Isolamento e Purificação de Vesículas Extracelulares Bacterianas de Fezes Humanas Utilizando Centrifugação por Gradiente de Densidade

Resumo

Este estudo descreve um método para isolar e purificar vesículas extracelulares bacterianas (BEVs) enriquecidas de fezes humanas via centrifugação por gradiente de densidade (DGC), identifica as características físicas dos BEVs a partir da morfologia, tamanho de partícula e concentração, e discute as potenciais aplicações da abordagem DGC em pesquisa clínica e científica.

Resumo

As vesículas extracelulares bacterianas (BEVs) são nanovesículas derivadas de bactérias que desempenham um papel ativo na comunicação bactéria-bactéria e bactéria-hospedeiro, transferindo moléculas bioativas como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos herdados das bactérias mãe. Os BEVs derivados da microbiota intestinal têm efeitos dentro do trato gastrointestinal e podem atingir órgãos distantes, resultando em implicações significativas para a fisiologia e patologia. Investigações teóricas que explorem os tipos, quantidades e papéis de BEVs derivados de fezes humanas são cruciais para entender a secreção e a função de BEVs da microbiota intestinal. Essas investigações também requerem um aprimoramento na estratégia atual de isolamento e purificação de BEVs.

Este estudo otimizou o processo de isolamento e purificação de BEVs estabelecendo dois modos de centrifugação por gradiente de densidade (DGC): Top-down e Bottom-up. A distribuição enriquecida dos BEVs foi determinada nas frações 6 a 8 (F6-F8). A eficácia da abordagem foi avaliada com base na morfologia das partículas, tamanho, concentração e teor de proteínas. As taxas de recuperação de partículas e proteínas foram calculadas, e a presença de marcadores específicos foi analisada para comparar a recuperação e pureza dos dois modos de DGC. Os resultados indicaram que o modo de centrifugação Top-down apresentou menores níveis de contaminação e alcançou uma taxa de recuperação e pureza semelhante à do modo Bottom-up. Um tempo de centrifugação de 7 h foi suficiente para atingir uma concentração de BEV fecal de 10⁸/mg.

Além das fezes, este método pode ser aplicado a outros tipos de fluidos corporais com modificação adequada de acordo com as diferenças de componentes e viscosidade. Em conclusão, este protocolo detalhado e confiável facilitaria o isolamento e purificação padronizados de BEVs e, assim, estabeleceria uma base para análises multi-ômicas subsequentes e experimentos funcionais.

Introdução

O intestino é amplamente reconhecido como o órgão que abriga as comunidades microbianas mais abundantes no corpo humano, com mais de 90% das bactérias envolvidas na colonização e multiplicação ^1,2. Extensas evidências têm demonstrado que a microbiota intestinal modula o microambiente intestinal e, simultaneamente, interage com disfunção em órgãos distantes, principalmente através de uma barreira intestinal prejudicada ^3,4. Evidências crescentes indicam uma correlação entre o desequilíbrio da microbiota intestinal e a progressão da doença inflamatória intestinal (DII)^5,6, bem como distúrbios cognitivos através do eixo intestino-cérebro5,6,7,8. As vesículas extracelulares bacterianas (BEVs) produzidas por bactérias desempenham papéis significativos nesses processos patológicos.

BEVs são partículas em nanoescala que encapsulam derivados bacterianos, com diâmetros variando de 20 a 400 nm. Eles têm sido demonstrados para facilitar as interações entre bactérias e seus organismos hospedeiros ^9,10. Apesar de sua invisibilidade, essas partículas têm recebido cada vez mais atenção dos pesquisadores devido às suas amplas aplicações prospectivas como biomarcadores diagnósticos, alvos terapêuticos e veículos de liberação de fármacos¹¹. As fezes humanas, frequentemente usadas como bioespécimes para estudar BEVs, predominantemente provenientes de bactérias intestinais, contêm uma mistura complexa de água, bactérias, lipídios, proteínas, resíduos alimentares não digeridos e células epiteliais esfoliadas, entre outros. A intrincada composição fecal coloca desafios ao isolamento e pureza dos BEVs, impedindo uma análise abrangente, objetiva e realista dos BEVs. Assim, estratégias efetivas para minimizar a interferência de componentes contaminantes e aumentar o rendimento dos BEVs têm emergido como questões críticas que merecem atenção imediata.

As estratégias de isolamento existentes dependem em grande parte de técnicas como centrifugação em ultra-alta velocidade (UC), centrifugação por gradiente de densidade (DGC) e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)12,13,14,15,16,17. Atualmente, a DGC é um dos métodos mais amplamente aplicados no campo da separação de BEV, englobando dois modos de sedimentação-flutuação, "Top-down" e "Bottom-up", que são determinados pela posição de carregamento inicial da amostra. Essas metodologias diferenciam as vesículas extracelulares (EVs) de outros componentes com base nas disparidades de tamanho e densidade, produzindo taxas variáveis de pureza e recuperação. Pesquisas anteriores indicaram que estratégias de abordagem única são insuficientes para separar adequadamente os EVs das proteínas solúveis em amostras de fluido corporal, como a lipoproteína no sangue¹⁸ e a proteína Tamm-Horsfall na urina¹⁹. Além disso, a distribuição de tamanho das vesículas extracelulares (EEVs) eucarióticas frequentemente se sobrepõe à dos BEVs, necessitando de maiores aprimoramentos metodológicos para otimizar o rendimento do BEV. Consequentemente, o avanço do estudo dos BEVs depende do desenvolvimento de metodologias eficazes de separação e purificação. Notavelmente, Tulkens e cols.15 empregaram uma estratégia biofísica ortogonal para separar BEVs fecais de EEVs, na qual o tempo de centrifugação de um modo Bottom-up DGC foi de até¹⁸ h. Em contrapartida, este estudo reduziu para 7 h, economizando muito o tempo de gradiente-ultracentrifugação e simplificando o processo.

No presente estudo, isolamos e purificamos BEVs fecais empregando dois modos de DGC sob condições de tampão otimizadas, após enriquecer BEVs com uma faixa de velocidades de centrifugação diferencial, de baixa a extremamente alta velocidade. Avaliações baseadas em morfologia, tamanho de partícula e concentração indicaram um desempenho louvável por este método aprimorado. Este estudo poderia servir como base para pesquisas futuras, estendendo suas aplicações para um domínio mais amplo e oferecendo insights sobre a heterogeneidade dos BEVs dentro do corpo humano. Também contribui para a padronização das técnicas de separação e análise de BEV.

Protocolo

O Comitê de Ética do Hospital Nanfang, Southern Medical University, sancionou este estudo, que foi conduzido com o consentimento informado dos participantes. Todos os métodos aqui empregados seguiram as diretrizes operacionais padrão fornecidas pelas Normas Internacionais de Microbioma Humano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Todos os procedimentos subsequentes de manuseio de líquidos foram obrigados a serem realizados dentro de um gabinete de biossegurança ou uma bancada ultralimpa.

1. Coleta e aliquotação de amostras fecais

1. Distribua um amostrador de fezes, um saco selado e uma caixa gelada e forneça instruções abrangentes aos participantes sobre como adquirir e preservar as amostras.
2. Instrua cada participante a coletar sua amostra fecal usando o amostrador fornecido e a transportá-la para o laboratório a uma temperatura de 4 °C dentro de uma janela de 24 horas.
3. Após o recebimento no laboratório, use uma colher estéril para aliquotar menos de 3,5 g de fezes em um tubo de centrífuga pré-pesado de 50 mL. Anotar o peso da amostra fecal no tubo para procedimentos subsequentes de pré-tratamento.
   PONTO DE PAUSA: Se o processamento imediato das amostras não for viável, alocar a amostra para armazenamento a longo prazo a -80 °C após notação apropriada.

2. Preparo da amostra de fezes

1. Resfriar 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C. Filtrar o PBS pré-resfriado através de um filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 μm usando uma seringa de 50 mL em dez tubos de centrifugação de 50 mL.
2. Posicionar dois tubos de 50 mL sobre gelo, cada um contendo 3,5 g de amostras fecais. Adicionar 35 mL de PBS a cada tubo.
   NOTA: Calcular a quantidade necessária de PBS para a dissolução das fezes, garantindo uma concentração máxima da amostra de 10% (p/v). Se processar amostras adicionais, empregue mais tubos conforme necessário.
3. Agitar as amostras a 300 rpm durante 2 h a 4 °C ou colocá-las durante 8 h pelo menos a 4 °C até que as fezes estejam completamente suspensas visivelmente.

3. Centrifugação de velocidade diferencial

1. Resfriar a centrífuga refrigerada de alta velocidade a 4 °C.
2. Ajustar o peso dos dois tubos contendo as amostras preparadas na etapa 2.3 com PBS para atingir um peso total de 0,1 g.
3. Centrifugar as amostras a 3 000 × g durante 20 min a 4 °C.
4. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante em dois tubos de centrífuga limpos de 50 mL, deixando aproximadamente 1 mL acima do pellet. Utilize uma pipeta plástica descartável Pasteur para este processo.
5. Ajuste o peso dos dois tubos com PBS para atingir um peso total dentro de ± 0,1 g.
6. Centrifugar o sobrenadante transferido a 12 000 × g durante 30 min a 4 °C.
7. Aspirar o sobrenadante com uma seringa de 20 mL, remover a agulha da seringa e filtrá-la através de filtros de 0,22 μm em tubos de 50 mL. Nesse momento, o volume sobrenadante deve ser de aproximadamente 30 mL.
   NOTA: Se uma quantidade significativa de impureza ainda for visível após a centrifugação de 12.000 × g, é necessário repetir a etapa de centrifugação a 12.000 × g por 30 min a 4 °C. A falha em fazê-lo pode resultar em uma perda significativa de BEVs devido ao bloqueio dos poros durante a filtração.

4. Centrifugação de ultra-alta velocidade

1. Limpe o rotor e a caçamba limpando-os com álcool 75% (v/v) para eliminar qualquer contaminação residual.
2. Posicione um tubo ultracentrífugo de 38,5 mL no suporte do tubo.
   NOTA: Selecione o tubo de ultracentrífuga apropriado com base no volume da amostra. Evitar radiação ultravioleta e reagentes químicos inadequados para esterilização de tubos centrífugos, conforme indicado no manual do produto.
3. Transferir aproximadamente 30 mL do sobrenadante fecal filtrado do Passo 3.7 para o tubo de ultracentrífuga.
4. Preencher o tubo da ultracentrífuga com aproximadamente 8 mL de PBS, deixando uma folga de 3 mm da abertura do tubo.
5. Coloque os dois tubos de ultracentrífuga com as amostras em baldes de ultracentrifugação opostos, por exemplo, a caçamba 1 corresponde a 4 (1-4), 2-5, 3-6.
6. Ajuste o peso das duas caçambas com PBS para atingir um peso total dentro de ± 0,005 g.
7. Instale todas as caçambas no rotor, independentemente de os tubos estarem carregados.
8. Iniciar o vácuo e centrifugar as amostras a 160.000 × g durante 70 min a 4 °C.
9. Solte o vácuo da câmara e abra a porta assim que Ready for exibido na página inicial do instrumento.
10. Remova o rotor da ultracentrífuga.
11. Mova as caçambas do rotor para o rack e recupere os tubos usando um nipper.
12. Descarte o sobrenadante, que conterá pellets marrons visíveis na parte inferior.
13. Ressuspenda os pellets pipetando-os repetidamente para cima e para baixo usando uma pipeta de 1.000 μL com 1 mL de PBS pré-resfriado (4 °C) até a suspensão completa. Preencher o tubo com aproximadamente 37 mL de PBS, deixando uma folga de 3 mm da abertura.
14. Execute outra ultracentrifugação seguindo as etapas 4.5-4.11 a 160.000 × g por 70 min a 4 °C para remover componentes contaminantes parcialmente conectados das paredes do tubo.
15. Descarte o sobrenadante, inverta os dois tubos ultracentrífugos por 5 min e limpe qualquer solução restante na parede interna com limpadores.
    NOTA: A limpeza da parede interna minimiza a interferência da contaminação residual aderida à parede do tubo ultracentrífugo. Escolha limpadores que não influenciem a análise de BEV, especialmente no que diz respeito ao tamanho das partículas.
16. Ressuspenda os pellets em cada tubo pipetando-os para cima e para baixo com 1,2 mL de PBS pré-resfriado (4 °C) usando uma pipeta de 1.000 μL.
17. Transferir 1,2 ml da solução PBS/BEV de um tubo de ultracentrífuga para um microtubo limpo de 1,5 ml.
    PONTO DE PAUSA: A solução PBS/BEV coletada de um tubo de ultracentrífuga pode prosseguir para a Etapa 6. Conservar a solução do outro tubo a -80 °C.

5. Preparação da solução para centrifugação por gradiente de densidade

1. Preparação do tampão HEPES 0,02 M
   1. Combinar 0,477 g de pó de HEPES e 0,8 g de NaCl com 90 mL de água deionizada autoclavada.
   2. Ajustar o pH para 7,2 adicionando 1 M de hidróxido de sódio (NaOH). Levar o volume a 100 ml com água deionizada e filtrar a solução através de membranas de PES de 0,22 μm.
      CUIDADO: O hidróxido de sódio é um álcali cáustico forte. Os operadores devem manuseá-lo e prepará-lo cuidadosamente em um armário de fumos.
2. Preparação do tampão de gradiente de densidade
   1. Calcular o volume necessário de cada tampão de gradiente de densidade com base no número de tubos de ultracentrífuga para centrifugação por gradiente de densidade (Passo 6) (Neste protocolo, os volumes para soluções de gradiente de 60%, 50%, 40%, 20% e 10% foram de 2,5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 mL e 6 mL, respectivamente).
   2. Para a preparação de uma solução de trabalho de iodixanol a 50% (p/v), misturar o tampão HEPES 0,02 M e a solução-mãe de iodixanol a 60% (p/v) numa relação de volume de 1:5 (0,5 ml:2,5 ml).
      NOTA: Use uma seringa descartável de 20 mL para retirar a solução estoque de iodixanol e evitar a introdução de ar.
   3. Para preparar tampões de iodixanol com diferentes concentrações, combinar a solução de trabalho de iodixanol a 50% da Etapa 5.2.2 com o tampão HEPES obtido na Etapa 5.1 usando uma pipeta de 1.000 μL de acordo com as proporções mostradas na Tabela 1.
      NOTA: Execute a Etapa 5 em uma bancada ultralimpa com as luzes apagadas. Conservar a solução-mãe de iodixanol aberta no frigorífico a 4 °C para evitar o crescimento bacteriano. Mantenha a solução de iodixanol e o tampão HEPES protegidos da luz.

6. Estabelecimento de um sistema de centrifugação por gradiente de densidade

1. Modo DGC de cima para baixo
   1. Combinar 500 μL de solução de PBS/BEV isolada da Etapa 4 com 3 mL de PBS. Misturar suavemente as soluções utilizando uma pipeta de 1.000 μL para obter 3,5 ml de solução de PBS/BEV.
   2. Coloque um tubo de ultracentrífuga de 31 mL em uma placa de espuma com furos e rotule-o como "↓".
   3. Adicionar verticalmente 3 mL da solução de iodixanol a 50% ao fundo do tubo usando uma pipeta de 1.000 μL.
   4. Incline o tubo para um ângulo de 70° e posicione um suporte de tubo ou outro suporte ligeiramente acima do nível da placa de espuma, abaixo da abertura do tubo.
   5. Adicionar 3 mL de solução de iodixanol a 40% sobre a solução de iodixanol a 50% usando uma pipeta de 1.000 μL.
   6. Adicionar 3 ml de solução de iodixanol a 20% sobre a solução de iodixanol a 40% utilizando uma pipeta de 1.000 μL.
   7. Adicionar 3 mL de solução de iodixanol a 10% sobre a solução de iodixanol a 20% usando uma pipeta de 1.000 μL.
   8. Adicionar 3,5 ml de solução PBS/BEV do passo 6.1.1 sobre a solução de iodixanol a 10% utilizando uma pipeta de 1.000 μL.
   9. Retorne suavemente os tubos para uma posição vertical.
      NOTA: Após a pipetagem, a estratificação deve estar visível.
2. Modo DGC de baixo para cima
   1. Coloque um tubo de ultracentrífuga de 31 mL em uma placa de espuma com furos e rotule-o como "↑".
   2. Adicionar verticalmente 2,5 ml da solução-mãe de iodixanol a 60% ao fundo do tubo. Misturar suavemente com 500 μL de solução de PBS/BEV isolada da Etapa 4 usando uma pipeta de 1.000 μL para obter 3 mL de solução de iodixanol/BEV a 50%.
   3. Incline o tubo para um ângulo de 70° e posicione um suporte de tubo ou outro suporte ligeiramente acima do nível da placa de espuma, abaixo da abertura do tubo.
   4. Adicionar 3 ml da solução de iodixanol a 40% sobre a solução de iodixanol/BEV a 50% utilizando uma pipeta de 1.000 μL.
   5. Adicionar 3 ml da solução de iodixanol a 20% sobre a solução de iodixanol a 40% utilizando uma pipeta de 1000 μL.
   6. Adicionar 3 ml da solução de iodixanol a 10% sobre a solução de iodixanol a 20% utilizando uma pipeta de 1000 μL.
   7. Adicionar 3,5 mL de PBS sobre a solução de iodixanol a 10% usando uma pipeta de 1.000 μL.
   8. Retorne suavemente os tubos para uma posição vertical.
   9. Nesse momento, restaram 200 μL da suspensão obtida na Etapa 4.17, que pode ser analisada posteriormente como um grupo denominado "UC".
      NOTA: Ao transferir soluções no Passo 6, mantenha sempre a ponta da pipeta contra a parede do tubo ultracentrífuga perpendicular ao eixo do tubo.

7. Centrifugação por gradiente de densidade e coleta de frações

1. Ajuste o peso dos dois tubos com PBS para atingir um peso total dentro de ± 0,005 g.
2. Colocar os tubos nos baldes de acordo com o passo 4.5 e submetê-los à centrifugação a 160.000 × g durante 7 h a 4 °C.
3. Coletar as frações usando um pipetador (1000 μL) de cima para baixo contra a parede lateral na seguinte ordem: 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1,5 mL e 3 mL em um tubo de ultracentrífuga de 38,5 mL.
   NOTA: Mantenha a linha de visão no mesmo nível da superfície líquida.
4. Conduzir a ultracentrifugação para cada fração obtida na etapa 7.3 de acordo com a etapa 4 a 160.000 × g por 70 min a 4 °C.
5. Retire o sobrenadante e inverta os tubos ultracentrífugos por 5 min.
6. Ressuspender os pellets em 200 μL de PBS pré-resfriado (4 °C) usando uma pipeta de 200 μL.
7. Transfira a solução de PBS/BEV para um microtubo limpo de 1,5 ml.
8. Rotule as frações de F1 a F10 e analise-as com base na Etapa 8.
   PONTO DE PAUSA: Se as amostras obtidas na etapa 7.8 não puderem ser processadas imediatamente, armazená-las a -80 °C.

8. Caracterização e análise quantitativa das frações coletadas

1. Determinar os valores de absorbância (OD 340 nm) de cada fração usando um detector de microplacas com um controle em branco para calcular sua densidade correspondente.
   Observação : substitua a solução PBS/BEV (etapa 6.1.1 e etapa 6.2.2) com PBS para estabelecer um controle em branco.
   1. Preparar 100 μL cada de solução de iodixanol a 0%, 5%, 10%, 12,5% e 20% diluída por HEPES 0,02 M com base em solução estoque a 50% (Passo 5.2.2) conforme os padrões, correspondendo às densidades de 1,0058 g/mL, 1,0318 g/mL, 1,058 g/mL, 1,0708 g/mL e 1,111 g/mL, respectivamente.
   2. Adicionar 50 μL de cada fracção do controlo em branco (preparado no passo 7.3) e 50 μL de cada solução-padrão (preparado no passo 8.1.1) aos poços duplicados de uma placa de 96 poços.
   3. Ajuste o comprimento de onda para 340 nm, meça a densidade óptica do ponto final e calcule a densidade de cada fração.
   4. Identifique F4-F9 como a faixa de frações de BEV com base em sua densidade.
2. Determinar a concentração proteica das fracções de BEV utilizando o ensaio do ácido bicinconínico (BCA).
   1. Diluir a substância dez vezes em PBS fornecido pelo fabricante para preparar uma solução-padrão proteica de 0,5 μg/μL.
   2. Adicionar a solução-padrão proteica (preparada na etapa 8.2.1) com volumes variáveis de acordo com as instruções do reagente e complementar cada poço de uma placa de 96 poços com PBS até um volume total de 20 μL.
   3. Adicionar 20 μL das amostras preparadas na etapa 7.8 e as amostras deixadas após UC definida na etapa 6.2.9 em cada poço.
   4. Misturar os reagentes A e B na proporção de 50:1 e transferir 200 μL para cada poço.
   5. Incubar a placa em banho-maria a 37 °C durante 30 min.
   6. Medir o valor de absorbância utilizando um leitor de microplacas, calcular a concentração de proteínas (μg/μL) e determinar o teor de proteínas (μg) das amostras com base na curva padrão (x: densidade óptica; y: concentração de proteínas) gerada a partir dos valores das soluções-padrão diluídas na etapa 8.2.2.
3. Caracterizar as frações de BEV definidas na etapa 8.1.4 usando microscopia eletrônica de transmissão (MET) para verificar a presença de BEVs. Todos os procedimentos abaixo devem ser realizados no gelo.
   1. Aplicar 10 μL de cada fracção F4-F9 isolada do Passo 7.8 e das amostras deixadas após a UC definida no Passo 6.2.9 em grelhas de cobre suportadas com Formvar/Carbon durante 20 minutos e borrifar com papel de filtro.
   2. Enxaguar as amostras com 100 μL de PBS três vezes por 1 min cada, e borrifar com papel de filtro.
   3. Fixar as amostras com 100 μL de glutaraldeído a 1% (p/v) durante 5 min e borrifar com papel de filtro.
   4. Lave as grades com 100 μL de PBS dez vezes por 2 min cada, e borre com papel filtro.
   5. Manchar as grades com 50 μL de acetato de uranila a 1,5% (p/v) por 10 min e borrifar com papel de filtro.
      CUIDADO: O acetato de uranila é radioativo e extremamente tóxico quando em contato com a pele ou inalado. Manuseie soluções com acetato de uranila em um armário de fumaça e siga as medidas de segurança adequadas.
   6. Transfira as grades para uma gota de metilcelulose de 1% (p/v) por 5 min e borrife com papel de filtro.
   7. Guarde as grades secas ao ar em um ambiente escuro e livre de poeira até a observação.
   8. Capture imagens e analise-as usando um TEM.
4. Caracterizar as frações de BEV definidas na Etapa 8.1.4 usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para contar o número de partículas.
   1. Calibrar o sistema utilizando partículas de poliestireno de 110 nm.
   2. Lave o pool de amostras usando PBS.
   3. Diluir as amostras das diferentes fracções adquiridas na Etapa 7.8 e as amostras deixadas após a UC definida na Etapa 6.2.9 para uma concentração na gama de 10^{5-10 9} partículas/ml, com uma concentração otimizada de 10^{a 7} partículas/ml.
   4. Registrar e analisar em 11 posições com três repetições, mantendo a temperatura em torno de 23-30 °C.
5. Analisar o conteúdo proteico das amostras por coloração de azul brilhante de coomassie (CBBS) e western blotting (WB).
   1. Diluir as amostras de BEV das diferentes fracções obtidas na Etapa 7.8 e as amostras deixadas após a UC definida na Etapa 6.2.9 utilizando PBS e tampão de carga de 5 × para uma concentração final de 0,5 ou 1 μg/μL, se for necessária quantificação, garantindo uma carga suficiente da amostra de 20 μL (10 μg ou 20 μg) de cada poço na Etapa 8.5.2. Ferver as amostras a 95 °C durante 10 min.
   2. Montar o gel pré-fabricado de poliacrilamida no tanque de eletroforese e transferir as amostras para os poços.
   3. Realizar eletroforese vertical com os seguintes parâmetros: 160 V por 50 min.
   4. Manchar o gel em solução azul brilhante Coomassie por 1 h, enxaguar em água deionizada até que o fundo azul claree e capturar imagens com uma câmera.
   5. Realizar procedimentos de blotting de proteínas para outros géis com os seguintes parâmetros: 400 mA por 20 min.
   6. Bloquear as membranas de blotting com uma solução de BSA a 5% (p/v) durante 1 h à temperatura ambiente.
   7. Lave as membranas em tampão TBST três vezes por 5 min cada.
   8. Incubar as membranas com anticorpos primários (marcadores BEV: LPS, OMPA, LTA; Marcadores EEV: CD63, CD9, TSG-101, Sintenina, Integrina β1; Outros marcadores de contaminação: Flagelina, Calnexina) por 8-12 h a 4 °C.
   9. Lave as membranas em tampão TBST três vezes por 10 min cada.
   10. Incubar as membranas com anticorpos secundários durante 1 h à temperatura ambiente.
   11. Execute a etapa 8.5.9.
   12. Desenvolver o blotting usando um aparelho de quimioluminescência.
   13. Substitua a solução PBS/BEV (Passo 6.1.1 e Passo 6.2.2) por BEVs de Escherichia coli para estabelecer um controlo positivo (ver Tabela de Materiais para o procedimento de isolamento de E. coli-BEVs brutos) e conduzir todos os experimentos acima para caracterizar BEVs.
       PONTO DE PAUSA: Determinar F6-F8 como a distribuição das frações enriquecidas com BEV com base nos resultados da caracterização descrita acima para BEVs fecais e utilizar essa faixa estreita para análises subsequentes.
6. Calcular as taxas de recuperação em termos de partículas e proteínas para avaliar a eficiência dos dois modos DGC. Os resultados a seguir são apresentados em porcentagem.
   1. Calcular as taxas de recuperação de partículas no modo descendente: partículas totais em F6-F8/partículas após UC definidas na etapa 6.2.9.
   2. Calcular as taxas de recuperação de partículas no modo ascendente: partículas totais em F6-F8/partículas após UC definidas na Etapa 6.2.9.
   3. Calcular as taxas de recuperação de proteínas no modo Top-down: conteúdo total de proteínas em F6-F8 (μg)/teor de proteínas após UC definido na Etapa 6.2.9 (μg).
   4. Calcular as taxas de recuperação de proteínas no modo ascendente: conteúdo total de proteínas em F6-F8 (μg)/teor de proteínas após UC definido no Passo 6.2.9 (μg).
7. Calcule a relação partícula/proteína para avaliar a pureza tradicionalmente definida da RCU e dos dois modos de DGC, e os resultados abaixo foram todos apresentados como porcentagens.
   1. Relação partícula/proteína após RCU definida na etapa 6.2.9: partículas após UC/teor de proteínas após UC (μg).
   2. Relação partícula/proteína no modo Top-down: partículas totais em F6-F8/teor de proteína em F6-F8 (μg).
   3. Relação partícula/proteína no modo Bottom-up: partículas totais em F6-F8/teor de proteína em F6-F8 (μg).
8. Selecione o modo de centrifugação mais adequado (o modo Top-down foi selecionado no protocolo) para purificação fecal de BEV e análises futuras.

Resultados

Determinar a distribuição das frações enriquecidas com BEV
Para determinar a distribuição das frações enriquecidas com vesículas extracelulares bacterianas (BEVs), um controle em branco foi estabelecido para medir os valores de absorbância em OD 340 nm, e a densidade de cada fração foi calculada com base nas medidas e diretrizes de iodixanol (Passo 8.1). A Tabela 2 apresenta os resultados de densidade, demonstrando que as frações F4 a F9 exibiram densidades dentro da fai...

Discussão

As vesículas extracelulares bacterianas (VEB) são nanopartículas de bicamada lipídica secretadas por bactérias, carregando uma riqueza de proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e outras moléculas bioativas, contribuindo para mediar os efeitos funcionais das bactérias²⁰. Verificou-se que os BEVs derivados do intestino estão envolvidos no desenvolvimento de doenças, como doença inflamatória intestinal, doença de Crohn e câncer colorretal, além de afetar o metabolismo geral e mediar ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)	ACMEC	AP1126	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)	Sigma-Aldrich	M7027	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)	Polysciences	21447-25	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer)	Fdbio science	FD0030	Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading buffer	Fdbio science	FD006	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcohol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Surface disinfection
96-well plate	Rar	A8096	Measure the absorbance values
Anti-Calnexin antibody	Abcam	ab92573	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab134045	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibody	Abcam	ab236630	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibody	Sino Biological	40067-MM06	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibody	Abcam	ab30394	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibody	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibody	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibody	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibody	Abcam	ab133267	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibody	Abcam	ab125011	Western blotting (Primary Antibody)
Autoclave	ZEALWAY	GR110DP	Sterilization for supplies and mediums used in the experiment
Balance	Mettler Toledo	AL104	Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay	Fdbio science	FD2001	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRender	BioRender	https://app.biorender.com	Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinet	Haier	HR1200- II B2	Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000	Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence Apparatus	BIO-OI	OI600SE-MF	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5	BioTek	F01	Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values
Dil-labled low density lipoprotein	ACMEC	AC12038	Definition of distribution of interfering components
Electrophoresis equipment	Bio-rad	1658033	Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP	Fdbio science	FD8020	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).
Falcon tubes 50 mL	KIRGEN	KG2811	Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer	Absci	ab.001.50	Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paper	Biosharp	BS-TFP-070B	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powder	Meilunbio	MB6078	Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Fdbio science	FDR007	Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shaker	Qiangwen	DHZ-L	Cultivate Escherichia coli
Kimwipes™ Delicate Task Wipes	Kimtech Science	34155	Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB broth	Hopebio	HB0128	Cultivate Escherichia coli
Low temperature freezer (-80 °C)	Haier	DW-86L338J	Store the samples
Methanol	Alalddin	M116118	Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mL	KIRGEN	KG2211	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mL	KIRGEN	KG2911	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mL	BBI	F610888-0001	Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader	Thermo Fisher	Multiskan MK3	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μm	Merck millipore	SLGP033RB	Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Density gradient centrifugation solution
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	Density gradient centrifugation stock solution
Orbital Shaker	Youning	CS-100	Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered saline	Procell	PB180327	Dissolve feces at Step 2
Pipettor	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Transfer the solution
Plastic pasteur pipette	ABCbio	ABC217003-4	Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells	ACE	F15420Gel	Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluent	Fdbio science	FD0040	Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladder	Fdbio science	FD0672	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solution	UBIO	UW0500	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	369650	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powder	Fdbio science	FD1021	Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM)	Hitachi	H-7650	Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20	Fdbio science	FD0020	Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tube	Beckman	326823, 355642	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean bench	AIRTECH	SW-CJ-2FD	Peform the procedures about liquid handling
Water bath	Bluepard	CU600	Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7)	Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4