Un système de test passif de dorsiflexion de la cheville pour un modèle in vivo de tendinopathie induite par le surmenage

Résumé

Ce protocole présente un système de test utilisé pour induire des lésions de fatigue quantifiables et contrôlées dans un tendon d’Achille de rat pour un modèle in vivo de tendinopathie induite par le surmenage. La procédure consiste à fixer la cheville du rat à un actionneur articulaire qui effectue une dorsiflexion passive de la cheville à l’aide d’un script MATLAB écrit sur mesure.

Résumé

La tendinopathie est une affection chronique du tendon qui entraîne des douleurs et une perte de fonction et qui est causée par une surcharge répétée du tendon et un temps de récupération limité. Ce protocole décrit un système d’essai qui applique cycliquement des charges mécaniques via une dorsiflexion passive au tendon d’Achille du rat. Le code écrit sur mesure se compose de mesures de chargement pré et post-cyclique pour évaluer les effets du protocole de chargement ainsi que du régime de chargement de fatigue cyclique basé sur le contrôle de rétroaction.

Nous avons utilisé 25 rats Sprague-Dawley pour cette étude, avec 5 rats par groupe recevant 500, 1 000, 2 000, 3 600 ou 7 200 cycles de charges de fatigue. Les différences en pourcentage entre les mesures de charge pré- et post-cycliques de l’hystérésis, de la contrainte de crête et des modules de charge et de décharge ont été calculées. Les résultats démontrent que le système peut induire différents degrés de dommages au tendon d’Achille en fonction du nombre de charges appliquées. Ce système offre une approche innovante pour appliquer des charges cycliques quantifiées et physiologiques à différents degrés sur le tendon d’Achille pour un modèle in vivo de lésion tendineuse induite par la fatigue.

Introduction

Comme les tendons relient les muscles aux os et subissent des mouvements répétitifs quotidiens tout au long de leur vie, ils sont très sujets aux blessures de surutilisation qui sont douloureuses et limitantes et entraînent une altération de la fonction mécanique, affectant 30 à 50 % de la population¹. Les tendinopathies sont des affections chroniques considérées comme des blessures de surutilisation dues à des mouvements de fatigue répétitifs et à une cicatrisation inadéquate aux niveaux d’avant la blessure. Les membres supérieurs et inférieurs sont souvent touchés, notamment la coiffe des rotateurs, le coude, le tendon d’Achille et le tendon rotulien 2,3,4,5. La tendinopathie d’Achille est fréquente dans les activités impliquant la course et le saut, en particulier les athlètes impliqués dans l’athlétisme, la course de moyenne et longue distance, le tennis et d’autres sports de balle, affectant 7 à 9 % des coureurs ^6,7. Les blessures causées par la course et le saut peuvent également entraîner une dorsiflexion limitée de la cheville, qui est un facteur de risque pour les tendinopathies du tendon d’Achille et de la rotule ^8,9,10. Il est donc nécessaire de mieux évaluer et caractériser la tendinopathie, ce que cette étude peut fournir comme modèle de dorsiflexion passive de la cheville pour les lésions du tendon d’Achille surmenées.

Des travaux antérieurs utilisant des modèles animaux de petite taille ont eu pour but d’étudier le développement et les marqueurs de la tendinopathie. Il s’agit notamment d’exercices sur tapis roulant, d’étirements répétitifs, de charge directe des tendons, d’injections de collagénase, de chirurgie et d’études in vitro 11,12,13,14,15,16. Bien que la littérature ait bénéficié de l’identification de marqueurs de dommages grâce à l’utilisation de ces modèles de tendinopathie, les limites comprennent la charge du tendon dans des mouvements articulaires non physiologiquement pertinents, comme dans le cas de la charge directe du tendon, le fait de ne pas mesurer directement les charges appliquées, comme pour les études sur tapis roulant, et de ne pas utiliser la surutilisation physiologique, comme dans le cas des injections de collagénase. entre autres. À cette fin, cette étude visait à développer un système qui applique de manière non invasive des charges quantifiées au tendon d’Achille avec l’application d’études de tendinopathie induite par le surmenage pour combler les lacunes dans les modèles de petits animaux précédemment développés pour la tendinopathie. Nous avons réalisé une étude pilote pour démontrer que le système induit des changements reproductibles des propriétés mécaniques sur une gamme de cycles de chargement. Ce système permet aux mouvements et aux charges physiologiquement pertinents d’induire une surutilisation tout en quantifiant et en mesurant simultanément les forces appliquées et subies par le tendon pendant le régime de charge.

Protocole

Cette étude a été menée avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) au Beth Israel Deaconess Medical Center. Les animaux ont été anesthésiés à l’aide d’isoflurane à 5 % pour l’induction et à 2,5 % pour l’entretien, et des précautions ont été prises pour éviter l’hypothermie.

1. Mise en place du système de test

1. Contrôlez la rotation passive de la cheville à l’aide d’un moteur pas à pas pour appliquer une rotation et un couple constants. Contrôlez le moteur pas à pas à l’aide d’un microcontrôleur. Utilisez les entrées du système de position et d’orientation 3D pour marquer les degrés de rotation. Utilisez les sorties du capteur de couple pour fournir un contrôle de rétroaction afin d’augmenter l’angle de dorsiflexion si la limite du seuil n’est pas atteinte.
2. Pour commencer, connectez le microcontrôleur, le capteur de couple, le système de positionnement et d’orientation électromagnétique 3D à un ordinateur et à l’alimentation électrique. Contrôlez le système personnalisé à l’aide d’un code MATLAB développé en interne (Figure 1). Téléchargez les fichiers de code MATLAB à partir de GitHub et suivez les instructions spécifiques sur l’exécution du code à partir des instructions de la page GitHub (https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem).
3. Ouvrez MATLAB avec les fichiers de code. Ouvrez le logiciel PDImfc pour connecter le système de positionnement et d’orientation électromagnétique 3D au programme MATLAB. Cliquez sur Connecter | P&O continu | StartSockExport(). Gardez l’application ouverte en arrière-plan.

2. Ex-vivo et post-mortem

1. Euthanasier six rats Sprague-Dawley âgés de 13 semaines par inhalation de CO₂ et une méthode secondaire d’euthanasie par thoracotomie. Disséquer le tendon d’Achille droit avec le calcanéum et la jonction myotendineuse intacts. Congeler à -20 °C pour effectuer des essais mécaniques plus tard. Une fois le câble décongelé, disséqué finement et préparé pour les essais mécaniques, effectuer une charge de traction jusqu’à l’échec pour obtenir la résistance à la traction ultime (UTS) du câble (précharge à 0,1 N, préconditionnement pendant 10 cycles de 0,1 à 1 N, rampe à la rupture à un déplacement constant de 0,1 mm/s). Utilisez 15 % de l’UTS comme entrée pour que le système effectue un préconditionnement pour une étape ultérieure, comme décrit à l’étape 3.4.
2. Euthanasier un autre groupe de cinq animaux avec la même procédure pour les mesures du moment du bras et de la déformation. Effectuez une radiographie de la jambe gauche avec la cheville en dorsiflexion à 90° à côté d’une règle comme référence. Ouvrez l’image radiographique aux Fidji, en utilisant la règle de l’image comme référence, mesurez le bras de moment du tendon du centre de rotation de l’articulation de la cheville à l’arrière de la cheville à utiliser comme entrée dans le code MATLAB pour convertir la force d’entrée pour le préconditionnement décrit à l’étape 2.1 en la valeur de couple correspondante ainsi que la conversion entre le couple de sortie et la force pour l’analyse des données.
3. Immobiliser le membre postérieur gauche en collant deux attelles pour placer le genou en extension complète. Flûtez légèrement la cheville en poussant sur les orteils pour vous assurer que la rotation de la cheville se produit en raison du tendon isolé plutôt que d’impliquer les tissus mous environnants et qu’elle est en tension. S’il n’y a pas de tension ou s’il y a un mouvement dans le genou, recollez l’attelle.
4. Exposez le tendon en enlevant la peau autour du tendon d’Achille. Placez de la colle sur une perle d’aluminium de 1/32 de pouce, placez-la sur le tendon libre le plus proche de la jonction myotendineuse du tendon d’Achille et utilisez un coton-tige avec une solution saline pour enlever l’excès de colle. Appliquez à plusieurs reprises une solution saline sur le tendon d’Achille tout au long de la procédure restante pour assurer l’humidité du tissu.
5. Mesurez la section transversale du tendon à l’aide d’un pied à coulisse numérique avant d’appliquer une charge. Supposons que le tendon est une ellipse et mesurez la largeur et l’épaisseur en trois exemplaires.
6. Placez le rat sur la plate-forme de tout le corps en position couchée. Fixez la cheville sur l’actionneur articulaire à l’aide d’un collier de serrage autour de la cheville et d’un autre autour des orteils, et fixez le genou fendu avec deux colliers de serrage. Faites pivoter l’axe de manière à ce que la cheville soit en flexion plantaire complète.
7. Connectez le stylo numériseur du système de position et d’orientation électromagnétique 3D à l’ordinateur et allumez l’alimentation électrique.
8. Exécutez le code système (décrit plus en détail à l’étape 3) pour le nombre de cycles spécifié (dans cette étude, six rats euthanasiés ont reçu 7 200 cycles).
9. À 0, 500, 1 000, 2 000, 3 600 et 7 200 cycles pour les mesures de déformation ex vivo, interrompez le régime de charge cyclique et mesurez la longueur du tendon du calcanéum au cordon d’aluminium par incréments de 5° de 0 à 40° de dorsiflexion (la limite d’actionnement due aux contraintes physiques du système) à l’aide du stylo numériseur 3D en trois exemplaires et en alternance.
10. Calculer la déformation du tendon à différents angles en utilisant les longueurs obtenues à l’étape 2.9, où la longueur initiale est à 0° de dorsiflexion pour chaque numéro de cycle. Effectuez un ajustement linéaire pour obtenir la relation entre l’angle de dorsiflexion et la déformation à chaque numéro de cycle. Utilisez cette relation pour convertir les données d’angle brutes en déformation à des fins d’analyse des données.
11. Calculer la section transversale du câble à l’aide d’un pied à coulisse numérique à 40° de dorsiflexion en supposant l’incompressibilité (volume constant) avec les mesures de longueur de câble à 0° et 40° et la section transversale mesurée à 0°. Utilisez cette section transversale à chaque nombre de cycles pour convertir la force en contrainte pour l’analyse des données (contrainte = force / section transversale).

3. Protocole de chargement mécanique

1. Pour cette section de l’étude, nous avons utilisé 25 rats femelles Sprague-Dawley âgés de 11 semaines, chacun étant réparti au hasard pour recevoir 500, 1 000, 2 000, 3 600 ou 7 200 cycles de charge de fatigue.
   REMARQUE : Le préconditionnement, l’étalonnage initial et la pré- et post-mesure prennent environ 15 minutes pour fonctionner, et le régime de charge de fatigue cyclique prend 1 seconde par cycle. Ainsi, la durée maximale d’anesthésie du rat est d’environ 2 h, ce qui a été réalisé selon des protocoles approuvés par l’IACUC.
2. Connectez le microcontrôleur, le capteur de couple, le système de positionnement et d’orientation électromagnétique 3D à un ordinateur et à l’alimentation électrique. Contrôlez le système personnalisé à l’aide du code MATLAB développé en interne (Figure 1).
3. Allumez l’ordinateur et ouvrez MATLAB avec les fichiers de code. Ouvrez le logiciel PDImfc pour connecter le système de positionnement et d’orientation électromagnétique 3D au programme MATLAB. Cliquez sur Connecter | P&O continu | StartSockExport(). Gardez l’application ouverte en arrière-plan.
4. Induire une anesthésie avec de l’isoflurane à 5 % par inhalation dans une chambre d’induction. Après l’induction, fixez l’animal sur la plate-forme complète du corps à l’aide d’un élément chauffant à base d’eau fixé pour maintenir la température et maintenir l’anesthésie avec 2,5 % d’isoflurane via une fixation de cône nasal. Utilisez une pommade humide sur les yeux pour éviter la sécheresse pendant l’anesthésie.
5. Placez le rat sur la plate-forme de tout le corps en position couchée. Fixez la cheville sur l’actionneur articulaire à l’aide d’un collier de serrage autour de la cheville et d’un autre autour des orteils, et fixez le genou fendu avec deux colliers de serrage. Faites pivoter l’axe de manière à ce que la cheville soit en flexion plantaire complète.
   REMARQUE : Assurez-vous que les colliers de serrage ne causent pas de constriction ou de lésions, prenez soin de les serrer et, si nécessaire, placez de la gaze entre le collier de serrage et la peau pour une couche de protection.
6. Pour les étapes suivantes impliquant l’exécution du code du système, cliquez sur Exécuter sur MATLAB pour chaque section du code correspondant au test de chargement spécifique.
7. Faire un cycle de la cheville 50 fois à 15 % de la contrainte de traction ultime en fonction de la valeur de la contrainte de traction ultime du tendon d’Achille depuis la traction ex vivo jusqu’aux tests de défaillance mesurés sur la base de l’étape 2.1.
8. Effectuez un premier calibrage du tendon en le dorsifléchissant trois fois à 12°. Utilisez la pente de la région linéaire de la zone de chargement de la courbe d’hystérésis pour calculer la région exponentielle de la courbe.
9. Inclinez progressivement la cheville à des angles croissants jusqu’à ce que la région exponentielle de la courbe soit obtenue en calculant la pente du pic de la région de charge de la courbe (calculée à l’aide du code MATLAB développé en interne) ou jusqu’à ce qu’elle soit tournée à 40°, selon la première éventualité.
10. À l’angle final obtenu, effectuez cinq mesures mécaniques cycliques comme ligne de base de précharge.
11. Effectuer le régime de charge de fatigue cyclique pendant un nombre spécifié de cycles (dans cette étude, pour 500, 1 000, 2 000, 3 600 ou 7 200 cycles).
12. Tous les 50 cycles, calculez la pente de la partie de charge de la courbe d’hystérésis (calculée à l’aide du code MATLAB développé en interne) pour vous assurer qu’elle est toujours dans la région exponentielle. Augmentez l’angle de dorsiflexion de 1° à moins qu’il ne soit déjà à 40° jusqu’à ce que cette région exponentielle soit atteinte.
13. Une fois le régime de charge cyclique terminé, effectuez cinq mesures mécaniques cycliques en tant que mesures de post-charge à l’angle initialement choisi pour mesurer les propriétés mécaniques du tendon.
14. Retirez les colliers de serrage et l’attelle. Remettez l’animal dans la chambre de récupération. L’animal n’est pas laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait retrouvé suffisamment de conscience, après quoi il est renvoyé dans sa cage. Surveiller quotidiennement les animaux pour détecter tout signe clinique indésirable et, le cas échéant, administrer de la buprénorphine à une dose de 1,2 mg/kg par voie sous-cutanée une fois toutes les 72 h ou procéder à une euthanasie précoce. Euthanasier les animaux après 7 jours d’activité en cage par inhalation de CO₂ et un moyen secondaire d’euthanasie par thoracotomie.
    REMARQUE : L’application de charge cyclique et les mesures mécaniques ont été obtenues avec un gabarit sur mesure composé d’un capteur de couple, d’un actionneur d’articulation de cheville imprimé en 3D et d’un lit pour animaux, d’un système de position et d’orientation électromagnétique 3D et d’un moteur pas à pas faisant tourner un arbre pour obtenir une dorsiflexion, comme indiqué précédemment par notre groupe¹⁷. Ce système est contrôlé par un script MATLAB mentionné à l’étape 1.2. Le capteur de couple et le système de position et d’orientation capturent les données de couple et de position tout au long du protocole de chargement du système.

4. Analyse des données

1. Chargez séparément les données de pré et post-mesure dans MATLAB.
2. Convertissez le couple en contrainte en fonction du bras de moment mesuré à l’étape 2.2 et de la section transversale mesurée au nombre spécifié de charges appliquées obtenues à l’étape 2.11 à l’aide des équations (1) et (2) :
   (1)
   (2)
3. Convertissez l’angle en déformation en fonction de la conversion obtenue à l’étape 2.10.
4. Calculer l’hystérésis moyenne (surface entre les courbes de chargement et de déchargement), la contrainte maximale (valeur maximale de contrainte du cycle) et les modules de charge et de déchargement (ajustement linéaire des derniers 50 % de la charge et des 60 premiers % des courbes de déchargement) pour les cycles de pré- et post-mesure.
5. Calculer le pourcentage de variation des propriétés mécaniques de l’étape 4.4 entre les cycles de pré- et post-mesure.

Résultats

Avec l’augmentation du nombre de cycles appliqués, il y a eu une plus grande réduction des propriétés mécaniques des tendons in vivo . Il y avait une réduction significativement plus faible de l’hystérésis et des modules de chargement et de déchargement pour le groupe de 500 cycles par rapport aux groupes de 3 600 et 7 200 cycles (p < 0,05) (Figure 2). Bien qu’il y ait eu une réduction significative du stress de pointe par cycle du groupe 500 au groupe 3 600 cycles, ...

Discussion

Cette étude présente une méthode de charge cyclique du tendon d’Achille du rat avec un système passif de dorsiflexion de la cheville pour un modèle de tendinopathie induite par le surmenage in vivo . L’importance du système réside dans sa capacité à isoler le tendon d’Achille, à appliquer des charges quantifiables sans accès chirurgical au tendon et à mesurer les propriétés du tendon in vivo .

En 2010, Fung et al. ont présenté un modèle de fatigue du t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/32'' Aluminum beads
2.5% isoflurane
3D digitizing pen	Polhemus, Vermont, NH, USA
3D electromagnetic positioning and orientation sensor	Polhemus, Vermont, NH, USA
5% isoflurane
Customized device: 1) Assembly, sensors, 3D printed animal bed and ankle mount actuator			Assembled as described in manuscript
MATLAB code	MATLAB, Natick, MA, USA
Microcontroller	Ivrea, Italy	Arduino UNO, Rev3
Nose cone
Scalpel and scalpel holder			No. 11 scalpel
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		11-13 weeks old
Stepper driver	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503	DM542T
Stepper motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503	23HE30-2804S
Straight forceps
Torque sensor assembly	Futek Inc., Irvine, CA, USA	FSH03985, FSH04473, FSH03927
Water heating pad