Yazarlar mükemmel sürekli hayvancılık bakım sağlamak için Deakin Üniversitesi Zebrafish Tesisi personeli teşekkür etmek istiyorum. YG Alfred Deakin Doktora Sonrası Araştırma Bursu ve Deakin Üniversitesi&#39;nde Merkez Araştırma Grant tarafından desteklenmektedir. SLM bir NHMRC Kariyer Geliştirme Bursu tarafından desteklenmektedir. ACW bir NHMRC etkinleştirilmesi Grant tarafından desteklenmektedir. Tüm yazarlar Deakin Üniversitesi&#39;nde Moleküler ve Tıbbi Araştırma Stratejik Araştırma Merkezi tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: Zebra balığı Embriyolar Kimyasal Arıtma <ol><li> Döllenmeden sonra zebrafish embriyolar toplayın. 28.5 inkübe 100 ° E3 orta C x 15 mm Petri kapları Not:. Için in situ hibridizasyon ya da yağ-kırmızı O boyama içinde, 0.2 mM nihai bir konsantrasyonda 1-fenil-2-tioüre (PTU) ilave edilir pigment oluşumu, 1 ama Seahorse analiz için gerekli değildir inhibe ederler. </li><li> . Farmakolojik çalışmalar için uygun bir araç sadece kontrol Not 26 civarında saat sonrası fertilizasyon (HPF) de zebrafish embriyo geliştirmek için uygun bir final konsantrasyonda gerekli kimyasal ekleyin: ışığa duyarlı farmakolojik inhibitörleri için, embriyo geliştirmek için izin verilebilir analiz karanlık öncesinde. </li></ol> Bölüm 2: Denizatı XF 24 Analizörü Kullanma Canlı Metabolik Profili <ol><li> Her çalışma öncesinde, Denizatı XF 24 Analizcisi kartuşu O 2 ve H evler olduğunu <skadar&gt; + floroforlar analizci tarafından yapılan otomatik bir işlem aracılığıyla kalibre edilir. </li><li> 24-kuyu XF 24 adacık plaka hazırlanması. Aşağıdaki deney sırası kullanılmaktadır: <ol><li> Oksijen tüketimi sıcaklık dalgalanmalarına karşı duyarlı olduğu için, dört kuyu plakası üzerinde olası sıcaklık değişimleri kontrol etmek için kullanılır. Bu kuyular embriyolar içermez, ancak E3 orta 700 ul (Şekil 2A) ile doldurulur. </li><li> Kalan 20 kuyu (bölüm 2.2 &#39;ye bakınız) E3 orta ve tek embriyo her (Şekil 2B) 700 ul ile doldurulur. </li><li> Her deney için, 10 embriyolar araç-sadece (kontrol) ve 10 kimyasal inhibitörü (tedavi) ile tedavi ile tedavi edilir. Kontrol ve tedavi embriyolar (:;: işlenmiş embriyo: sıra A4: Kontrol embriyo; sıra A5 tedavi embriyo, vb de A3 kontrolü embriyo sıra A2 gibi) alternated vardır. </li><li> Bir adacık yakalama ekranın üstüne eklenir. numune tahlil boyunca ölçüm bölmesine (Şekil 2B) kalmasını sağlamak için her bir kuyunun Not: kimyasal işlem görmüş embriyolar önceden Denizatı analizörü çalıştıran kimyasal yıkamak gerek kalmadan, tüm prosedür boyunca orijinal kimyasal solüsyonu ile devam programı. </li><li> Bittiği zaman, plaka Denizatı Analizörü yüklenir ve tahlil başlatılır. </li></ol></li><li> Numunelerin analizi. İki farklı testler rutin olarak yapılmaktadır. <ol><li> Bazal solunum / Maksimum solunum programı (süresi yak. ​​90 dk). Maksimal solunum patolojik ve fizyolojik hem de devletlerin bir dizi ile ilişkili bu parametrede toplam enerji üretim kapasitesi ve değişikliklerin bir ölçü ise bazal solunum değişiklikler, metabolik disfonksiyon destekleyecektir. Yedek solunum kapasitesi, ya da daha fazla ATP üretimi artırmak için sistem için kapasite, aynı zamanda hesaplanırmaksimal solunum gelen bazal çıkarma bu testi. Üç Her karışım tekrarlar (2 dak) / bekleme (1 dak) / ölçüm (2 dk) döngüsünün ilk bazal solunum kurmak için yapılır. Üçüncü çevrimi sonunda, FCCP 2.5 uM (mitokondrial protonophore / uncoupler) bir son konsantrasyon iyi maksimum solunum ölçümüne izin veren her eklenir. Ölçüm işlemi, daha sonra 5-8 kez (Şekil 3) tekrarlanır. </li><li> ATP ciro / Proton sızıntısı programı (süresi yak. ​​60 dk). Proton sızıntısı ya da bağlanmamış solunum bağlı solunum, ayrılmaz bazal solunum ve reaktif oksijen türlerinin oluşumunu içeren mitokondriyal işlev diğer parametreleri ile bağlantılı iken ATP devir bağlı solunum, ATP üretimi şeklinde mitokondri temel fonksiyonu temsil etmektedir. Nedeniyle ATP devir için solunum 25 uM oligomycin ve buna ek olarak (A inhibitörü aşağıdaki solunum arasındaki fark ile temsil edilirTP sentaz) bazal solunum ile karşılaştırıldığında. Bağlanmamış solunum ya da proton sızıntı nedeniyle solunum, 25 uM rotenon (bir kompleks I inhibitörü) ve buna ek olarak aşağıdaki oligomycin-aracılı, solunum ve solunum arasındaki farkı hesaplayarak belirlenir. Ölçüm döngüleri her mitokondriyal inhibitörü eklenmesinden sonra 8 kez tekrarlanır. </li></ol></li></ol> Ishal sonunda, 10 ve 10 kontrol kimyasal işlem görmüş embriyoların ortalama değerleri hesaplanır. Bölüm 3: Petrol-Kırmızı-O Boyama <ol><li> 50 hpf az Embriyolar 4 ° C gecede% 4 PFA ince forseps kullanarak dechorionated ve sabitlenmiştir </li><li> Daha önce (bkz. Şekil 4) 2 açıklandığı gibi Petrol-Kırmızı-O boyama, gerçekleştirilir. </li></ol>

<ol>
	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Zebrafish embriyolar gen işlevi de kolayca bloke veya aktive edilebilir ise Zebra balığı, ileri (TRK mutagenez) ve ters (Tilling, çinko parmak nükleaz hedefli knock-out, morfolino demonte) genetik yaklaşımlar 3,4 hem de köklü bir genetik modeldir kodlanmış ürünler için özel seçici farmakolojik bileşiklerin kullanılması. Dış gelişimi ve küçük boyutları nedeniyle, zebrafish embriyolar metabolik analizi için özel olarak uygundur. Bununla birlikte, metabolik profil ve zebrafish embriyolar in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonun sağlam ölçüm sadece bir ön tanımlama ile, elde 5 rapor edilmemiştir. Denizatı analizi aslında hücre tabanlı metabolik çalışmalar için dizayn edilmiştir ve doğru ve güvenilir sonuçlar 6 vermesi ispat edilmiştir. Zebrafish embriyolar bu yeni metodolojinin uygulama önemli ve metabolik çalışmalar için bu model daha geniş kullanımını artırmak için muhtemeldir. Bu çalışmada, bazal solunum, maksimal solunum, yedek solunum kapasitesi, ATP ciro ve proton kaçak dahil Denizatı Analizörü kullanılarak zebrafish embriyolar solunum parametreleri bir dizi ölçüm göstermektedir. Ayrıca, bu tür ölçümleri bu durumda lipid birikimi, ve bu test sisteminde kullanılan farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı diğer fizyolojik parametreler ile korele edilebilir bir örnek sağlamaktadır. Genetiği değiştirilmiş embriyoların kullanımı ile birlikte bu metabolizma üzerine etkileyen faktörleri anlamak için güçlü bir deneysel bir platform sağlar. Mitokondriyal işlev bozukluğu, diyabet mellitus, 7, 8 şişmanlık, multipl skleroz 9, Parkinson hastalıkları 10, Alzheimer hastalığı ve 11 kanserler 12 bir tür olarak pek çok insan hastalığı, karıştığı birlikte bu yeni yöntem için çeşitli uygulamalar vardır. Önemlisi, oböylece vivo solunum ve metabolik profilde önemli fizyolojik görünüm sağlayan, aktif - gibi sitokinler, kalkınma ile ilgili büyüme vb - ur tüm çalışmaları çevresel etkiler in vivo koşullarda gerçekleştirilir. Kimyasal ekranlarında ayrıca rutin vahşi tip ve etkisi solunum, mitokondri fonksiyonu veya metabolizma kolayca Denizatı analyzer kullanarak teşhis edilebileceğini mutant arka zebrafish embriyolar (Şekil 1), yeni ilaç yapılır gibi. Seahorse analizör kullanılarak oluşturulan sonuçlar ek bilgi sağlamak için başka deneyler ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bu tür tür cebpα, Pparα gibi belirli adiposit belirteçleri için in situ hibridizasyon gibi Petrol-Kırmızı Boyama gibi fizyolojik analizi, veya moleküler analizi, PPARy, FAS vb içerebilir Bu yöntem için bazı sınırlamalar vardır kalır. Biz ve diğerleri ölçüm için oligomycin kullanmak mümkün olmasına rağmengenç embriyoların 60 hpf oligomycin tedavisi daha yaşlı embriyolar 5 (bkz. Şekil 3), üzerine ure ATP üretimi ve proton kaçak verimsiz. Biz yaşlı embriyolar oligomycin gibi kolayca yorumlamak sonuçları imkansız hale genç embriyoların daha yaygın olamaz inanıyoruz. Oligomycin sonuçlar ATP ciro ve bağlantısız solunum nedeniyle solunumun belirlenmesi için zorunlu olduğundan, şu anda eski embriyolar oligomycin yüksek konsantrasyonlarda araştırıyoruz. Bununla birlikte, bu gibi tedaviler antimycin bir bazal solunum, maksimum solunum ve yedek solunum kapasitesi, büyük zebrafish embriyolar yapılabilir, en fazla 68 HPF (gösterilmemiştir) gibi diğer ölçümleri ile, daha uzun etkili olmaya devam etmektedir. Geçerli Denizatı Analizörü kurulumu kullanarak diğer sınırlılığı da zebrafish embriyolar ve genç larvalar için uygundur böyle de her adacık yakalama plaka içinde fiziksel alandır. Bu nedenle, metabolizma icrayetişkin balık diyete bağlı aşırı şişmanlık üzerinde ic çalışmalar, örneğin, henüz teknik olarak mümkün değildir. Ancak, bu çalışmada böylece olası analizleri kapsamında uzanan, özellikle çocuk ve yetişkin balık için tasarlanan plaka gelişimini teşvik edebilir.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> XF 24 ekstraselüler akı analizörü </td><td> Bioscience Seahorse </td><td> 100737-101 </td><td> 24 sıra biçiminde </td></tr><tr><td> Islet Yakalama mikroplak </td><td> Bioscience Seahorse </td><td> 101122-100 </td><td> 24 sıra biçiminde </td></tr><tr><td> XF kalibrant Çözüm </td><td> Bioscience Seahorse </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF deney ortamı </td><td> Bioscience Seahorse </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Petrol-Kırmızı-O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-fenil-2-tioüre (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (embriyonik orta) </td><td> Öz yapılan </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank"># wptohtml16 http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html</a> </td></tr><tr><td> 100X15 mm Petri kapları </td><td> Şahin </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomycin </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

Metabolizma alanında büyüyen bir gol mitokondriyal fonksiyon farklı yönleri üzerine genetiğin etkisini belirlemektir. Bu ilişkileri anlamak, diyabet ve obezite gibi mitokondriyal disfonksiyon ile bağlantılı hastalıkların bir dizi için altta yatan neden anlamanıza yardımcı olacaktır. Enstrümantasyon son gelişmeler, hücre hatları veya doku eksplantlar mitokondriyal fonksiyon farklı parametrelerin izlenmesi sağladı. Burada Denizatı biyobilim XF 24 ekstraselüler akı analizörü kullanılarak zebrafish embriyonik gelişim sırasında in vivo mitokondriyal fonksiyon parametrelerinin hızlı ve duyarlı bir analizi için bir yöntem mevcut. Bu protokol Islet Yakalama tek bir embriyo her bir kuyunun yer nerede, biyoenerjetik ölçümü sağlayan mikropleytin dahil kullanır: bazal solunum (i); ATP ciro nedeniyle (ii) bazal mitokondriyal solunum (iii) mitokondriyal solunum; (iv) mitokondriyal Kuplajsız solunum veya prOton sızıntı ve (iv) maksimum solunum. Bu yaklaşım, embriyonik zebrafish solunum parametreleri kullanarak yabani tip ve genetiği değiştirilmiş embriyolar (mutant gen aşırı ekspresyonu veya gen demonte) veya farmakolojik olarak manipüle olanlar arasında mukayese edilebilir. Bu protokol yayılması bu alakalı omurgalı hayvan modelinde in vivo metabolik bozuklukların genetik temeli analiz için yeni araçlar ile araştırmacılar sağlayacağı tahmin edilmektedir.

<html> Biz özellikle metabolizma, solunum hızı ve lipid metabolizması üzerine rolü belirli genleri anlamakla ilgilenen. Bu nedenle, bu gen tarafından kodlanan bir enzim, belirli bir farmakolojik inhibitör ile 26 hpf itibaren vahşi tip zebrafish embriyolar tedavi edildi. Yarım kalan% 4&#39;lük sabit iken 50 hpf, araç ve inhibitörü ile tedavi edilen embriyoların yarısı, mitokondriyal fonksiyon için Denizatı kullanılarak analiz edildi PFA 4 gecede ° C ve daha sonra Petrol-Kırmızı-O ile lipid birikimi için boyandı. Spesifik enzim inhibitörü ile tedavi özellikle telencephalon ve otik vezikül (Şekil 4B, C) ​​altında lipid birikimi bir artış ile ilişkili olduğu bazal solunum bir ~ 2 kat artış (Şekil 4A), açtı. pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Zebrafish embriyolar kimyasal arıtma şematik gösterimi. Yabani-tip, genetik manipüle veya farmakolojik tedavi zebrafish embriyo arka plan vardır. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Şekil 2. XF24 adacık plaka kurdu. (A) Dört kuyularının yalnızca sıcaklık kontrolü gibi embriyonik ortamı içeren (X ile işaretlenmiş) ve diğerleri / iyi bir embriyo içerir. (B) Close-up bir adacık yakalama ekranı (ok başı) kapsadığı araç (DMSO) ile tedavi edilen 50 hpf vahşi tip embriyo gösteren iyi bir (C6). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Şekil 3,. Respiratvahşi tip 50 hpf zebrafish embriyolar için iyon parametreleri. (A) Her bir ölçüm için, 20 bireysel embriyoların ortalama sunulmuştur. Bazal solunum (ortalama: 299.7, SS: 75.7; SEM: 16.9), maksimal solunum (ortalama: 387,4; SD: 93.3; SEM: 20.9), Yedek Solunum Kapasitesi (ortalama: 87.7, SS: 72.0; SEM: 16.1). (B) her ölçüm için, 20 tek sonuçların ortalaması gösterilmiştir. Bazal mitokondrial solunum; mitokondriyal Kuplajsız solunum ve non-mitokondrial solunum; ATP ciro nedeniyle mitokondriyal solunum. Mt: mitokondrial; SRC: Yedek Solunum Kapasite; SD: Standart sapma, SEM: Ortalama Standart Hatası. Sonuçlar O 2 pmol sunulmuştur tüketilen / dak / embriyo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Reprebazal solunum ve lipid birikimi üzerine kimyasal maddelere maruz kalma temsilsici sonuçlar. lateral görünümde Petrol-Red O ile boyandı (A, B) 50 hpf embriyo. Selektif inhibitörü (B) ile inkübe embriyo bir araç-tedavi edilen kontrol embriyo ile karşılaştırıldığında telencephalon (ok başı) ve otik vezikül (ok) altında daha fazla yağ-Kırmızı-O boyama görüntüler. (C) Bazal solunum kimyasal tedavi embriyoların (grup başına n = 10 embriyo) bir ~ 2 kat artış gösterir. Sonuçlar O 2 / dak / embriyo pmol sunulmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos at JoVE.com

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Metabolik çalışmalar için-kullanılan altında olmuştur güçlü bir omurgalı modeli temsil zebrafish. Burada ölçmek için hızlı bir şekilde tarif<em&gt; In vivo</emBöylece bu organizmanın uygulanabilirliği artan genetik veya farmakolojik olarak manipüle embriyolar arasında farklı mitokondriyal fonksiyon parametrelerinin karşılaştırılması sağlayan gelişmekte zebrafish&gt; metabolik profil,.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

metabolic-profile-analysis-of-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

19.8K Görüntüleme.  School of Medicine, Deakin University. Metabolik çalışmalar için-kullanılan altında olmuştur güçlü bir omurgalı modeli temsil zebrafish. Burada ölçmek için hızlı bir şekilde tarif In vivo metabolik profil,.

Video: Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...