Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В этом исследовании описывается метод выделения и очистки бактериальных внеклеточных везикул (БЭВ), обогащенных из фекалий человека с помощью центрифугирования с градиентом плотности (ДГК), определяются физические характеристики БЭВ с точки зрения морфологии, размера частиц и концентрации, а также обсуждаются потенциальные применения подхода ДГК в клинических и научных исследованиях.
Бактериальные внеклеточные везикулы (БЭВ) — это нановезикулы, полученные из бактерий, которые играют активную роль в коммуникации бактерии-бактерии и бактерии-хозяина, перенося биологически активные молекулы, такие как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, унаследованные от родительских бактерий. БЭВ, полученные из микробиоты кишечника, оказывают воздействие на желудочно-кишечный тракт и могут достигать отдаленных органов, что приводит к значительным последствиям для физиологии и патологии. Теоретические исследования, изучающие типы, количества и роль БЭВ, полученных из фекалий человека, имеют решающее значение для понимания секреции и функции БЭВ из микробиоты кишечника. Эти исследования также требуют совершенствования существующей стратегии по изоляции и очистке БЭВ.
В этом исследовании оптимизирован процесс изоляции и очистки электромобилей путем установления двух режимов центрифугирования с градиентом плотности (DGC): сверху вниз и снизу вверх. Обогащенное распределение БЭВ определяли во фракциях от 6 до 8 (F6-F8). Эффективность подхода оценивалась на основе морфологии частиц, размера, концентрации и содержания белка. Были рассчитаны скорости извлечения частиц и белков, а также проанализировано наличие специфических маркеров для сравнения восстановления и чистоты двух режимов ДГК. Результаты показали, что режим центрифугирования «Сверху вниз» имеет более низкие уровни загрязнения и обеспечивает скорость восстановления и чистоту, аналогичные режиму «Снизу вверх». Время центрифугирования 7 ч было достаточным для достижения концентрации фекальных БЭВ 108/мг.
Помимо фекалий, этот метод может быть применен и к другим типам жидкостей организма с соответствующей модификацией в соответствии с различиями в компонентах и вязкости. В заключение, этот подробный и надежный протокол облегчит стандартизированную изоляцию и очистку БЭВ и, таким образом, заложит основу для последующего мультиомиксного анализа и функциональных экспериментов.
Кишечник широко признан органом, содержащим самые многочисленные микробные сообщества в организме человека, причем более 90% бактерий участвуют в колонизации и размножении 1,2. Обширные данные свидетельствуют о том, что микробиота кишечника модулирует микроокружение кишечника и одновременно взаимодействует с дисфункцией отдаленных органов, в первую очередь через нарушение кишечного барьера 3,4. Появляется все больше данных, указывающих на корреляцию между дисбалансом микробиоты кишечника и прогрессированием воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК)5,6....
Комитет по этике больницы Наньфан Южного медицинского университета санкционировал это исследование, которое проводилось с информированного согласия участников. Все методы, используемые в настоящем документе, соответствуют стандартным операционным рекомендациям, предоставленным Международными стандартами микробиома человека (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Все последующие процедуры по работе с жидкостями должны выполняться в шкафу биобезопасности или на сверхчистом стенде.
1. Сбор и аликвотирование проб фекалий
Определение распределения фракций, обогащенных BEV
Для определения распределения фракций, обогащенных внеклеточными везикулами бактерий (БЭВ), был установлен холостой контроль для измерения значений абсорбции при ОД 340 нм, а плотность каждой фракции рассчитывалась на основе.......
Бактериальные внеклеточные везикулы (БЭВ) представляют собой липидно-бислойные наночастицы, секретируемые бактериями, несущие множество белков, липидов, нуклеиновых кислот и других биологически активных молекул, способствующих опосредованию функциональных эффектов бактерий
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда для выдающихся молодых ученых (82025024); Ключевой проект Национального фонда естественных наук Китая (82230080); Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (2021YFA1300604); Национальный фонд естественных наук Китая (81871735, 82272438 и 82002245); Гуандунский фонд естественных наук для выдающихся молодых ученых (2023B1515020058); Фонд естественных наук провинции Гуандун (2021A1515011639); Крупная государственная программа развития фундаментальных исследований Фонда естественных нау....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены