Aşırı Kullanıma Bağlı Tendinopatinin In Vivo Modeli için Pasif Ayak Bileği Dorsifleksiyon Test Sistemi

Özet

Bu protokol, aşırı kullanıma bağlı tendinopatinin in vivo bir modeli için bir sıçan Aşil tendonunda ölçülebilir ve kontrollü yorgunluk yaralanmalarını indüklemek için kullanılan bir test sistemi sunar. Prosedür, sıçanın ayak bileğini, özel olarak yazılmış bir MATLAB komut dosyası ile pasif ayak bileği dorsifleksiyonu gerçekleştiren bir eklem aktüatörüne sabitlemekten oluşur.

Özet

Tendinopati, ağrı ve fonksiyon kaybı ile sonuçlanan kronik bir tendon rahatsızlığıdır ve tendonun tekrar tekrar aşırı yüklenmesi ve sınırlı iyileşme süresinden kaynaklanır. Bu protokol, sıçan Aşil tendonuna pasif dorsifleksiyon yoluyla mekanik yükleri döngüsel olarak uygulayan bir test sistemini açıklar. Özel olarak yazılmış kod, geri besleme kontrolüne dayalı döngüsel yorulma yükleme rejimi ile birlikte yükleme protokolünün etkilerini değerlendirmek için döngü öncesi ve sonrası yükleme ölçümlerinden oluşur.

Bu çalışma için 25 Sprague-Dawley sıçan kullandık ve grup başına 5 sıçan 500, 1,000, 2,000, 3,600 veya 7,200 döngü yorgunluk yükü aldı. Histerezis, pik gerilme ve yükleme ve boşaltma modüllerinin döngü öncesi ve sonrası yükleme ölçümleri arasındaki yüzde farkları hesaplandı. Sonuçlar, sistemin uygulanan yüklerin sayısına bağlı olarak Aşil tendonunda değişen derecelerde hasara neden olabileceğini göstermektedir. Bu sistem, yorgunluğa bağlı aşırı kullanım tendon yaralanmasının in vivo bir modeli için Aşil tendonuna niceliksel ve fizyolojik değişen derecelerde döngüsel yükler uygulamak için yenilikçi bir yaklaşım sunar.

Giriş

Tendonlar kası kemiğe bağladığından ve yaşamları boyunca günlük tekrarlayan hareketler yaşadığından, ağrılı ve sınırlayıcı olan ve nüfusun %30-50'sini etkileyen mekanik fonksiyonun bozulmasına neden olan aşırı kullanım yaralanmalarına oldukça yatkındırlar¹. Tendinopatiler, tekrarlayan yorgunluk hareketleri ve yaralanma öncesi seviyelere yetersiz iyileşme nedeniyle aşırı kullanım yaralanmaları olarak kabul edilen kronik durumlardır. Rotator manşet, dirsek, Aşil tendonu ve patellar tendon 2,3,4,5 dahil olmak üzere hem üst hem de alt ekstremiteler yaygın olarak etkilenir. Aşil tendinopatisi, koşu ve atlamayı içeren aktivitelerde, özellikle atletizm, orta ve uzun mesafe koşuları, tenis ve diğer top sporlarıyla uğraşan sporcularda yaygındır ve koşucuların %7-9'unu etkiler ^6,7. Koşma ve zıplamadan kaynaklanan yaralanmalar da Aşil ve patellar tendinopatiler için bir risk faktörü olan sınırlı ayak bileği dorsifleksiyonuna neden olabilir ^8,9,10. Bu nedenle, bu çalışmanın aşırı Aşil tendonu yaralanmaları için pasif ayak bileği dorsifleksiyonunun bir sıçan modeli olarak sağlayabileceği tendinopatinin daha iyi değerlendirilmesine ve karakterizasyonuna ihtiyaç vardır.

Küçük hayvan modellerini kullanan önceki çalışmalar, tendinopatinin gelişimini ve belirteçlerini incelemeyi amaçlamıştır. Bunlar arasında koşu bandı egzersizi, tekrarlayan uzanma, doğrudan tendon yüklemesi, kollajenaz enjeksiyonları, cerrahi ve in vitro çalışmalar 11,12,13,14,15,16 yer alır. Literatür, bu tendinopati modellerinin kullanılmasından kaynaklanan hasar belirteçlerinin tanımlanmasından yararlanmış olsa da, sınırlamalar, tendonun doğrudan yüklenmesi durumunda olduğu gibi, fizyolojik olarak ilgili olmayan eklem hareketlerinde tendonun yüklenmesini, koşu bandı çalışmalarında olduğu gibi uygulanan yüklerin doğrudan ölçülmemesini ve kollajenaz enjeksiyonlarında olduğu gibi fizyolojik aşırı kullanımın kullanılmamasını içerir. diğerleri arasında. Bu amaçla, bu çalışma, tendinopati için daha önce geliştirilmiş küçük hayvan modellerindeki boşlukları doldurmak için aşırı kullanıma bağlı tendinopati çalışmaları için uygulama ile Aşil tendonuna noninvaziv olarak niceliksel yükler uygulayan bir sistem geliştirmeyi amaçladı. Sistemin bir dizi yükleme döngüsü boyunca mekanik özelliklerde tekrarlanabilir değişikliklere neden olduğunu göstermek için bir pilot çalışma gerçekleştirdik. Bu sistem, fizyolojik olarak ilgili hareket ve yüklemenin aşırı kullanımı indüklemesini sağlarken, aynı zamanda yükleme rejimi sırasında tendona uygulanan ve tendon tarafından maruz kalınan kuvvetleri ölçer ve ölçer.

Protokol

Bu çalışma, Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onayına göre yapılmıştır. Hayvanlar indüksiyon için %5 ve bakım için %2.5 izofluran kullanılarak uyuşturuldu ve hipotermiyi önlemeye özen gösterildi.

1. Test sisteminin kurulması

1. Tutarlı dönüş ve tork uygulamak için pasif ayak bileği dönüşünü bir step motor ile kontrol edin. Step motoru bir mikrodenetleyici ile kontrol edin. Dönme derecelerini işaretlemek için 3D konum ve yönlendirme sisteminden gelen girişleri kullanın. Eşik sınırına ulaşılmazsa dorsifleksiyon açısını artırmak için geri bildirim kontrolü sağlamak için tork sensöründen gelen çıkışları kullanın.
2. Başlamak için mikrodenetleyiciyi, tork sensörünü, 3D elektromanyetik konumlandırmayı ve yönlendirme sistemini bir bilgisayara ve güç kaynağına bağlayın. Şirket içinde geliştirilen bir MATLAB kodunu kullanarak özel olarak oluşturulmuş sistemi kontrol edin (Şekil 1). MATLAB kod dosyalarını GitHub'dan indirin ve GitHub sayfası yönergelerinden (https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem) kodu çalıştırmayla ilgili belirli yönergeleri izleyin.
3. MATLAB'ı kod dosyalarıyla açın. 3D elektromanyetik konumlandırma ve yönlendirme sistemini MATLAB programına bağlamak için PDImfc yazılımını açın. Bağlan'a tıklayın | Sürekli P&O | StartSockExport() komutunu kullanın. Uygulamayı arka planda açık tutun.

2. Ex-vivo ve post-mortem

1. Altı adet 13 haftalık Sprague-Dawley sıçanını CO₂ inhalasyonu ve torakotomi yoluyla ikincil bir ötenazi yöntemi ile ötenazi yapın. Sağ Aşil tendonunu kalkaneus ve miyotendinöz bileşke sağlam olacak şekilde inceleyin. Daha sonra mekanik test yapmak için -20°C'de dondurun. Tendon çözüldükten, ince diseke edildikten ve mekanik test için hazırlandıktan sonra, tendonun nihai gerilme mukavemetini (UTS) elde edememek için çekme yüklemesi gerçekleştirin (0,1 N'ye kadar ön yük, 0,1 - 1 N arasında 10 döngü için ön koşullandırma, 0,1 mm/s'lik sabit bir yer değiştirmede arızaya kadar rampa). Adım 3.4'te açıklandığı gibi, sistemin daha sonraki bir adım için ön koşullandırma gerçekleştirmesi için UTS'nin %15'ini girdi olarak kullanın.
2. Moment kolu ve gerinim ölçümleri için aynı prosedürle beş hayvandan oluşan başka bir gruba ötenazi yapın. Referans olarak bir cetvelin yanında ayak bileği 90° dorsifleksiyonda sol bacağın röntgenini çekin. Görüntüdeki cetveli referans olarak kullanarak X-ışını görüntüsünü Fiji'de açın, MATLAB kodunda bir girdi olarak kullanılmak üzere ayak bileği ekleminin dönme merkezinden ayak bileğinin arkasına kadar tendon moment kolunu ölçün adım 2.1'de açıklanan ön koşullandırma için giriş kuvvetini karşılık gelen tork değerine ve veri analizi için çıkış torku ile kuvvet arasındaki dönüşüme dönüştürün.
3. Dizinizi tam ekstansiyona yerleştirmek için iki atel bantlayarak sol arka ayağı hareketsiz hale getirin. Ayak bileğini hafifçe dorsiflekse ederek ayak bileğini hafifçe dorsifleks yaparak ayak bileği rotasyonunun çevredeki yumuşak dokuları tutmaktan ziyade izole tendon nedeniyle oluşmasını ve gergin olmasını sağlayın. Gergin değilse veya dizde hareket varsa, ateli tekrar bantlayın.
4. Aşil tendonunun etrafındaki deriyi çıkararak tendonu açığa çıkarın. Yapıştırıcıyı 1/32 inçlik bir alüminyum boncuk üzerine yerleştirin, Aşil tendonunun miyotendinöz bileşkesine en yakın serbest tendonun üzerine yerleştirin ve fazla yapıştırıcıyı çıkarmak için tuzlu su içeren bir pamuklu çubuk kullanın. Dokunun nemliliğini sağlamak için kalan prosedür boyunca Aşil tendonuna tekrar tekrar salin uygulayın.
5. Herhangi bir yük uygulamadan önce dijital bir kumpas kullanarak tendonun kesit alanını ölçün. Tendonun bir elips olduğunu varsayalım ve genişliği ve kalınlığı üç kopya halinde ölçün.
6. Fareyi yüzüstü pozisyonda tüm vücut platformuna yerleştirin. Ayak bileğini, ayak bileğinin etrafına ve ayak parmaklarının etrafına bir fermuar ile eklem aktüatörüne sabitleyin ve diz yarığını iki fermuarla sabitleyin. Aksı, ayak bileği tam plantarfleksiyonda olacak şekilde döndürün.
7. 3D elektromanyetik konum ve yönlendirme sisteminin sayısallaştırma kalemini bilgisayara bağlayın ve güç kaynağını açın.
8. Belirtilen döngü sayısı için sistem kodunu (Adım 3'te daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır) çalıştırın (bu çalışmada, altı ötenazi sıçan 7.200 döngü aldı).
9. 0, 500, 1.000, 2.000, 3.600 ve 7.200 döngülerinde ex vivo gerinim ölçümleri, döngüsel yükleme rejimini duraklatın ve kalkaneustan alüminyum boncuka kadar tendonun uzunluğunu 0 ila 40° dorsifleksiyondan 5°'lik artışlarla ölçün (sistemin fiziksel kısıtlamaları nedeniyle çalıştırma sınırı) 3D sayısallaştırma kalemini dönüşümlü olarak üçlü olarak kullanın.
10. Başlangıç uzunluğunun her döngü sayısı için 0° dorsifleksiyonda olduğu adım 2.9'dan elde edilen uzunlukları kullanarak tendon gerginliğini değişen açılarda hesaplayın. Her döngü numarasında dorsifleksiyon açısı ve gerinim arasındaki ilişkiyi elde etmek için doğrusal bir uyum gerçekleştirin. Ham açı verilerini veri analizi için gerinim haline getirmek için bu ilişkiyi kullanın.
11. 0° ve 40°'de tendon uzunluğu ölçümleri ve 0°'de ölçülen kesit alanı ile sıkıştırılamazlığı (sabit hacim) varsayarak 40° dorsifleksiyonda dijital bir kumpas kullanarak tendon kesit alanını hesaplayın. Veri analizi için kuvveti gerilime dönüştürmek için her döngü sayısında bu kesit alanını kullanın (gerilim = kuvvet / kesit alanı).

3. Mekanik yükleme protokolü

1. Çalışmanın bu bölümü için, her biri 500, 1,000, 2,000, 3,600 veya 7,200 döngü yorgunluk yüklemesi almak üzere rastgele tahsis edilen 5 sıçan ile 25 dişi Sprague-Dawley 11 haftalık sıçan kullandık.
   NOT: Ön koşullandırma, ilk kalibrasyon ve ön ve son ölçümün çalıştırılması yaklaşık 15 dakika sürer ve döngüsel yorulma yükleme rejimi döngü başına 1 saniye sürer. Bu nedenle, sıçanın anestezi altında kaldığı en uzun süre, IACUC onaylı protokoller altında gerçekleştirilen yaklaşık 2 saattir.
2. Mikrodenetleyiciyi, tork sensörünü, 3D elektromanyetik konumlandırmayı ve yönlendirme sistemini bir bilgisayara ve güç kaynağına bağlayın. Şirket içinde geliştirilen MATLAB kodunu kullanarak özel yapım sistemi kontrol edin (Şekil 1).
3. Bilgisayarı açın ve kod dosyalarıyla MATLAB'ı açın. 3D elektromanyetik konumlandırma ve yönlendirme sistemini MATLAB programına bağlamak için PDImfc yazılımını açın. Bağlan'a tıklayın | Sürekli P&O | StartSockExport() komutunu kullanın. Uygulamayı arka planda açık tutun.
4. Bir indüksiyon odasında inhalasyon yoluyla% 5 izofluran ile anesteziyi indükleyin. İndüksiyonu takiben, sıcaklığı korumak ve bir burun konisi eki aracılığıyla% 2.5 izofluran ile anesteziyi sürdürmek için su bazlı bir ısıtma elemanı takılı olarak hayvanı tam vücut platformuna sabitleyin. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için gözlere ıslak bir merhem kullanın.
5. Fareyi yüzüstü pozisyonda tüm vücut platformuna yerleştirin. Ayak bileğini, ayak bileğinin etrafına ve ayak parmaklarının etrafına bir fermuar ile eklem aktüatörüne sabitleyin ve diz yarığını iki fermuarla sabitleyin. Aksı, ayak bileği tam plantarfleksiyonda olacak şekilde döndürün.
   NOT: Fermuarların daralmaya veya lezyonlara neden olmadığından emin olun, sıkmaya özen gösterin ve gerekirse bir koruma tabakası için fermuar ile cilt arasına gazlı bez yerleştirin.
6. Sistem kodunu çalıştırmayı içeren aşağıdaki adımlar için, belirli yükleme testine karşılık gelen kodun her bölümü için MATLAB'de Çalıştır'ı tıklatın.
7. Adım 2.1'e göre ölçülen ex vivo çekmeden başarısızlık testlerine kadar Aşil tendonunun nihai gerilme geriliminin değerine bağlı olarak ayak bileğini 50 kat ila %15 arasında çevirin.
8. Tendonu üç kez 12°'ye kadar dorsiflekse ederek ilk kalibrasyonunu yapın. Eğrinin üstel bölgesini hesaplamak için histerezis eğrisinin yükleme bölgesinin doğrusal bölgesinin eğimini kullanın.
9. Eğrinin üstel bölgesi, eğrinin yükleme bölgesinin tepe noktasının eğimi hesaplanarak elde edilene kadar (şirket içinde geliştirilen MATLAB kodu kullanılarak hesaplanır) veya 40°'ye döndürülene kadar (hangisi önce gerçekleşirse) ayak bileğini artan açılarda kademeli olarak dorsiflex yapın.
10. Elde edilen son açıda, ön yükleme taban çizgisi olarak beş döngüsel mekanik ölçüm gerçekleştirin.
11. Döngüsel yorulma yükleme rejimini belirli sayıda döngü için gerçekleştirin (bu çalışmada, 500, 1.000, 2.000, 3.600 veya 7.200 döngü için).
12. Her 50 döngüde bir, hala üstel bölgede olduğundan emin olmak için histerezis eğrisinin yükleme kısmının eğimini (şirket içinde geliştirilen MATLAB kodu aracılığıyla hesaplanır) hesaplayın. Bu üstel bölge elde edilene kadar dorsifleksiyon açısını zaten 40° olmadıkça 1° artırın.
13. Döngüsel yükleme rejimi tamamlandıktan sonra, tendonun mekanik özelliklerini ölçmek için başlangıçta seçilen açıda yükleme sonrası ölçümler olarak beş döngüsel mekanik ölçüm gerçekleştirin.
14. Fermuarları ve ateli çıkarın. Hayvanı kurtarma odasına geri koyun. Hayvan, yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmaz, ardından kafesine geri döndürülür. Hayvanları herhangi bir olumsuz klinik belirti açısından günlük olarak izleyin ve varsa, her 72 saatte bir deri altından 1.2 mg / kg'lık bir dozda buprenorfin uygulayın veya erken ötenazi uygulayın. CO₂ inhalasyonu ve torakotomi yoluyla ikincil bir ötenazi yöntemi yoluyla 7 günlük kafes aktivitesinin ardından hayvanlara ötenazi yapın.
    NOT: Döngüsel yükleme uygulaması ve mekanik ölçümler, daha önce grubumuz¹⁷ tarafından bildirildiği gibi, bir tork sensörü, 3D baskılı ayak bileği eklem aktüatörü ve hayvan yatağı, bir 3D elektromanyetik konum ve yönlendirme sistemi ve dorsifleksiyon elde etmek için bir şaftı döndüren bir step motordan oluşan özel yapım bir aparat ile elde edilmiştir. Bu sistem, adım 1.2'de bahsedilen bir MATLAB betiği tarafından kontrol edilir. Tork sensörü ve konum ve yönlendirme sistemi, sistemin yükleme protokolü boyunca tork ve konum verilerini yakalar.

4. Veri analizi

1. Ölçüm öncesi ve sonrası verileri ayrı ayrı MATLAB'a yükleyin.
2. Denklem (1) ve (2) kullanılarak adım 2.2'den ölçülen moment koluna ve adım 2.11'den elde edilen belirtilen uygulanan yük sayısında ölçülen kesit alanına dayalı olarak torku gerilime dönüştürün:
   (1)
   (2)
3. Adım 2.10'dan elde edilen dönüşüme dayalı olarak açıyı gerinim haline getirin.
4. Ölçüm öncesi ve sonrası döngüler için ortalama histerezis (yükleme ve boşaltma eğrileri arasındaki alan), tepe gerilimi (çevrimin maksimum gerilim değeri) ve yükleme ve boşaltma modüllerini (yüklemenin son %50'sinin ve boşaltma eğrilerinin ilk %60'ının doğrusal uyumu) hesaplayın.
5. Adım 4.4'ten itibaren ölçüm öncesi ve sonrası döngüler arasındaki mekanik özelliklerdeki yüzde değişimini hesaplayın.

Sonuçlar

Uygulanan siklus sayısının artmasıyla, in vivo tendon mekanik özelliklerinde daha büyük bir azalma olmuştur. 3.600 ve 7.200 döngü gruplarına kıyasla 500 döngü grubu için histerezis ve yükleme ve boşaltma modüllerinde önemli ölçüde daha düşük bir azalma vardı (p < 0.05) (Şekil 2). 500 döngüden 3.600 döngü grubuna döngü başına pik streste önemli bir azalma olurken, 500 ve 7.200 döngü grupları arasında önemli bir azalma olmamıştır. 3.600 ve 7...

Tartışmalar

Bu çalışma, in-vivo aşırı kullanıma bağlı bir tendinopati modeli için sıçan Aşil tendonunu pasif bir ayak bileği dorsifleksiyon sistemi ile döngüsel olarak yüklemek için bir yöntem sunmaktadır. Sistemin önemi, Aşil tendonunu izole etme, tendona cerrahi olarak erişmeden ölçülebilir yükler uygulama ve in-vivo tendon özelliklerini ölçme yeteneğinde yatmaktadır.

2010 yılında, Fung ve ark. özel yapım bir test sistemi¹⁴ i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/32'' Aluminum beads
2.5% isoflurane
3D digitizing pen	Polhemus, Vermont, NH, USA
3D electromagnetic positioning and orientation sensor	Polhemus, Vermont, NH, USA
5% isoflurane
Customized device: 1) Assembly, sensors, 3D printed animal bed and ankle mount actuator			Assembled as described in manuscript
MATLAB code	MATLAB, Natick, MA, USA
Microcontroller	Ivrea, Italy	Arduino UNO, Rev3
Nose cone
Scalpel and scalpel holder			No. 11 scalpel
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		11-13 weeks old
Stepper driver	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503	DM542T
Stepper motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503	23HE30-2804S
Straight forceps
Torque sensor assembly	Futek Inc., Irvine, CA, USA	FSH03985, FSH04473, FSH03927
Water heating pad