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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung und Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (BEVs), die aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation (DGC) angereichert wurden, identifiziert die physikalischen Eigenschaften von BEVs anhand von Morphologie, Partikelgröße und Konzentration und diskutiert die potenziellen Anwendungen des DGC-Ansatzes in der klinischen und wissenschaftlichen Forschung.

Zusammenfassung

Bakterielle extrazelluläre Vesikel (BEVs) sind Nanovesikel von Bakterien, die eine aktive Rolle bei der Kommunikation zwischen Bakterien und Bakterien spielen, indem sie bioaktive Moleküle wie Proteine, Lipide und Nukleinsäuren übertragen, die von den Mutterbakterien geerbt wurden. BEVs, die aus der Darmmikrobiota gewonnen werden, haben Wirkungen im Magen-Darm-Trakt und können entfernte Organe erreichen, was erhebliche Auswirkungen auf die Physiologie und Pathologie hat. Theoretische Untersuchungen, die die Arten, Mengen und Rollen von BEVs aus menschlichen Fäkalien untersuchen, sind entscheidend für das Verständnis der Sekretion und Funktion von BEVs aus der Darmmikrobiota. Diese Untersuchungen erfordern auch eine Verbesserung der aktuellen Strategie zur Isolierung und Reinigung von BEVs.

In dieser Studie wurde der Isolierungs- und Reinigungsprozess von BEVs optimiert, indem zwei Dichtegradientenzentrifugationsmodi (DGC) etabliert wurden: Top-down und Bottom-up. Die angereicherte Verteilung der BEVs wurde in den Fraktionen 6 bis 8 (F6-F8) bestimmt. Die Wirksamkeit des Ansatzes wurde anhand der Partikelmorphologie, der Größe, der Konzentration und des Proteingehalts bewertet. Die Partikel- und Proteinrückgewinnungsraten wurden berechnet und das Vorhandensein spezifischer Marker analysiert, um die Wiederfindung und Reinheit der beiden DGC-Modi zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Top-down-Zentrifugationsmodus geringere Kontaminationswerte aufwies und eine ähnliche Rückgewinnungsrate und Reinheit wie der Bottom-up-Modus erreichte. Eine Zentrifugationszeit von 7 h war ausreichend, um eine fäkale BEV-Konzentration von 108/mg zu erreichen.

Abgesehen von Fäkalien kann diese Methode auch auf andere Arten von Körperflüssigkeiten angewendet werden, wobei die entsprechenden Modifikationen entsprechend den Unterschieden in den Komponenten und der Viskosität durchgeführt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses detaillierte und zuverlässige Protokoll die standardisierte Isolierung und Aufreinigung von BEVs erleichtern und damit eine Grundlage für nachfolgende Multi-Omics-Analysen und funktionelle Experimente schaffen würde.

Einleitung

Der Darm gilt weithin als das Organ, das die am häufigsten vorkommenden mikrobiellen Gemeinschaften im menschlichen Körper beherbergt, wobei über 90 % der Bakterien an der Besiedlung und Vermehrung beteiligt sind 1,2. Es gibt umfangreiche Belege dafür, dass die Darmmikrobiota die Darmmikroumgebung moduliert und gleichzeitig mit Funktionsstörungen in entfernten Organen interagiert, vor allem durch eine gestörte Darmbarriere 3,4. Es gibt immer mehr Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen dem Ungleichgewicht der Darmmikrobiota und dem Fortschreiten von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED)5,6 sowie kognitiven Störungen über die Darm-Hirn-Achse 5,6,7,8. Bakterielle extrazelluläre Vesikel (BEVs), die von Bakterien produziert werden, spielen eine wichtige Rolle bei diesen pathologischen Prozessen.

BEVs sind nanoskalige Partikel, die bakterielle Derivate mit Durchmessern von 20 bis 400 nm verkapseln. Es wurde gezeigt, dass sie Interaktionen zwischen Bakterien und ihren Wirtsorganismen erleichtern 9,10. Trotz ihrer Unsichtbarkeit haben diese Partikel aufgrund ihrer potenziellen breiten Anwendung als diagnostische Biomarker, therapeutische Ziele und Vehikel zur Verabreichung von Medikamenten zunehmend die Aufmerksamkeit von Forschern auf sich gezogen11. Menschliche Fäkalien, die häufig als Bioproben für die Untersuchung von BEVs verwendet werden und überwiegend aus Darmbakterien stammen, enthalten unter anderem eine komplexe Mischung aus Wasser, Bakterien, Lipiden, Proteinen, unverdauten Nahrungsresten und abgeblätterten Epithelzellen. Die komplizierte Zusammensetzung der Fäkalien stellt eine Herausforderung für die Isolierung und Reinheit von BEVs dar und erschwert so eine umfassende, objektive und realistische Analyse von BEVs. Daher haben sich wirksame Strategien zur Minimierung von Störungen durch kontaminierende Komponenten und zur Steigerung der Ausbeute von BEVs als kritische Themen herausgestellt, die sofortige Aufmerksamkeit erfordern.

Bestehende Isolationsstrategien stützen sich weitgehend auf Techniken wie Ultrahochgeschwindigkeitszentrifugation (UC), Dichtegradientenzentrifugation (DGC) und Größenausschlusschromatographie (SEC)12,13,14,15,16,17. Derzeit ist DGC eine der am weitesten verbreiteten Methoden im Bereich der BEV-Trennung, die zwei Sedimentations-Schwimmmodi umfasst, "Top-down" und "Bottom-up", die durch die anfängliche Belastungsposition der Probe bestimmt werden. Diese Methoden unterscheiden extrazelluläre Vesikel (EVs) von anderen Komponenten auf der Grundlage von Größen- und Dichteunterschieden, was zu unterschiedlichen Reinheiten und Wiederfindungsraten führt. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Single-Approach-Strategien nicht ausreichen, um EVs angemessen von löslichen Proteinen in Körperflüssigkeitsproben wie Lipoprotein im Blut18 und Tamm-Horsfall-Protein im Urin19 zu trennen. Darüber hinaus überschneidet sich die Größenverteilung von eukaryotischen extrazellulären Vesikeln (EEVs) oft mit der von BEVs, was weitere methodische Verbesserungen zur Optimierung der BEV-Ausbeute erforderlich macht. Folglich hängt die Weiterentwicklung der Erforschung von BEVs von der Entwicklung effektiver Trenn- und Reinigungsmethoden ab. Bemerkenswert ist, dass Tulkens etal. 15 eine orthogonale biophysikalische Strategie zur Trennung von fäkalen BEVs von EEVs verwendeten, bei der die Zentrifugationszeit eines Bottom-up-DGC-Modus bis zu 18 h betrug. Im Gegensatz dazu reduzierte diese Studie sie auf 7 Stunden, was die Gradienten-Ultrazentrifugationszeit erheblich spart und den Prozess vereinfacht.

In der vorliegenden Studie haben wir fäkale BEVs unter Verwendung von zwei DGC-Modi unter optimierten Pufferbedingungen isoliert und gereinigt, nachdem wir BEVs mit einer Reihe von unterschiedlichen Zentrifugationsgeschwindigkeiten angereichert hatten, von niedriger bis extrem hoher Geschwindigkeit. Auswertungen auf der Grundlage von Morphologie, Partikelgröße und Konzentration zeigten eine lobenswerte Leistung dieser verbesserten Methode. Diese Studie könnte als Grundlage für zukünftige Forschungen dienen, ihre Anwendungen auf einen breiteren Bereich ausdehnen und Einblicke in die Heterogenität von BEVs im menschlichen Körper bieten. Es trägt auch zur Standardisierung von BEV-Trenn- und Analysetechniken bei.

Protokoll

Die Ethikkommission des Nanfang Krankenhauses der Southern Medical University genehmigte diese Studie, die mit der informierten Zustimmung der Teilnehmer durchgeführt wurde. Alle hier verwendeten Methoden entsprechen den Standard-Betriebsrichtlinien der International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle nachfolgenden Liquid-Handling-Verfahren mussten in einer Biosicherheitswerkbank oder einer Reinstbank durchgeführt werden.

1. Entnahme und Aliquotierung von Kotproben

  1. Verteilen Sie einen Stuhlprobenehmer, einen versiegelten Beutel und eine Eisbox und geben Sie den Teilnehmern umfassende Anweisungen zur Beschaffung und Konservierung der Proben.
  2. Weisen Sie jeden Teilnehmer an, seine Kotprobe mit dem bereitgestellten Probenehmer zu entnehmen und innerhalb eines 24-Stunden-Fensters bei einer Temperatur von 4 °C ins Labor zu transportieren.
  3. Nach Erhalt im Labor mit einem sterilen Löffel weniger als 3,5 g Kot in ein vorgewogenes 50-ml-Zentrifugenröhrchen aliquotieren. Notieren Sie das Gewicht der Kotprobe auf dem Röhrchen für nachfolgende Vorbehandlungsverfahren.
    PAUSENPUNKT: Wenn eine sofortige Verarbeitung der Proben nicht möglich ist, weisen Sie die Probe nach entsprechender Notation für die Langzeitlagerung bei -80 °C zu.

2. Vorbereitung der Kotproben

  1. 500 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 °C kalt stellen. Filtrieren Sie das vorgekühlte PBS durch einen 0,22 μm Polyethersulfon (PES)-Filter mit einer 50-ml-Spritze in zehn 50-ml-Zentrifugationsröhrchen.
  2. Positionieren Sie zwei 50-ml-Röhrchen mit jeweils 3,5 g Kotproben auf Eis. Geben Sie 35 ml PBS in jedes Röhrchen.
    HINWEIS: Berechnen Sie die erforderliche Menge an PBS für die Stuhlauflösung und stellen Sie eine maximale Probenkonzentration von 10 % (w/v) sicher. Wenn Sie zusätzliche Proben verarbeiten, verwenden Sie bei Bedarf mehr Röhrchen.
  3. Schütteln Sie die Proben bei 300 U/min für 2 h bei 4 °C oder legen Sie sie für 8 h mindestens bei 4 °C, bis der Kot vollständig sichtbar suspendiert ist.

3. Zentrifugation mit unterschiedlicher Drehzahl

  1. Die gekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifuge auf 4 °C abkühlen.
  2. Das Gewicht der beiden Röhrchen mit den in Schritt 2.3 mit PBS vorbereiteten Proben wird so eingestellt, dass ein Gesamtgewicht von 0,1 g erreicht wird.
  3. Die Proben werden bei 3.000 × g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert.
  4. Pipettieren Sie den Überstand vorsichtig in zwei saubere 50-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei Sie etwa 1 ml über dem Pellet lassen. Verwenden Sie für diesen Vorgang eine Einweg-Pasteurpipette aus Kunststoff.
  5. Passen Sie das Gewicht der beiden Röhrchen mit PBS an, um ein Gesamtgewicht innerhalb von ± 0,1 g zu erreichen.
  6. Der überführte Überstand wird bei 12.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
  7. Saugen Sie den Überstand mit einer 20-ml-Spritze an, entfernen Sie die Spritzennadel und filtrieren Sie ihn durch 0,22-μm-Filter in 50-ml-Röhrchen. Zu diesem Zeitpunkt sollte das überstehende Volumen etwa 30 ml betragen.
    HINWEIS: Wenn nach der Zentrifugation von 12.000 × g immer noch eine signifikante Menge an Verunreinigungen sichtbar ist, muss der Zentrifugationsschritt bei 12.000 × g für 30 min bei 4 °C wiederholt werden. Andernfalls kann es zu einem erheblichen Verlust von BEVs aufgrund von Porenverstopfungen während der Filtration kommen.

4. Ultra-Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation

  1. Reinigen Sie den Rotor und die Schaufel, indem Sie sie mit 75%igem Alkohol (v/v) abwischen, um alle verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen.
  2. Positionieren Sie ein 38,5-ml-Ultrazentrifugenröhrchen im Röhrchenhalter.
    HINWEIS: Wählen Sie das geeignete Ultrazentrifugenröhrchen basierend auf dem Probenvolumen aus. Vermeiden Sie ultraviolette Strahlung und ungeeignete chemische Reagenzien für die Sterilisation von Zentrifugalröhrchen, wie im Produkthandbuch angegeben.
  3. Etwa 30 ml des filtrierten Stuhlüberstandes aus Schritt 3.7 in das Ultrazentrifugenröhrchen überführen.
  4. Füllen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit ca. 8 ml PBS und lassen Sie dabei einen Abstand von 3 mm von der Öffnung des Röhrchens.
  5. Platzieren Sie die beiden Ultrazentrifugenröhrchen mit den Proben in gegenüberliegenden Ultrazentrifugationsbehältern, z. B. entspricht Eimer 1 4 (1-4), 2-5, 3-6.
  6. Passen Sie das Gewicht der beiden Eimer mit PBS an, um ein Gesamtgewicht innerhalb von ± 0,005 g zu erreichen.
  7. Montieren Sie alle Schaufeln auf dem Rotor, unabhängig davon, ob die Rohre beladen sind.
  8. Das Vakuum wird eingeleitet und die Proben bei 160.000 × g für 70 min bei 4 °C zentrifugiert.
  9. Lassen Sie das Kammervakuum los und öffnen Sie die Tür, sobald Bereit auf der Startseite des Geräts angezeigt wird.
  10. Entfernen Sie den Rotor aus der Ultrazentrifuge.
  11. Bewegen Sie die Eimer vom Rotor zum Gestell und entnehmen Sie die Röhrchen mit einer Zange.
  12. Entsorgen Sie den Überstand, der am Boden sichtbare braune Pellets enthält.
  13. Resuspendieren Sie die Pellets, indem Sie sie wiederholt mit einer 1.000-μl-Pipette mit 1 ml vorgekühltem (4 °C) PBS auf und ab pipettieren, bis sie vollständig suspendiert sind. Füllen Sie das Röhrchen mit ca. 37 ml PBS und lassen Sie dabei einen Abstand von 3 mm von der Öffnung.
  14. Führen Sie eine weitere Ultrazentrifugation gemäß den Schritten 4.5-4.11 bei 160.000 × g für 70 min bei 4 °C durch, um teilweise anhaftende kontaminierende Komponenten von den Röhrchenwänden zu entfernen.
  15. Entsorgen Sie den Überstand, drehen Sie die beiden Ultrazentrifugenröhrchen 5 Minuten lang um und entfernen Sie die Restlösung an der Innenwand mit Wischtüchern.
    HINWEIS: Die Reinigung der Innenwand minimiert die Beeinträchtigung durch Restverunreinigungen, die an der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens haften. Wählen Sie Abstreifer, die die BEV-Analyse nicht beeinflussen, insbesondere in Bezug auf die Partikelgröße.
  16. Resuspendieren Sie die Pellets in jedem Röhrchen, indem Sie sie mit 1,2 ml vorgekühltem (4 °C) PBS mit einer 1.000-μl-Pipette auf und ab pipettieren.
  17. 1,2 ml der PBS/BEV-Lösung aus einem Ultrazentrifugenröhrchen in ein sauberes 1,5-ml-Mikroröhrchen überführen.
    PAUSENPUNKT: Die PBS/BEV-Lösung, die aus einem Ultrazentrifugenröhrchen entnommen wurde, kann mit Schritt 6 fortfahren. Lagern Sie die Lösung aus dem anderen Röhrchen bei -80 °C.

5. Lösungsvorbereitung für die Dichtegradientenzentrifugation

  1. Herstellung von 0,02 M HEPES-Puffer
    1. Kombinieren Sie 0,477 g HEPES-Pulver und 0,8 g NaCl mit 90 ml autoklaviertem deionisiertem Wasser.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein, indem Sie 1 M Natriumhydroxid (NaOH) hinzufügen. Bringen Sie das Volumen mit deionisiertem Wasser auf 100 ml und filtern Sie die Lösung durch 0,22 μm PES-Membranen.
      ACHTUNG: Natriumhydroxid ist ein stark ätzendes Alkali. Die Bediener müssen es sorgfältig in einem Abzug handhaben und zubereiten.
  2. Herstellung von Dichtegradientenpuffer
    1. Berechnen Sie das erforderliche Volumen jedes Dichtegradientenpuffers basierend auf der Anzahl der Ultrazentrifugenröhrchen für die Dichtegradientenzentrifugation (Schritt 6) (In diesem Protokoll betrugen die Volumina für 60 %, 50 %, 40 %, 20 % und 10 % Gradientenlösungen 2,5 ml, 3 ml, 6 ml, 6 ml bzw. 6 ml).
    2. Für die Herstellung einer 50%igen (w/v) Iodixanol-Arbeitslösung wird der 0,02 M HEPES-Puffer und die 60%ige (w/v) Iodixanol-Stammlösung in einem Volumenverhältnis von 1:5 (0,5 ml:2,5 ml) gemischt.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine 20-ml-Einwegspritze, um die Iodixanol-Stammlösung zu entnehmen und das Einbringen von Luft zu vermeiden.
    3. Um Iodixanolpuffer mit unterschiedlichen Konzentrationen herzustellen, wird die 50%ige Iodixanol-Arbeitslösung aus Schritt 5.2.2 mit dem in Schritt 5.1 erhaltenen HEPES-Puffer unter Verwendung einer 1.000-μl-Pipette gemäß den in Tabelle 1 angegebenen Anteilen kombiniert.
      HINWEIS: Führen Sie Schritt 5 auf einer ultrareinen Bank bei ausgeschaltetem Licht durch. Lagern Sie die geöffnete Iodixanol-Stammlösung im Kühlschrank bei 4 °C, um Bakterienwachstum zu verhindern. Bewahren Sie die Iodixanollösung und den HEPES-Puffer lichtgeschützt auf.

6. Etablierung eines Dichtegradientenzentrifugationssystems

  1. Top-Down-DGC-Modus
    1. Kombinieren Sie 500 μl PBS/BEV-Lösung, isoliert aus Schritt 4, mit 3 ml PBS. Mischen Sie die Lösungen vorsichtig mit einer 1.000-μl-Pipette, um 3,5 ml PBS/BEV-Lösung zu erhalten.
    2. Stellen Sie ein 31-ml-Ultrazentrifugenröhrchen auf eine Schaumstoffplatte mit Löchern und beschriften Sie es mit "↓".
    3. Geben Sie 3 ml der 50%igen Iodixanollösung mit einer 1.000-μl-Pipette vertikal auf den Boden des Röhrchens.
    4. Kippen Sie das Rohr in einen Winkel von 70° und positionieren Sie einen Röhrchenhalter oder eine andere Halterung etwas oberhalb der Höhe der Schaumstoffplatte, unterhalb der Öffnung des Rohrs.
    5. Mit einer 1.000-μl-Pipette 3 ml 40%ige Iodixanollösung auf die 50%ige Iodixanollösung geben.
    6. Mit einer 1.000-μl-Pipette 3 ml 20%ige Iodixanollösung auf die 40%ige Iodixanollösung geben.
    7. Mit einer 1.000-μl-Pipette 3 ml 10%ige Iodixanol-Lösung auf die 20%ige Iodixanol-Lösung geben.
    8. Mit einer 1.000-μl-Pipette werden 3,5 ml PBS/BEV-Lösung aus Schritt 6.1.1 auf die 10%ige Iodixanollösung gegeben.
    9. Bringen Sie die Röhrchen vorsichtig wieder in eine aufrechte Position.
      HINWEIS: Nach dem Pipettieren sollte die Schichtung sichtbar sein.
  2. DGC-Modus von unten nach oben
    1. Stellen Sie ein 31-ml-Ultrazentrifugenröhrchen auf eine Schaumstoffplatte mit Löchern und beschriften Sie es mit "↑".
    2. Geben Sie 2,5 ml der 60%igen Iodixanol-Stammlösung vertikal auf den Boden des Röhrchens. Mischen Sie es vorsichtig mit 500 μl PBS/BEV-Lösung, die aus Schritt 4 isoliert wurde, mit einer 1.000-μl-Pipette, um 3 ml 50%ige Iodixanol/BEV-Lösung zu erhalten.
    3. Kippen Sie das Rohr in einen Winkel von 70° und positionieren Sie einen Röhrchenhalter oder eine andere Halterung etwas oberhalb der Höhe der Schaumstoffplatte, unterhalb der Öffnung des Rohrs.
    4. Mit einer 1.000-μl-Pipette werden 3 ml der 40%igen Iodixanol-Lösung auf die 50%ige Iodixanol/BEV-Lösung gegeben.
    5. Mit einer 1000-μl-Pipette werden 3 ml der 20%igen Iodixanollösung auf die 40%ige Iodixanollösung gegeben.
    6. Mit einer 1000-μl-Pipette werden 3 ml der 10%igen Iodixanol-Lösung auf die 20%ige Iodixanol-Lösung gegeben.
    7. Mit einer 1.000-μl-Pipette 3,5 ml PBS auf die 10%ige Iodixanollösung geben.
    8. Bringen Sie die Röhrchen vorsichtig wieder in eine aufrechte Position.
    9. Zu diesem Zeitpunkt waren noch 200 μl der in Schritt 4.17 erhaltenen Suspension übrig, die anschließend als Gruppe mit der Bezeichnung "UC" analysiert werden können.
      HINWEIS: Halten Sie beim Umfüllen von Lösungen in Schritt 6 die Pipettenspitze immer senkrecht zur Achse des Röhrchens an der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens.

7. Dichtegradientenzentrifugation und Fraktionssammlung

  1. Passen Sie das Gewicht der beiden Röhrchen mit PBS an, um ein Gesamtgewicht innerhalb von ± 0,005 g zu erreichen.
  2. Die Röhrchen werden gemäß Schritt 4.5 in die Eimer gegeben und bei 160.000 × g für 7 h bei 4 °C zentrifugiert.
  3. Sammeln Sie die Fraktionen mit einer Pipette (1000 μl) von oben nach unten an der Seitenwand in der folgenden Reihenfolge: 3 ml, 2 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1,5 ml und 3 ml in ein 38,5-ml-Ultrazentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Halten Sie die Sichtlinie auf der gleichen Höhe wie die Flüssigkeitsoberfläche.
  4. Die Ultrazentrifugation für jede in Schritt 7.3 erhaltene Fraktion wird gemäß Schritt 4 bei 160.000 × g für 70 min bei 4 °C durchgeführt.
  5. Entfernen Sie den Überstand und drehen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen für 5 Minuten um.
  6. Resuspendieren Sie die Pellets mit einer 200-μl-Pipette in 200 μl vorgekühltem (4 °C) PBS.
  7. Überführen Sie die PBS/BEV-Lösung in ein sauberes 1,5-ml-Mikroröhrchen.
  8. Beschriften Sie die Brüche von F1 bis F10 und analysieren Sie sie basierend auf Schritt 8.
    PAUSENPUNKT: Wenn die in Schritt 7.8 gewonnenen Proben nicht sofort verarbeitet werden können, lagern Sie sie bei -80 °C.

8. Charakterisierung und quantitative Analyse der gesammelten Fraktionen

  1. Bestimmen Sie die Absorptionswerte (OD 340 nm) jeder Fraktion mit einem Mikroplattendetektor mit einer Blindkontrolle, um die entsprechende Dichte zu berechnen.
    HINWEIS: Ersetzen Sie die PBS/BEV-Lösung (Schritt 6.1.1 und Schritt 6.2.2) durch PBS, um ein leeres Steuerelement einzurichten.
    1. Bereiten Sie jeweils 100 μl 0-, 5-, 10-, 12,5- und 20%ige Iodixanollösung, verdünnt mit 0,02 M HEPES, basierend auf 50%iger Stammlösung (Schritt 5.2.2) als Standards vor, entsprechend Dichten von 1,0058 g/ml, 1,0318 g/ml, 1,058 g/ml, 1,0708 g/ml bzw. 1,111 g/ml.
    2. Fügen Sie 50 μl jeder Fraktion aus der Blindkontrolle (vorbereitet in Schritt 7.3) und 50 μl jeder Standardlösung (hergestellt in Schritt 8.1.1) hinzu, um die Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu duplizieren.
    3. Stellen Sie die Wellenlänge auf 340 nm ein, messen Sie die optische Dichte des Endpunkts und berechnen Sie die Dichte jeder Fraktion.
    4. Identifizieren Sie F4-F9 als den Bereich der BEV-Fraktionen basierend auf ihrer Dichte.
  2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der BEV-Fraktionen mit dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA).
    1. Verdünnen Sie die Substanz in PBS des Herstellers um das Zehnfache, um eine 0,5 μg/μl Standardproteinlösung herzustellen.
    2. Die Standardproteinlösung (hergestellt in Schritt 8.2.1) wird mit unterschiedlichen Volumina gemäß den Reagenzanweisungen zugegeben und jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit PBS zu einem Gesamtvolumen von 20 μl ergänzt.
    3. In jede Vertiefung werden 20 μl der in Schritt 7.8 vorbereiteten Proben und der nach der in Schritt 6.2.9 definierten UC verbleibenden Proben gegeben.
    4. Mischen Sie die Reagenzien A und B in einem Verhältnis von 50:1 und geben Sie 200 μl in jede Vertiefung.
    5. Die Platte im 37 °C warmen Wasserbad 30 min inkubieren.
    6. Messen Sie den Absorptionswert mit einem Mikroplatten-Reader, berechnen Sie die Proteinkonzentration (μg/μl) und bestimmen Sie den Proteingehalt (μg) der Proben auf der Grundlage der Standardkurve (x: optische Dichte; y: Proteinkonzentration), die aus den Werten der in Schritt 8.2.2 verdünnten Standardlösungen generiert wird.
  3. Charakterisierung der in Schritt 8.1.4 definierten BEV-Fraktionen mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), um das Vorhandensein von BEVs zu überprüfen. Alle folgenden Verfahren sollten auf Eis durchgeführt werden.
    1. Tragen Sie 10 μl jeder isolierten F4-F9-Fraktion aus Schritt 7.8 und die nach der in Schritt 6.2.9 definierten UC verbleibenden Proben 20 Minuten lang auf Formvar/Carbon-gestützte Kupfergitter auf und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
    2. Spülen Sie die Proben dreimal für jeweils 1 Minute mit 100 μl PBS ab und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
    3. Fixieren Sie die Proben mit 100 μl 1%igem Glutaraldehyd für 5 Minuten und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
    4. Waschen Sie die Gitter zehnmal für jeweils 2 Minuten mit 100 μl PBS und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
    5. Färben Sie die Gitter 10 Minuten lang mit 50 μl 1,5 % (w/v) Uranylacetat und tupfen Sie sie mit Filterpapier ab.
      ACHTUNG: Uranylacetat ist radioaktiv und extrem giftig, wenn es mit der Haut in Berührung kommt oder eingeatmet wird. Behandeln Sie Lösungen mit Uranylacetat in einem Abzug und befolgen Sie die entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen.
    6. Die Gitter für 5 min auf einen 1%igen (w/v) Methylcellulosetropfen geben und mit Filterpapier abtupfen.
    7. Lagern Sie die luftgetrockneten Gitter bis zur Beobachtung in einer dunklen, staubfreien Umgebung.
    8. Erfassen Sie Bilder und analysieren Sie sie mit einem TEM.
  4. Charakterisieren Sie die in Schritt 8.1.4 definierten BEV-Fraktionen mithilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), um die Anzahl der Partikel zu zählen.
    1. Kalibrieren Sie das System mit 110-nm-Polystyrolpartikeln.
    2. Waschen Sie den Probenpool mit PBS.
    3. Die Proben aus verschiedenen Fraktionen, die in Schritt 7.8 entnommen wurden, und die Proben, die nach der in Schritt 6.2.9 definierten UC übrig geblieben sind, werden auf eine Konzentration im Bereich von 105 bis 109 Partikel/ml mit einer optimierten Konzentration von 107 Partikeln/ml verdünnt.
    4. Aufzeichnen und Analysieren an 11 Positionen mit drei Wiederholungen, wobei die Temperatur bei etwa 23-30 °C gehalten wird.
  5. Analysieren Sie die Proteingehalte der Proben mittels Coomassie-Brillantblau-Färbung (CBBS) und Western Blotting (WB).
    1. Die BEV-Proben aus verschiedenen Fraktionen, die in Schritt 7.8 erhalten wurden, und die Proben, die nach der in Schritt 6.2.9 definierten UC übrig geblieben sind, werden unter Verwendung von PBS und 5 × Ladepuffer auf eine Endkonzentration von 0,5 oder 1 μg/μl verdünnt, falls eine Quantifizierung erforderlich ist, wobei eine ausreichende Probenbeladung von 20 μl (10 μg oder 20 μg) jeder Vertiefung in Schritt 8.5.2 sichergestellt wird. Die Proben werden bei 95 °C für 10 min gekocht.
    2. Montieren Sie das vorgefertigte Polyacrylamid-Gel in den Elektrophoresetank und überführen Sie die Proben in die Vertiefungen.
    3. Führen Sie eine vertikale Elektrophorese mit folgenden Parametern durch: 160 V für 50 min.
    4. Färben Sie das Gel 1 Stunde lang in Coomassie-Brillantblaulösung, spülen Sie es in deionisiertem Wasser ab, bis sich der blaue Hintergrund aufhellt, und nehmen Sie Bilder mit einer Kamera auf.
    5. Durchführen von Protein-Blotting-Verfahren für andere Gele mit den folgenden Parametern: 400 mA für 20 min.
    6. Blockieren Sie die Blotting-Membranen mit einer 5%igen (w/v) BSA-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur.
    7. Waschen Sie die Membranen dreimal im TBST-Puffer für jeweils 5 Minuten.
    8. Inkubieren Sie die Membranen mit Primärantikörpern (BEV-Marker: LPS, OmpA, LTA; EEV-Marker: CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1; Andere Kontaminationsmarker: Flagellin, Calnexin) für 8-12 h bei 4 °C.
    9. Waschen Sie die Membranen dreimal im TBST-Puffer für jeweils 10 Minuten.
    10. Inkubieren Sie die Membranen mit Sekundärantikörpern für 1 h bei Raumtemperatur.
    11. Führen Sie Schritt 8.5.9 aus.
    12. Entwickeln Sie das Blotting mit einer Chemilumineszenz-Apparatur.
    13. Ersetzen Sie PBS/BEV-Lösung (Schritt 6.1.1 und Schritt 6.2.2) durch BEVs aus Escherichia coli, um eine Positivkontrolle herzustellen (siehe Materialtabelle für das Verfahren zur Isolierung von rohen E. coli-BEVs), und führen Sie alle oben genannten Experimente zur Charakterisierung von BEVs durch.
      PAUSENPUNKT: Bestimmen Sie F6-F8 als Verteilung der BEV-angereicherten Fraktionen basierend auf den Ergebnissen der oben beschriebenen Charakterisierung für fäkale BEVs und verwenden Sie diesen eingeengten Bereich für die anschließende Analyse.
  6. Berechnen Sie die Rückgewinnungsraten in Bezug auf Partikel und Proteine, um die Effizienz der beiden DGC-Modi zu bewerten. Die folgenden Ergebnisse sind in Prozent angegeben.
    1. Berechnen Sie die Rückgewinnungsraten von Partikeln im Top-Down-Modus: Gesamtpartikel in F6-F8/Partikel nach UC, die in Schritt 6.2.9 definiert wurden.
    2. Berechnen Sie die Rückgewinnungsraten von Partikeln im Bottom-up-Modus: Gesamtpartikel in F6-F8/Partikel nach UC definiert in Schritt 6.2.9.
    3. Berechnen Sie die Wiederfindungsraten von Proteinen im Top-Down-Modus: Gesamtproteingehalte in F6-F8 (μg)/Proteingehalt nach UC definiert in Schritt 6.2.9 (μg).
    4. Berechnen Sie die Wiederfindungsraten von Proteinen im Bottom-up-Modus: Gesamtproteingehalt in F6-F8 (μg)/Proteingehalt nach UC definiert in Schritt 6.2.9 (μg).
  7. Berechnen Sie das Partikel-Protein-Verhältnis, um die Reinheit zu bewerten, die traditionell für UC und die beiden DGC-Modi definiert ist, und die folgenden Ergebnisse wurden alle als Prozentsätze dargestellt.
    1. Partikel/Protein-Verhältnis nach UC definiert in Schritt 6.2.9: Partikel nach UC/Proteingehalt nach UC (μg).
    2. Partikel/Protein-Verhältnis im Top-Down-Modus: Gesamtpartikel in F6-F8/Proteingehalt in F6-F8 (μg).
    3. Partikel/Protein-Verhältnis im Bottom-up-Modus: Gesamtpartikel in F6-F8/Proteingehalt in F6-F8 (μg).
  8. Wählen Sie den am besten geeigneten Zentrifugationsmodus (im Protokoll wurde der Top-Down-Modus ausgewählt) für die fäkale BEV-Aufreinigung und zukünftige Analyse.

Ergebnisse

Bestimmung der Verteilung von BEV-angereicherten Fraktionen
Um die Verteilung der mit bakteriellen extrazellulären Vesikeln (BEVs) angereicherten Fraktionen zu bestimmen, wurde eine Blindkontrolle zur Messung der Absorptionswerte bei OD 340 nm etabliert und die Dichte jeder Fraktion basierend auf den Messungen und den Iodixanol-Richtlinien berechnet (Schritt 8.1). Tabelle 2 zeigt die Dichteergebnisse, die zeigen, dass die Fraktionen F4 bis F9 Dichten innerhalb des Bereichs aufwiesen,...

Diskussion

Bakterielle extrazelluläre Vesikel (BEVs) sind Lipid-Doppelschicht-Nanopartikel, die von Bakterien abgesondert werden und eine Fülle von Proteinen, Lipiden, Nukleinsäuren und anderen bioaktiven Molekülen tragen, die zur Vermittlung der funktionellen Wirkungen von Bakterien beitragen20. Es wurde nachgewiesen, dass aus dem Darm gewonnene BEVs an der Entwicklung von Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Darmkrebs beteiligt sind, den allgemeinen Stoffwechsel beeinflusse...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine entgegenstehenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); das Schlüsselprojekt der National Natural Science Foundation of China (82230080); das National Key F&E-Programm Chinas (2021YFA1300604); die National Natural Science Foundation of China (81871735, 82272438 und 82002245); Guangdong Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (2023B1515020058); die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Guangdong (2021A1515011639); das Major State Basic Research Development Program der Natural Science Foundation der Provinz Shandong in China (ZR2020ZD11); die Postdoktoranden-Wissenschaftsstiftung (2022M720059); das Outstanding Youths Development Scheme des Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)ACMECAP1126Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)Sigma-AldrichM7027Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)Polysciences21447-25Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL PipetteKIRGENKG1313, KG1212, KG1011Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer)Fdbio scienceFD0030Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading bufferFdbio scienceFD006Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcoholLIRCONLIRCON-500 mLSurface disinfection
96-well plateRarA8096Measure the absorbance values 
Anti-Calnexin antibodyAbcamab92573Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibodyAbcamab134045Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibodyAbcamab236630Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibodySino Biological40067-MM06Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibodyAbcamab30394Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibodyThermo FisherMA1-83152Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibodyThermo Fisher MA1-7402Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibodyCUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibodyAbcamab133267Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibodyAbcamab125011Western blotting (Primary Antibody)
AutoclaveZEALWAYGR110DPSterilization for supplies and mediums used in the experiment
BalanceMettler ToledoAL104Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay Fdbio scienceFD2001Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRenderBioRenderhttps://app.biorender.comMake the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinetHaierHR1200- II B2Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38Eppendorf5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence ApparatusBIO-OIOI600SE-MFUsed in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5BioTekF01Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values 
Dil-labled low density lipoproteinACMECAC12038Definition of distribution of interfering components 
Electrophoresis equipmentBio-rad1658033Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP Fdbio scienceFD8020Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli American Type Culture CollectionATCC8739Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).    
Falcon tubes 50 mLKIRGENKG2811Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining BufferAbsciab.001.50Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paperBiosharpBS-TFP-070BMorphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids Sigma-AldrichTEM-FCF200CU50Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powderMeilunbioMB6078Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Fdbio scienceFDM007Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fdbio scienceFDR007Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shakerQiangwenDHZ-LCultivate Escherichia coli 
Kimwipes™ Delicate Task WipesKimtech Science34155Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB brothHopebioHB0128Cultivate Escherichia coli 
Low temperature freezer (-80 °C)HaierDW-86L338JStore the samples
MethanolAlalddinM116118Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mLKIRGENKG2211Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mLKIRGENKG2911Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mLBBIF610888-0001Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader Thermo Fisher Multiskan MK3Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μmMerck milliporeSLGP033RBFiltration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaClGHTECH1.01307.040Density gradient centrifugation solution
NaOHGHTECH1.01394.068Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100Beckman CoulterA94469Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™Serumwerk Bernburg AG1893Density gradient centrifugation stock solution
Orbital ShakerYouningCS-100Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered salineProcellPB180327Dissolve feces at Step 2
PipettorEppendorf3120000267, 3120000259Transfer the solution
Plastic pasteur pipetteABCbioABC217003-4Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranesMilliporeISEQ00010, IPVH00010Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 WellsACEF15420GelUsed in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluentFdbio scienceFD0040Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladderFdbio scienceFD0672Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solutionUBIOUW0500Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter369650Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL JetwayZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mLTransfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powderFdbio scienceFD1021Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM)Hitachi H-7650Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20Fdbio scienceFD0020Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tubeBeckman326823, 355642Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean benchAIRTECHSW-CJ-2FDPeform the procedures about liquid handling
Water bathBluepardCU600Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaViewParticle MetrixS/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7)Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4

Referenzen

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