Biz kendi teknik yardım için Mably laboratuar ve Narie Storer üyeleri kabul ve Amerikan Kalp Derneği (NCRP Scientist Kalkınma Hibe 0635363N) ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü finansman için (Hibe SCCOR RFA HL02-027).

Bölüm 1: Yumurta üretim ve toplama <ol><li> Enjeksiyon için önceki gece yerde bölücüler ile üreme tankları, balık kurdu. Istenirse toplam yumurta üretimi artırmak için balık, bir erkek iki kadın oranı ayarlanmış olabilir. </li><li> Ertesi sabah, oda ışıkları sonra, açmak birkaç tankları bölücüler çekin ve bozulmamış çiftleşme süresi yaklaşık 20 dakika izin verir. </li><li> Bir süzgeç kullanarak, üreme kafesleri yumurtaları toplamak ve yumurta su ile durulayın. Yumurta, yumurta su ile bir Petri kabı içine dökün ve bir transfer pipeti ile döllenmemiş yumurta ve enkaz kaldırmak. Balık, enjeksiyon için yumurta ilave tur üretmek için büyük tanklarda yeniden bir araya olabilir. Onlara tek bir hücre aşamasına geçmek izin vermeden üretilen yumurta maksimum numaraları için izin yumurta toplama zamanı ayarlayın. </li><li> 100mm bir Petri kabı ters kapağı bir mikroskop lamı yerleştirin. Tek bir sütun oluşturan slayt kenarına yumurta hattına bir transfer pipet kullanın. Yumurta ters tarafına karşı Kimwipe basarak slayt fazla yumurta su çıkarın. (Şekil 1A) </li></ol> Bölüm 2: İğne yükleme, çekme, ve hazırlık <ol><li> Mikropipet çektirmesi ile aptalca macun rampalar üzerinden atarak, 150mm Petri kabındaki iki iğne ve mağaza içine kılcal bir 1.0mm OD cam çekin. İğneler önceden çekilmiş olabilir. </li><li> Microloader pipet kullanarak enjeksiyon malzemesinin 3 mcL Backload iğne. Kalan az veya hiç kabarcık kalmayana dek bolus iğne ucu doğru sallayın. </li><li> Hava kaynağı ve mikroenjektör açın. Mikroenjektör iğne takın ve konut içinde sıkı bir mühür sigorta. Mikromanipülatör geniş bir yelpazede hareket ve uyum sağlamak için uygun bir pozisyonda olup olmadığını kontrol edin. Mikroskop görüş sahneden yüksek düzlem, ve ucu ince bölgeye odaklanmak içine iğne ucu getirin. Iğne delmek koryon ve yumurta sarısı kadar dar ama hala tutarlı bir boncuk boyutu sunma yeteneğine sahip yaprakları bir noktada iğne çimdik, keskin forseps bir çift kullanın. Mikrometre üzerinde mineral yağ Bir damla her enjeksiyon hacmini hesaplamak için kullanılabilir. Yağ enjekte edildiğinde, enjeksiyon malzemesinin 500 0.1 mm çapında bir boncuk pL (Şekil 1B) içerir; 500 pL veya 1nL enjeksiyon birimleri genellikle kullanılır. Ayak pedalına basınız ve iğne kırparak ve gerektiği gibi enjeksiyon basıncı ayarlayarak boncuk büyüklüğündeki LCD ekran. İdeal enjeksiyon hacimleri, yumurta hacminin yaklaşık% 10 dolduracaktır. Iğne ucu kaliteli enjeksiyon kolaylığı ve sonuçların kalite ve tutarlılık çok önemlidir. </li></ol> Bölüm 3: Enjeksiyon <ol><li> Embriyoların dört hücreli aşamasında geçmiş gelişmiş değil. Olun İdeal olarak, embriyolar tek hücreli aşamada olmalıdır. </li><li> Elinin tersiyle çanak tutan, iğne yumurta sütun doğru indirin. </li><li> Pierce yüzey koryon ve yolk kesesi herhangi bir ezilme veya yırtılma izlerken tek bir düzgün bir vuruş sarısı girin. Yumurta sarısı (şekil 1C) içine enjeksiyon malzemesi enjekte edilir. Hava kabarcıkları enjekte ya da embriyo için ölümcül olabilir sarısı germe kaçının. Satır aşağı, bir pipet kullanarak tutarlı bir boncuk büyüklüğü ve sürdürmek için gerekli basınç ayarı, döllenmemiş bir görünüm veya enjeksiyon işlemi sırasında tahrip yumurta çıkarın. </li><li> Yumurta bir sütun tamamladıktan sonra, temiz bir petri kabı içine enjekte edilen yumurta taşımak için yumuşak bir yumurta su akışı kullanın. Gerektiği kadar tekrarlayın. Bir kontrol gibi çeşitli uninjected embriyolar tutun. Gün birinin sonunda, ölü embriyolar kaldırmak ve enjekte edilen embriyoların sayısı kaydedin. Periyodik olarak enfeksiyon olasılığını azaltmak için çanak yumurta su değiştirin. </li></ol> Bölüm 4: Temsilcilik sonuç Enjekte ediliyor bağlı olarak, embriyolar kendi uninjected kardeşlerine göre daha düşük bir oranda hayatta kalabilirler. Neyse ki, bunlardan çok sayıda enjekte etmek kolaydır, bu nadiren bir sorun. Morphants biraz gecikmeli gelişim sergilemek için normaldir. Mikroenjeksiyon sonuçlarını göstermek için, biz, Cam protein Heart (HEG) düzeyleri işlemek için bu protokol kullanılır. HEG normal kalp gelişimi için gerekli bir transmembran proteindir. Onun yokluğunda, embriyolar dev girişi yolları ve odaları 1 kalpleri gelişir. Biz 500 mcM bir konsantrasyonda HEG heg_e3i3_egfr1 ve heg_e4i4_egfr2 karşı daha önce tanımlanmamış iki morpholinos enjekte etti. 2 gün yazılan gübreleme, uninjected kardeş kontrolleri (Şekil 2A ve B) beklenen normal görünür. Heg_e3i3_egfr1 ile enjekte Embriyolar beyin ödemi (Şekil 2C). Bu morphants en kalbini morfolojisi değişmiş olmasına rağmen, kendi odalarına normal büyüklükte (Şekil 2B). Embriyolar enjekteheg_e4i4_egfr2 sergi değişken kalp kusurları. Diğerleri büyük girişinin yolları ve orta derecede genişlemiş kulakçıklar (Şekil 2E ve F), bazıları normal görünür. Önceden 1 rapor HEG mutant, büyük ölçüde genişlemiş içeakımın ve atrium (Şekil 2G ve H). Ayrıca, tam uzunlukta cDNA HEG transkripsiyonu 400 ng / mcL mRNA wild tip embriyolar enjekte edildi . (Şekil 3A ve B) uninjected kontrolleri normalde geliştirirken, embriyolar ana gövde eksen, baş ve gövde nekrozu, ve orta hat defektleri (Şekil 3C kısaltılması, mRNA fenotiplerinin wild tip görünüm şiddetli Siklopi değişen bir spektrum sergi HEG ile enjekte ve D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Şekil 1 enjekte edilir. Embriyolar bir Petri kabındaki bir mikroskop lamı (A) karşı dizilmiştir. Enjeksiyon hacmi bir mikrometre yerleştirilen madeni yağ içine enjekte edilerek belirlenir. , Yaygın olarak kullanılan 500 pL, bir enjeksiyon hacmi 0,1 mm (B) bir çapa sahiptir. Hemen enjeksiyondan sonra, morfolino veya mRNA sarısı (C) noktasal bir nokta olarak görünür. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Şekil 2 2 gün yazılan gübreleme, uninjected embriyoların brüt kusurları (A) veya kalp fenotip (B) vardır. Morfolino heg_e3i3_egfr1 enjekte Embriyolar beyin ödemi (C, ok) ama normal boyutlu kalp boşluklarının (D) var. Morfolino heg_e4i4_egfr2 enjekte Bazı embriyolar genişlemiş girişi yolları ve kulakçıklar (E, F) var. HEG mutantlar ölçüde genişlemiş girişi yolları ve kulakçıklar (G, H) var. (A), (C), (E) ve (G) 4x DIC görüntüler; (B), (D), (F) ve (H), 20x DIC görüntü. = atrium, = içeakımın. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Şekil 3, 24 saat yazılan gübreleme, embriyolar (B) arasında bir nöral tüp hiçbir nekroz veya orta hat defektleri (A) ve açıkça tanımlanmış iki gözleri ile uzun, düz bir vücuda sahip uninjected. HEG mRNA enjekte Bazı embriyolar, aksine, kısaltılmış bir vücut ekseni, nekroz, misshaped Somitlerin (C) ve siklops (D) sergilerler. (A) ve (C) 4x DIC görüntüler; (B) ve (D) 20x DIC görüntülerdir.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

Zebrafish modeli sisteminin güçlü yanlarından biri belirli gen ürünleri veya mikroenjeksiyon embriyo elimine edilebilir olan kolaylığı. Yayg belirli bir protein eksprese için mRNA kodlama, 1-hücreli aşamada yumurta sarısı içerisine enjekte edilir. RNA, embriyonun sonraki gelişimi sırasında, organizma boyunca dağıtılan ve tercüme edilmiştir. Tersine, belirli bir proteinin ortadan kaldırmak için, morpholinos kullanılır. Morpholinos, özel RNA&#39;lar antisens tamamlayıcılık tasarlanmış sentetik oligonükleotidlerdir. MRNA&#39;ların gibi, morpholinos 1-hücreli aşamada sarısı içine enjekte edilir. İçinde de embriyo çeviri önlenmesi, hedef RNA&#39;lar bağlanır. Her morfolino veya mRNA için yapılması gereken ana değişiklik enjekte malzeme konsantrasyonu. Morfolino veya mRNA ya da çok yüksek bir konsantrasyon, non-spesifik bir toksisiteye neden olabilir; her morfolino non-spesifik kusurları neden olmadan etkili bir gen faaliyetlerinde yıkmak optimal konsantrasyonu, genellikle, 200 mcM ve 500 mcM arasında morfolino konsantrasyonları belirlemek için deneysel olarak test edilmelidir. Iğne açılması kesin büyüklüğü önemli değildir. Iğnelerin, enjeksiyon basıncı ve enjeksiyon zaman aralığında, doğru ses bolus üretmek için ayarlanabilir. Morpholinos bir protein içindeki domain fonksiyonel diseksiyon da dahil olmak üzere birçok uygulama var. Özel ekzon-intron kavşaklar hedef için tasarlanmış, morpholinos orada meydana gelen ekleme önlemek. Biz iki morpholinos etkilerini araştırdık HEG pre-mRNA bağlama ekzon-intron kavşaklar. Morfolino heg_e3i3_egfr1 olgun transkript içine ekzon 3 içeren ekleme makine önlenmesi, ekzon 3 ve intron 3 arasında birleşme bağlar. Morfolino heg_e4i4_egfr2 benzer ekzon 4 kaldırır. Ekzon 3 ve 4. EGF gibi tekrarlar içeren etki alanı kodlamak. Bazı embriyolar heg_e4i4_egfr2 orta Fenokopisi mutant enjekte kalp gelişiminde ekzon 4 HEG rolünü anlamak için daha fazla deneyler gerekli olacaktır. Hayret, heg_e3i3_egfr1 enjekte embriyolarının beyin ödemi, HEG mutantlar görülen bir özellik değil. Bu Zigotik mutantlar etkilenmemiş olacaktır anne transkript bağlamak için morpholinos yeteneğine bağlı olabilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Eğitim zebrafish avantajlarından biri embriyo protein düzeyleri manipüle kolaylığı ve hız. Antisens tamamlayıcılık hedef RNA&#39;lar sentetik oligonükleotidlerdir Morpholinos, belirli bir gen ürünü ifade azaltmak için embriyo eklenebilir. Tersine, bir gen ürünü işleme mRNA düzeylerini artırmak için embriyo olabilir. Bir embriyo ya da mRNA veya morfolino eklemek için araç mikroenjeksiyon. Mikroenjeksiyon saatte embriyo yüzlerce enjeksiyon için izin, verimli ve hızlı. Bu video mikroenjeksiyon yer alan tüm adımları gösterir. Kısaca, yumurta atılmaktadır sonra hemen toplanır ve bir Petri kabındaki bir mikroskop lamı karşı dizilmiş. Daha sonra ince uçlu bir iğne, enjeksiyon malzemesi yüklü bir mikroenjektör ve bir hava kaynağına bağlı olduğu ve mikroenjektör kontrolleri arzu edilen bir enjeksiyon hacmi üretmek için ayarlanabilir. Son olarak, iğne embriyonun yumurta sarısı içine dalmış ve morfolino veya mRNA atılır.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Bu video morfolino veya mRNA sonraki gelişimi sırasında spesifik gen ürünlerinin seviyesini azaltmak veya artırmak için tek hücreli aşamada zebrafish embriyoların nasıl enjekte edilebilir gösterir.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Research

JoVE Journal

Biology

77.1K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Bu video morfolino veya mRNA sonraki gelişimi sırasında spesifik gen ürünlerinin seviyesini azaltmak veya artırmak için tek hücreli aşamada zebrafish embriyoların nasıl enjekte edilebilir gösterir.

Video: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biyoloji

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Zebra balığı Gal4 kullanma Gene Yakalama

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...