprendere la secrezione e la funzione dei BEV dal microbiota intestinale. Queste indagini richiedono anche un miglioramento dell'attuale strategia per l'isolamento e la purificazione dei BEV.

Questo studio ha ottimizzato il processo di isolamento e purificazione dei BEV stabilendo due modalità di centrifugazione a gradiente di densità (DGC): Top-down e Bottom-up. La distribuzione arricchita dei BEV è stata determinata nelle frazioni da 6 a 8 (F6-F8). L'efficacia dell'approccio è stata valutata in base alla morfologia delle particelle, alle dimensioni, alla concentrazione e al contenuto proteico. Sono stati calcolati i tassi di recupero di particelle e proteine ed è stata analizzata la presenza di marcatori specifici per confrontare il recupero e la purezza delle due modalità DGC. I risultati hanno indicato che la modalità di centrifugazione top-down aveva livelli di contaminazione più bassi e raggiungeva un tasso di recupero e una purezza simili a quelli della modalità bottom-up. Un tempo di centrifugazione di 7 ore è stato sufficiente per raggiungere una concentrazione fecale di BEV di 10⁸/mg.

Oltre alle feci, questo metodo potrebbe essere applicato ad altri tipi di fluidi corporei con opportune modifiche in base alle differenze nei componenti e nella viscosità. In conclusione, questo protocollo dettagliato e affidabile faciliterebbe l'isolamento e la purificazione standardizzati dei BEV e, quindi, getterebbe le basi per le successive analisi multi-omiche e gli esperimenti funzionali.

Introduzione

L'intestino è ampiamente riconosciuto come l'organo che ospita le comunità microbiche più abbondanti nel corpo umano, con oltre il 90% dei batteri coinvolti nella colonizzazione e moltiplicazione ^1,2. Numerose evidenze hanno dimostrato che il microbiota intestinale modula il microambiente intestinale e contemporaneamente interagisce con la disfunzione in organi distanti, principalmente attraverso una barriera intestinale compromessa ^3,4. Prove crescenti indicano una correlazione tra lo squilibrio del microbiota intestinale e la progressione della malattia infiammatoria intestinale (IBD)5,6, nonché i disturbi cognitivi attraverso l'asse intestino-cervello 5,6,7,8. Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) prodotte dai batteri svolgono un ruolo significativo in questi processi patologici.

I BEV sono particelle su scala nanometrica che incapsulano derivati batterici, con diametri compresi tra 20 e 400 nm. È stato dimostrato che facilitano le interazioni tra i batteri e i loro organismi ospiti ^9,10. Nonostante la loro invisibilità, queste particelle hanno attirato una crescente attenzione da parte dei ricercatori a causa delle loro ampie applicazioni come biomarcatori diagnostici, bersagli terapeutici e veicoli di somministrazione di farmaci¹¹. Le feci umane, spesso utilizzate come campioni biologici per lo studio dei BEV, provenienti prevalentemente da batteri intestinali, contengono una complessa miscela di acqua, batteri, lipidi, proteine, residui di cibo non digerito e cellule epiteliali esfoliate, tra gli altri. L'intricata composizione fecale pone sfide all'isolamento e alla purezza dei BEV, impedendo così un'analisi completa, obiettiva e realistica dei BEV. Pertanto, le strategie efficaci per ridurre al minimo le interferenze dovute alla contaminazione dei componenti e migliorare la resa dei BEV sono emerse come questioni critiche che meritano un'attenzione immediata.

Le strategie di isolamento esistenti si basano in gran parte su tecniche come la centrifugazione ad altissima velocità (UC), la centrifugazione a gradiente di densità (DGC) e la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)12,13,14,15,16,17. Attualmente, il DGC è uno dei metodi più ampiamente applicati nel campo della separazione dei BEV, che comprende due modalità di sedimentazione-galleggiamento, "Top-down" e "Bottom-up", che sono determinate dalla posizione di carico iniziale del campione. Queste metodologie differenziano le vescicole extracellulari (EV) da altri componenti in base alle disparità di dimensioni e densità, producendo velocità di purezza e recupero variabili. Ricerche precedenti hanno indicato che le strategie ad approccio singolo sono insufficienti per separare adeguatamente le vescicole extracellulari dalle proteine solubili nei campioni di fluidi corporei, come la lipoproteina nel sangue¹⁸ e la proteina Tamm-Horsfall nelle urine¹⁹. Inoltre, la distribuzione dimensionale delle vescicole extracellulari eucariotiche (EEV) spesso si sovrappone a quella dei BEV, rendendo quindi necessari ulteriori miglioramenti metodologici per ottimizzare la resa dei BEV. Di conseguenza, l'avanzamento dello studio dei BEV dipende dallo sviluppo di metodologie efficaci di separazione e purificazione. In particolare, Tulkens et al. 15 hanno impiegato una strategia biofisica ortogonale per separare i BEV fecali dagli EEV, in cui il tempo di centrifugazione di una modalità DGC dal basso verso l'alto era fino a^{18 ore.} Al contrario, questo studio lo ha ridotto a 7 ore, risparmiando notevolmente il tempo di ultracentrifugazione a gradiente e semplificando il processo.

Nel presente studio, abbiamo isolato e purificato BEV fecali impiegando due modalità DGC in condizioni tampone ottimizzate, dopo aver arricchito i BEV con una gamma di velocità di centrifugazione differenziali, da bassa a altissima velocità. Le valutazioni basate sulla morfologia, la dimensione delle particelle e la concentrazione hanno indicato prestazioni encomiabili con questo metodo avanzato. Questo studio potrebbe fungere da base per la ricerca futura, estendendo le sue applicazioni a un dominio più ampio e offrendo approfondimenti sull'eterogeneità dei BEV all'interno del corpo umano. Contribuisce inoltre alla standardizzazione delle tecniche di separazione e analisi dei BEV.

Protocollo

Il Comitato Etico del Nanfang Hospital, Southern Medical University, ha approvato questo studio, che è stato condotto con il consenso informato dei partecipanti. Tutti i metodi utilizzati nel presente documento sono conformi alle linee guida operative standard fornite dagli standard internazionali del microbioma umano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Tutte le successive procedure di manipolazione dei liquidi dovevano essere eseguite all'interno di una cabina di biosicurezza o di un banco ultra-pulito.

1. Raccolta e aliquotazione di campioni fecali

1. Distribuire un campionatore di feci, un sacchetto sigillato e una scatola ghiacciata e fornire istruzioni complete ai partecipanti su come procurarsi e conservare i campioni.
2. Istruire ogni partecipante a raccogliere il proprio campione fecale utilizzando il campionatore fornito e a trasportarlo in laboratorio a una temperatura di 4 °C entro una finestra di 24 ore.
3. Al ricevimento in laboratorio, utilizzare un cucchiaio sterile per aliquotare meno di 3,5 g di feci in una provetta da centrifuga da 50 ml prepesata. Annotare il peso del campione fecale sulla provetta per le successive procedure di pretrattamento.
   PUNTO DI PAUSA: Se l'elaborazione immediata dei campioni non è possibile, assegnare il campione per la conservazione a lungo termine a -80 °C dopo un'opportuna annotazione.

2. Preparazione del campione di feci

1. Raffreddare 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 4 °C. Filtrare il PBS pre-raffreddato attraverso un filtro in polietersulfone (PES) da 0,22 μm utilizzando una siringa da 50 mL in dieci provette da centrifugazione da 50 mL.
2. Posizionare due provette da 50 ml sul ghiaccio, ciascuna contenente 3,5 g di campioni fecali. Aggiungere 35 mL di PBS a ciascuna provetta.
   NOTA: Calcolare la quantità necessaria di PBS per la dissoluzione delle feci, garantendo una concentrazione massima del campione del 10% (p/v). Se si elaborano campioni aggiuntivi, utilizzare più provette secondo necessità.
3. Agitare i campioni a 300 giri/min per 2 ore a 4 °C, oppure posizionarli per 8 ore almeno a 4 °C fino a quando le feci sono completamente sospese a vista.

3. Centrifugazione a velocità differenziale

1. Raffreddare la centrifuga refrigerata ad alta velocità a 4 °C.
2. Regolare il peso delle due provette contenenti i campioni preparati al punto 2.3 con PBS per raggiungere un peso totale di 0,1 g.
3. Centrifugare i campioni a 3.000 × g per 20 minuti a 4 °C.
4. Pipettare con cura il surnatante in due provette da centrifuga pulite da 50 mL, lasciando circa 1 mL sopra il pellet. Utilizzare una pipetta Pasteur in plastica usa e getta per questo processo.
5. Regolare il peso dei due tubi con PBS per raggiungere un peso totale entro ± 0,1 g.
6. Centrifugare il surnatante trasferito a 12.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
7. Aspirare il surnatante utilizzando una siringa da 20 mL, rimuovere l'ago della siringa e filtrarlo attraverso filtri da 0,22 μm in provette da 50 mL. A questo punto, il volume del surnatante dovrebbe essere di circa 30 ml.
   NOTA: Se dopo la centrifugazione di 12.000 × g è ancora visibile una quantità significativa di impurità, è necessario ripetere la fase di centrifugazione a 12.000 × g per 30 minuti a 4 °C. La mancata osservanza di questa precauzione può comportare una perdita significativa di BEV a causa dell'ostruzione dei pori durante la filtrazione.

4. Centrifugazione ad altissima velocità

1. Pulire il rotore e la benna strofinandoli con alcol al 75% (v/v) per eliminare qualsiasi contaminazione residua.
2. Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 38,5 mL nel supporto della provetta.
   NOTA: Selezionare la provetta per ultracentrifuga appropriata in base al volume del campione. Evitare radiazioni ultraviolette e reagenti chimici non idonei per la sterilizzazione delle provette centrifughe come indicato nel manuale del prodotto.
3. Trasferire circa 30 mL del surnatante fecale filtrato dalla fase 3.7 nella provetta per ultracentrifuga.
4. Riempire la provetta dell'ultracentrifuga con circa 8 mL di PBS, lasciando uno spazio di 3 mm dall'apertura della provetta.
5. Posizionare le due provette per ultracentrifuga con i campioni in secchi di ultracentrifugazione opposti, ad esempio, il secchio 1 corrisponde a 4 (1-4), 2-5, 3-6.
6. Regolare il peso dei due secchi con PBS per ottenere un peso totale entro ± 0,005 g.
7. Installare tutte le benne sul rotore, indipendentemente dal fatto che i tubi siano caricati.
8. Avviare il vuoto e centrifugare i campioni a 160.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
9. Rilasciare il vuoto della camera e aprire lo sportello una volta visualizzato Ready (Pronto) sulla pagina Home dello strumento.
10. Rimuovere il rotore dall'ultracentrifuga.
11. Spostare le benne dal rotore alla rastrelliera e recuperare le provette utilizzando una pinza.
12. Scartare il surnatante, che conterrà pellet marroni visibili sul fondo.
13. Risospendere i pellet pipettandoli ripetutamente su e giù utilizzando una pipetta da 1.000 μL con 1 mL di PBS preraffreddato (4 °C) fino alla completa sospensione. Riempire la provetta con circa 37 mL di PBS, lasciando uno spazio di 3 mm dall'apertura.
14. Eseguire un'altra ultracentrifugazione seguendo i passaggi 4.5-4.11 a 160.000 × g per 70 minuti a 4 °C per rimuovere i componenti contaminanti parzialmente attaccati dalle pareti del tubo.
15. Scartare il surnatante, capovolgere le due provette dell'ultracentrifuga per 5 minuti ed eliminare la soluzione rimanente sulla parete interna con i tergicristalli.
    NOTA: La pulizia della parete interna riduce al minimo l'interferenza della contaminazione residua che aderisce alla parete della provetta dell'ultracentrifuga. Scegliere tergicristalli che non influenzino l'analisi BEV, in particolare per quanto riguarda la dimensione delle particelle.
16. Risospendere i pellet in ciascuna provetta pipettandoli su e giù con 1,2 mL di PBS pre-raffreddato (4 °C) utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
17. Trasferire 1,2 mL della soluzione PBS/BEV da una provetta per ultracentrifuga a una microprovetta pulita da 1,5 mL.
    PUNTO DI PAUSA: La soluzione PBS/BEV raccolta da una provetta per ultracentrifuga può procedere alla fase 6. Conservare la soluzione dall'altra provetta a -80 °C.

5. Preparazione della soluzione per la centrifugazione a gradiente di densità

1. Preparazione del tampone HEPES da 0,02 M
   1. Combinare 0,477 g di polvere HEPES e 0,8 g di NaCl con 90 mL di acqua deionizzata sterilizzata in autoclave.
   2. Regolare il pH a 7,2 aggiungendo 1 M di idrossido di sodio (NaOH). Portare il volume a 100 mL con acqua deionizzata e filtrare la soluzione attraverso membrane in PES da 0,22 μm.
      ATTENZIONE: L'idrossido di sodio è un forte alcali caustico. Gli operatori devono maneggiarlo e prepararlo con cura in una cappa chimica.
2. Preparazione del tampone del gradiente di densità
   1. Calcolare il volume richiesto di ciascun tampone a gradiente di densità in base al numero di provette per ultracentrifuga per la centrifugazione a gradiente di densità (fase 6) (in questo protocollo, i volumi per le soluzioni a gradiente al 60%, 50%, 40%, 20% e 10% erano rispettivamente di 2,5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 mL e 6 mL).
   2. Per la preparazione di una soluzione di lavoro di iodixanolo al 50% (p/v), miscelare il tampone HEPES 0,02 M e la soluzione madre di iodixanolo al 60% (p/v) in un rapporto di volume di 1:5 (0,5 mL:2,5 mL).
      NOTA: Utilizzare una siringa monouso da 20 ml per prelevare la soluzione madre di iodixanolo ed evitare di introdurre aria.
   3. Per preparare tamponi di iodixanolo con diverse concentrazioni, combinare la soluzione di lavoro di iodixanolo al 50% della fase 5.2.2 con la soluzione di lavoro HEPES ottenuta nella fase 5.1 utilizzando una pipetta da 1.000 μL secondo le proporzioni indicate nella tabella 1.
      NOTA: Eseguire il passaggio 5 su un banco ultra pulito con le luci spente. Conservare la soluzione madre di iodixanolo aperta in frigorifero a 4 °C per prevenire la crescita batterica. Tenere la soluzione di iodixanolo e il tampone HEPES al riparo dalla luce.

6. Realizzazione di un sistema di centrifugazione a gradiente di densità

1. Modalità DGC dall'alto verso il basso
   1. Combinare 500 μL di soluzione di PBS/BEV isolata dalla fase 4 con 3 mL di PBS. Miscelare delicatamente le soluzioni utilizzando una pipetta da 1.000 μL per ottenere 3,5 mL di soluzione PBS/BEV.
   2. Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 31 mL su una piastra di schiuma forata ed etichettarla come "↓".
   3. Aggiungere verticalmente 3 mL della soluzione di iodixanolo al 50% sul fondo della provetta utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
   4. Inclinare il tubo a un angolo di 70° e posizionare un supporto per tubo o un altro supporto leggermente al di sopra del livello della piastra di schiuma, sotto l'apertura del tubo.
   5. Aggiungere 3 mL di soluzione di iodixanolo al 40% sopra la soluzione di iodixanolo al 50% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
   6. Aggiungere 3 mL di soluzione di iodixanolo al 20% sopra la soluzione di iodixanolo al 40% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
   7. Aggiungere 3 mL di soluzione di iodixanolo al 10% sopra la soluzione di iodixanolo al 20% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
   8. Aggiungere 3,5 mL di soluzione PBS/BEV del passaggio 6.1.1 sopra la soluzione di iodixanolo al 10% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
   9. Riportare delicatamente i tubi in posizione verticale.
      NOTA: Dopo il pipettaggio, la stratificazione deve essere visibile.
2. Modalità DGC dal basso verso l'alto
   1. Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 31 ml su una piastra di schiuma forata ed etichettarla come "↑".
   2. Aggiungere verticalmente 2,5 mL della soluzione madre di iodixanolo al 60% sul fondo della provetta. Miscelare delicatamente con 500 μL di soluzione PBS/BEV isolata dalla fase 4 utilizzando una pipetta da 1.000 μL per ottenere 3 mL di soluzione di iodixanolo/BEV al 50%.
   3. Inclinare il tubo a un angolo di 70° e posizionare un supporto per tubo o un altro supporto leggermente al di sopra del livello della piastra di schiuma, sotto l'apertura del tubo.
   4. Aggiungere 3 mL della soluzione di iodixanolo al 40% sopra la soluzione di iodixanolo/BEV al 50% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
   5. Aggiungere 3 mL della soluzione di iodixanolo al 20% sopra la soluzione di iodixanolo al 40% utilizzando una pipetta da 1000 μL.
   6. Aggiungere 3 mL della soluzione di iodixanolo al 10% sopra la soluzione di iodixanolo al 20% utilizzando una pipetta da 1000 μL.
   7. Aggiungere 3,5 mL di PBS sopra la soluzione di iodixanolo al 10% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
   8. Riportare delicatamente i tubi in posizione verticale.
   9. A questo punto sono rimasti 200 μL della sospensione ottenuta nella fase 4.17, che può essere analizzata successivamente come un gruppo chiamato "UC".
      NOTA: Quando si trasferiscono le soluzioni nella fase 6, tenere sempre il puntale della pipetta contro la parete della provetta per ultracentrifuga perpendicolare all'asse della provetta.

7. Centrifugazione a gradiente di densità e raccolta delle frazioni

1. Regolare il peso dei due tubi con PBS per ottenere un peso totale entro ± 0,005 g.
2. Mettere le provette nei secchi secondo il passaggio 4.5 e sottoporle a centrifugazione a 160.000 × g per 7 ore a 4 °C.
3. Raccogliere le frazioni utilizzando un pipettatore (1000 μL) dall'alto verso il basso contro la parete laterale nel seguente ordine: 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1,5 mL e 3 mL in una provetta per ultracentrifuga da 38,5 mL.
   NOTA: Mantenere la linea di vista allo stesso livello della superficie del liquido.
4. Eseguire l'ultracentrifugazione per ciascuna frazione ottenuta nella fase 7.3 secondo la fase 4 a 160.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
5. Rimuovere il surnatante e capovolgere le provette dell'ultracentrifuga per 5 min.
6. Risospendere i pellet in 200 μL di PBS pre-raffreddato (4 °C) utilizzando una pipetta da 200 μL.
7. Trasferire la soluzione PBS/BEV in una microprovetta pulita da 1,5 mL.
8. Etichettare le frazioni da F1 a F10 e analizzarle in base al passaggio 8.
   PUNTO DI PAUSA: Se i campioni ottenuti al punto 7.8 non possono essere processati immediatamente, conservarli a -80 °C.

8. Caratterizzazione e analisi quantitativa delle frazioni raccolte

1. Determinare i valori di assorbanza (OD 340 nm) di ciascuna frazione utilizzando un rivelatore per micropiastre con un controllo in bianco per calcolare la densità corrispondente.
   NOTA: Sostituire la soluzione PBS/BEV (passaggio 6.1.1 e passaggio 6.2.2) con PBS per stabilire un controllo vuoto.
   1. Preparare 100 μL ciascuno di soluzione di iodixanolo allo 0%, 5%, 10%, 12,5% e 20% diluita da HEPES 0,02 M a base di soluzione madre al 50% (passaggio 5.2.2) come standard, corrispondenti a densità rispettivamente di 1,0058 g/mL, 1,0318 g/mL, 1,058 g/mL, 1,0708 g/mL e 1,111 g/mL.
   2. Aggiungere 50 μL di ciascuna frazione dal controllo in bianco (preparato nella fase 7.3) e 50 μL di ciascuna soluzione standard (preparata nella fase 8.1.1) ai pozzetti duplicati di una piastra a 96 pozzetti.
   3. Impostare la lunghezza d'onda su 340 nm, misurare la densità ottica del punto finale e calcolare la densità di ciascuna frazione.
   4. Identifica F4-F9 come l'intervallo di frazioni BEV in base alla loro densità.
2. Determinare la concentrazione proteica delle frazioni BEV utilizzando il saggio dell'acido bicinchoninico (BCA).
   1. Diluire la sostanza dieci volte in PBS fornito dal produttore per preparare una soluzione proteica standard da 0,5 μg/μL.
   2. Aggiungere la soluzione proteica standard (preparata nella fase 8.2.1) con volumi variabili secondo le istruzioni del reagente e integrare ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con PBS fino a un volume totale di 20 μL.
   3. Aggiungere 20 μL dei campioni preparati nella fase 7.8 e i campioni rimasti dopo la UC definita nella fase 6.2.9 in ciascun pozzetto.
   4. Miscelare i reagenti A e B in un rapporto di 50:1 e trasferire 200 μL in ciascun pozzetto.
   5. Incubare la piastra a bagnomaria a 37 °C per 30 min.
   6. Misurare il valore di assorbanza utilizzando un lettore per micropiastre, calcolare la concentrazione proteica (μg/μL) e determinare il contenuto proteico (μg) dei campioni in base alla curva standard (x: densità ottica; y: concentrazione proteica) generata dai valori delle soluzioni standard diluite al punto 8.2.2.
3. Caratterizzare le frazioni di BEV definite nel passaggio 8.1.4 utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per verificare la presenza di BEV. Tutte le procedure riportate di seguito devono essere eseguite su ghiaccio.
   1. Applicare 10 μL di ciascuna frazione F4-F9 isolata del passaggio 7.8 e i campioni rimasti dopo l'UC definito nel passaggio 6.2.9 su griglie di rame supportate da formvar/carbonio per 20 minuti e tamponare con carta da filtro.
   2. Sciacquare i campioni con 100 μL di PBS tre volte per 1 minuto ciascuno e tamponare con carta da filtro.
   3. Fissare i campioni con 100 μL di glutaraldeide all'1% (p/v) per 5 minuti e tamponare con carta da filtro.
   4. Lavare le griglie con 100 μL di PBS dieci volte per 2 minuti ciascuna e tamponare con carta da filtro.
   5. Colorare le griglie con 50 μL di acetato di uranile all'1,5% (p/v) per 10 minuti e tamponare con carta da filtro.
      ATTENZIONE: L'acetato di uranile è radioattivo ed estremamente tossico se a contatto con la pelle o inalato. Maneggiare soluzioni con acetato di uranile in una cappa chimica e seguire le misure di sicurezza appropriate.
   6. Trasferire le griglie su una goccia di metilcellulosa all'1% (p/v) per 5 minuti e tamponare con carta da filtro.
   7. Conservare le griglie essiccate all'aria in un ambiente buio e privo di polvere fino all'osservazione.
   8. Acquisisci immagini e analizzale utilizzando un TEM.
4. Caratterizzare le frazioni BEV definite nel passaggio 8.1.4 utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per contare il numero di particelle.
   1. Calibrare il sistema utilizzando particelle di polistirene da 110 nm.
   2. Lavare il pool di campioni utilizzando PBS.
   3. Diluire i campioni delle diverse frazioni acquisite nella fase 7.8 e i campioni rimasti dopo la UC definita nella fase 6.2.9 a una concentrazione compresa tra 10⁵ e 10⁹ particelle/mL, con una concentrazione ottimizzata di 10⁷ particelle/mL.
   4. Registra e analizza in 11 posizioni con tre repliche, mantenendo la temperatura intorno ai 23-30 °C.
5. Analizzare il contenuto proteico dei campioni mediante colorazione blu brillante di Coomassie (CBBS) e western blotting (WB).
   1. Diluire i campioni BEV delle diverse frazioni ottenute nella fase 7.8 e i campioni rimasti dopo la UC definita nella fase 6.2.9 utilizzando PBS e tampone di carico a 5 × a una concentrazione finale di 0,5 o 1 μg/μL, se è necessaria la quantificazione, garantendo un carico sufficiente del campione di 20 μL (10 μg o 20 μg) di ciascun pozzetto nella fase 8.5.2. Far bollire i campioni a 95 °C per 10 min.
   2. Assemblare il gel di poliacrilammide prefabbricato nel serbatoio di elettroforesi e trasferire i campioni nei pozzetti.
   3. Eseguire l'elettroforesi verticale con i seguenti parametri: 160 V per 50 min.
   4. Colorare il gel nella soluzione blu brillante di Coomassie per 1 ora, risciacquare in acqua deionizzata fino a quando lo sfondo blu non si schiarisce e catturare le immagini con una fotocamera.
   5. Eseguire procedure di blotting proteico per altri gel con i seguenti parametri: 400 mA per 20 min.
   6. Bloccare le membrane di blotting con una soluzione di BSA al 5% (p/v) per 1 ora a temperatura ambiente.
   7. Lavare le membrane nel tampone TBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
   8. Incubare le membrane con anticorpi primari (marcatori BEV: LPS, OMPA, LTA; Marcatori EEV: CD63, CD9, TSG-101, Sintenina, Integrina β1; Altri marcatori di contaminazione: Flagellina, Calnexina) per 8-12 ore a 4 °C.
   9. Lavare le membrane nel tampone TBST tre volte per 10 minuti ciascuna.
   10. Incubare le membrane con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente.
   11. Eseguire il passaggio 8.5.9.
   12. Sviluppare il blotting utilizzando un apparecchio a chemiluminescenza.
   13. Sostituire la soluzione di PBS/BEV (passaggio 6.1.1 e passaggio 6.2.2) con BEV di Escherichia coli per stabilire un controllo positivo (vedere la tabella dei materiali per la procedura di isolamento dei BEV grezzi di E. coli) e condurre tutti gli esperimenti di cui sopra per la caratterizzazione dei BEV.
       PUNTO DI PAUSA: Determinare F6-F8 come distribuzione delle frazioni arricchite con BEV in base ai risultati della caratterizzazione sopra descritta per i BEV fecali e utilizzare questo intervallo ristretto per l'analisi successiva.
6. Calcolare i tassi di recupero in termini di particelle e proteine per valutare l'efficienza delle due modalità DGC. I risultati riportati di seguito sono presentati in percentuale.
   1. Calcolare i tassi di recupero delle particelle in modalità Top-down: particelle totali in F6-F8/particelle dopo UC definite al punto 6.2.9.
   2. Calcolare i tassi di recupero delle particelle in modalità Bottom-up: particelle totali in F6-F8/particelle dopo UC definite al punto 6.2.9.
   3. Calcolare i tassi di recupero delle proteine in modalità Top-down: contenuto proteico totale in F6-F8 (μg)/contenuto proteico dopo UC definito nel passaggio 6.2.9 (μg).
   4. Calcolare i tassi di recupero delle proteine in modalità Bottom-up: contenuto proteico totale in F6-F8 (μg)/contenuto proteico dopo UC definito al punto 6.2.9 (μg).
7. Calcolando il rapporto particelle/proteine per valutare la purezza tradizionalmente definita di UC e delle due modalità DGC, i risultati riportati di seguito sono stati tutti presentati in percentuale.
   1. Rapporto particelle/proteine dopo UC definito al punto 6.2.9: particelle dopo UC/contenuto proteico dopo UC (μg).
   2. Rapporto particelle/proteine in modalità Top-down: particelle totali in F6-F8/contenuto proteico in F6-F8 (μg).
   3. Rapporto particelle/proteine in modalità Bottom-up: particelle totali in F6-F8/contenuto proteico in F6-F8 (μg).
8. Selezionare la modalità di centrifugazione più adatta (la modalità top-down è stata selezionata nel protocollo) per la purificazione del BEV fecale e l'analisi futura.

Risultati

Determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con BEV
Per determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con vescicole extracellulari batteriche (BEV), è stato stabilito un controllo in bianco per misurare i valori di assorbanza a OD 340 nm e la densità di ciascuna frazione è stata calcolata in base alle misurazioni e alle linee guida sullo iodixanolo (Fase 8.1). La Tabella 2 presenta i risultati della densità, dimostrando che le frazioni da F4 a F9 hanno mostrato...

Discussione

Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanoparticelle a doppio strato lipidico secrete dai batteri, che trasportano una ricchezza di proteine, lipidi, acidi nucleici e altre molecole bioattive, contribuendo a mediare gli effetti funzionali dei batteri²⁰. È stato verificato che i BEV derivati dall'intestino sono coinvolti nello sviluppo di malattie, come la malattia infiammatoria intestinale, il morbo di Crohn e il cancro del colon-retto, e influenzano anche il metabolismo generale e me...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)	ACMEC	AP1126	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)	Sigma-Aldrich	M7027	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)	Polysciences	21447-25	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer)	Fdbio science	FD0030	Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading buffer	Fdbio science	FD006	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcohol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Surface disinfection
96-well plate	Rar	A8096	Measure the absorbance values
Anti-Calnexin antibody	Abcam	ab92573	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab134045	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibody	Abcam	ab236630	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibody	Sino Biological	40067-MM06	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibody	Abcam	ab30394	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibody	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibody	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibody	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibody	Abcam	ab133267	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibody	Abcam	ab125011	Western blotting (Primary Antibody)
Autoclave	ZEALWAY	GR110DP	Sterilization for supplies and mediums used in the experiment
Balance	Mettler Toledo	AL104	Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay	Fdbio science	FD2001	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRender	BioRender	https://app.biorender.com	Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinet	Haier	HR1200- II B2	Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000	Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence Apparatus	BIO-OI	OI600SE-MF	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5	BioTek	F01	Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values
Dil-labled low density lipoprotein	ACMEC	AC12038	Definition of distribution of interfering components
Electrophoresis equipment	Bio-rad	1658033	Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP	Fdbio science	FD8020	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).
Falcon tubes 50 mL	KIRGEN	KG2811	Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer	Absci	ab.001.50	Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paper	Biosharp	BS-TFP-070B	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powder	Meilunbio	MB6078	Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Fdbio science	FDR007	Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shaker	Qiangwen	DHZ-L	Cultivate Escherichia coli
Kimwipes™ Delicate Task Wipes	Kimtech Science	34155	Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB broth	Hopebio	HB0128	Cultivate Escherichia coli
Low temperature freezer (-80 °C)	Haier	DW-86L338J	Store the samples
Methanol	Alalddin	M116118	Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mL	KIRGEN	KG2211	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mL	KIRGEN	KG2911	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mL	BBI	F610888-0001	Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader	Thermo Fisher	Multiskan MK3	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μm	Merck millipore	SLGP033RB	Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Density gradient centrifugation solution
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	Density gradient centrifugation stock solution
Orbital Shaker	Youning	CS-100	Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered saline	Procell	PB180327	Dissolve feces at Step 2
Pipettor	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Transfer the solution
Plastic pasteur pipette	ABCbio	ABC217003-4	Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells	ACE	F15420Gel	Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluent	Fdbio science	FD0040	Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladder	Fdbio science	FD0672	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solution	UBIO	UW0500	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	369650	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powder	Fdbio science	FD1021	Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM)	Hitachi	H-7650	Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20	Fdbio science	FD0020	Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tube	Beckman	326823, 355642	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean bench	AIRTECH	SW-CJ-2FD	Peform the procedures about liquid handling
Water bath	Bluepard	CU600	Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7)	Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4