Savunma Bakanlığı (Fikir Ödülü W81XWH-07-0406) - Ulus Atasoy için NIH RO1 A1080870 - Ulus Atasoy için NIH R21 A1079341 - Ulus Atasoy için Missouri Kurumsal Fonlar Üniversitesi - Ulus Atasoy için

Deney hazırlığı Deney başlamadan önce, tüm reaktiflerin, kapların ve gereçlerin RNaz ücretsiz sahip olmak önemlidir. DEPC-işlenmiş su ile çalkalayın RNaz inhibitörü (RNaseZAP, Ambion) ile cam davranın. Tüm reaktifler RNaz ücretsiz olarak teyit emin olun. 1. MRNP Lizat hazırlayın <ol><li> Büyümek ve her RIP için toplam protein 2-5 mg arasında üretmek katlanarak büyüyen doku hücreleri hasat. <ol class="lalpha"><li> İki P150 kültür kabı genellikle yeterlidir. </li><li> Her RBP araştırılmaktadır için, toplam hücresel sayısı ve protein miktarlarının uygun hedef mRNA ve RBP etkileşimlerini maksimize etmek için optimize edilmelidir. </li><li> QRT-PCR analizi için RIP, özellikle Hur, AUF1, TIAR gibi yüksek bolluk RBPs için kendi amplifikasyon ve tespit yöntemi nedeniyle daha az hücre lisatı (yaklaşık 400 mg toplam protein) gerektirebilir. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> 4 8-10 dakika ° C, 200 x g&#39;de santrifüj yoluyla topak hücreleri daha sonra, buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, yavaşça RNaz ve proteaz inhibitörleri ile hazırlanmış polysome lizis tamponu (PLB) eşit hacimlerde tüpün alt ve tekrar süspansiyon hücre pelletini fiske. <ol class="lalpha"><li> Bu hücre pelet tesisinin hacmini ölçmek için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Hücre kümeleri parçalayın ve 5 dakika buz üzerinde lizat inkübe yavaşça pipeti karışımı (vorteks yok). </li><li> 4. 20 dakika boyunca 13.000 xg&#39;de Santrifüj ° C enkaz lizat temizleyin. </li><li> Hemen ön soğutulmuş mikrofuge&#39;de tüp supernatant temizlenir aktarın. </li><li> -80 Buz ve deposunda tutun ° C. <ol class="lalpha"><li> Hemen dondurma hücrelerin uygun lizis tamamlar ve istenmeyen bağlayıcı önler. RIP hemen aşağıdaki örnek çözülme ile devam edin ve RNA bozulmasını önlemek için buz üzerinde örnekleri tutmak. &lt;/ Li&gt; <li> Bu lizat -80 altı ay boyunca saklanabilir ° C Bu protein ve / veya mRNA bozulması neden olabilir gibi tekrarlanan donma çözülme döngüleri kaçının. </li></ol></li><li> Standart Bradford Protein testi kullanılarak lizat protein konsantrasyonu ölçmek. </li></ol> 2. Antikor ve Yıkama ile kaplayın Protein A Sepharose Boncuk <ol><li> % 5 BSA ile NT2 tamponu (3-4 cilt) gecede Pre-kabarma protein A Sepharose (PAS) boncuk. 4 ° C&#39;de depolayın <ol class="lalpha"><li> 4 azından birkaç ay kadar uzun süreli depolama ° C% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş zaman mümkündür. </li><li> Protein Sefaroz boncukları hedef RBP antikor izotipi göre seçilmelidir. Proteinler A, G, A / G tüm spesifik izotip hedefleri var ve hedef benzeşim değişir. Protein A Sepharose boncuk Hur protein antikor izotip özgünlüğü için ve afinite göre kullanılmıştır. </li></ol></li><li> Kullanmadan önce, bu yüzden, aşırı NT2 tampon kaldırmaktampon oranı nihai boncuk 1:1 dir ki. </li><li> 1.5 ml RNAse ücretsiz mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, PAS bulamaç 100 ul kaldırmak ve her IP reaksiyonu (örneğin, belirli RBP ve izotip kontrol) için antikor 30 mikrogram ekleyin. </li><li> Antikor boncuk karışımı NT2 tampon 100-200 ul ekleyin. <ol class="lalpha"><li> Karışım 4 birkaç hafta saklanabilir ° C% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş zaman. </li><li> Aynı türden bir izotip-eşleştirilmiş antikor ya da bütün serumu arka plan RNA karşı bir antikorun kontrol olarak paralel olarak kullanılmalıdır. </li></ol></li><li> Boncuk karışımı uygun antikor ekleyin ve 4 ucuna sonuna yuvarlanan, gece inkübe ° C <ol class="lalpha"><li> (Antikor 1, 5, 10 veya 30 mg genellikle yeterlidir) araştırılmaktadır spesifik protein antikor titresi optimize edin. </li></ol></li><li> 1 ml yıkama ile, kullanımdan hemen önce, antikor-kaplı boncukların hazırlanmasıbuz NT2 tampon 5 kez. <ol class="lalpha"><li> 4 az 1-2 dakika ° C için 13.000 x g&#39;de santrifüj ile Boncuk karışımı yıkayın </li><li> Dikkatlice elle pipet veya aspiratör ile süpernatantından maksimum miktarda kaldırmak ancak pelet bozmamak için dikkatli olun. </li><li> Yıkama antikor karışımı ile ilişkisiz antikor gibi, RNaz kirletici maddeleri temizlenmesine yardımcı olur. </li></ol></li><li> Bir kez son yıkama işleminden sonra, 100 mM, 40 U / ml &#39;den, 10 ul az RNaz 10 ul dışarı dahil olmak üzere, hedef mRNA korumak için çeşitli RNaz inhibitörleri ile muamele, ardından buzda soğutulmuş tampon NT2, 700 ul içinde tekrar süspansiyon boncuk DTT ve 15 ul EDTA (15 mM). NT2 tamponu ile 1.000 ul hacim getir. <ol class="lalpha"><li> Vanadyl Ribonükleozit kompleksleri EDTA inhibitör etkisine bağlı olarak kullanılmaz. </li></ol></li></ol> 3. Immünopresipitasyon ve RNA Yağış <ol><li> İsteğe Preclear Adım:<ol class="lalpha"><li> Arka planı azaltmak için, boncuk ve kontrol antikoru ön berrak lisatı için kullanılabilir. Bu, çıkış sinyal azaltabilir. </li><li> Bu adım mikrodizi ardından IP yaparken arka planı azaltmak için gerekli olabilir. Genellikle qRT-PCR tarafından takip IP için gerekli değildir. </li><li> Preclear 30 dk / 4 ucuna ° C yuvarlanan sonu için izotip kontrol 15 mikrogram ile. </li><li> Adım 2.1 &#39;dan antikor ile kaplı olmayan preswollen PAS boncuklar 50 ul ekle. </li><li> Ucu üzerinde 30 dak / 4 ° C rotasyon sonu ile inkübe </li><li> 4 ° C&#39;de 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin IP için süpernatant kaydedin. </li></ol></li><li> Hazırlanan antikor karışımı izole temizlenir lizat (yaklaşık 2-5 mg) 100 ul ekleyin. <ol class="lalpha"><li> Lizat Sulandırma arka plan ve nonspesifik bağlayıcı azaltmaya yardımcı olacaktır. </li><li> Lisatı giriş miktarı tespit yöntemi ve RBP o bolluğu bağlı olarak değişebilirRBP antikor r verimliliği gibi adım 1.1.c. belirtildiği </li></ol></li><li> (İsteğe bağlı) hemen yavaşça 4 10.000 xg&#39;de kısa santrifüj izledi birkaç kez hafifçe vurarak tüpü karıştırın ° C pelet boncuk ve derhal standart RNA izolasyonu teknikleri kullanarak qPCR analizi için toplam giriş mRNA temsili olarak süpernatant 100 ul çıkarın. <ol class="lalpha"><li> Bu adım, o giriş lizat RNA IP için en iyi olduğunu ve sadece bir onay adımı olarak veya kötü RNA sonuçları RIP sonrasında bir sorun giderme adımı olarak yapılmalıdır onaylamak içindir. </li></ol></li><li> Parafilm içinde Wrap tüpün ucuna sonuna yuvarlanan, 2 ila 4 saat boyunca 4 de sızdırmazlık ve inkübe ° C sağlamak. <ol class="lalpha"><li> Inkübasyon Zamanlama hedef bereket göre optimize edilmeli ve karmaşık düzenini veya bozulmasını önlemek için minimize edilmelidir. Bazı RBPs için kısa inkübasyonlar daha uygun olabilir. </li></ol></li><li> 5.000 xgf at Pelet boncukveya 5 dakika 4 ° C ve Western blot ile potansiyel analizi için süpernatant kaydedin. -80 Mağaza alikotları ° C <ol class="lalpha"><li> Kalıntı hedef proteinin yüksek miktarlarda yüzey maddesinin alikotları Sepharose boncuklar bir çökeltisi ile proteinin bir hata göstergesi olabilir. </li></ol></li><li> Daha önce anlatıldığı gibi, buz gibi soğuk tampon NT2 ve santrifüjleme 1 ml gomalaklar, 5 kez yıkayın (4, 5 dakika boyunca 5,000 x g ° C) sonra el pipet ya da bir aspiratör ile süpernatant çıkarın. <ol class="lalpha"><li> Daha sıkı yıkama yöntemleri sodyum deoksikolatın, üre ya da SDS ile NT2 tamponu ilave etmek suretiyle arka planı azaltmak için de kullanılabilir. </li><li> Buz mümkün olduğunca ilgili örnekler tutun ve hedef mRNA yıkımı en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışıyoruz. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı: Western blot analizi kullanılarak hedef proteinin etkinliğini kontrol etmek için IP boncuk karışımı, küçük bir kısım (% 10) tasarruf veya paralel olarak ilave numune çalıştırın.</li></ol> 4. DNaz ve Proteinaz K Tedaviler <ol><li> Yıkamadan sonra, NT2 tampon 100 ul ile tekrar süspansiyon boncuk RNase içermeyen DNase 1 (2 U / ul) 5 ul ile desteklenmiştir. </li><li> 5-10 dakika süreyle 37 ° C&#39;de saklayın. NT2 tampon 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5,000 x g de santrifüjlenir. <ol class="lalpha"><li> Boncuklar bir küçük (~% 10) kısım SDS-PAGE analizi ile IP etkinliğini kontrol etmek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> 100 ul tampon NT2, 5 ul proteinaz K (10 mg / ml) ve 1 ul% 10 SDS içinde yeniden süspanse PAS pelet. </li><li> Nazikçe her 10 dakikada flicking, 55 ° C su banyosu içinde 30 dakika boyunca yeniden süspanse boncuk karışımı inkübe edin. <ol class="lalpha"><li> Proteinaz K RNP bileşenlerinin serbest yardımcı olacaktır. </li></ol></li><li> 5 oda sıcaklığında (RT) dk ve süpernatant (~ 100 ul) toplamak için 5000 xg&#39;de Pelet boncuk. </li><li> Boncuk 200 ul NT2 tampon, santrifüj ekleOda sıcaklığında 2 dakika için 5000 x g&#39;da füg, süpernatant (~ 200 ul) eklendi ve atın boncuk toplamak. </li><li> Süpernatantlar (100 ul ve 200 ul) birleştirin ve asit fenol-CHCl3, 300 ul alt tabaka ilave edin. </li><li> Vortex, 1 dak RT (veya 37 ° shaker C) ve 1 dakika oda sıcaklığında 16.000 g&#39;de santrifüj. </li><li> Üst tabakanın 250 ul (arayüz bozabilir ETMEYİN) toplayın, pH 5.2, 625 ul% 100 ETOH ve 5 ul glycoblue az 25 ul sodyum asetat ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> -20 ° C de bir gece boyunca saklayın <ol class="lalpha"><li> RNA&#39;nın düzgün iyileşme sağlamak için, glycoblue ilavesiyle bir taşıyıcı molekül olarak hareket ederek RNA pelet görünürlüğünü artıracaktır. </li></ol></li><li> Ertesi gün, ters çevirme ile 3-5 kez karışımı tüpler, 30 dakika boyunca 4 12,000 xg&#39;de sıkma ° C ve süpernatan atılır. </li><li> Mavi pelet ve inversiyon veya vorteks ile karıştırın% 70 ETOH 1 ml ekleyin. </li><li> 2 dakika süreyle 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> DSüpernatant iscard ve 4 az 1 dakika için 12.000 x g santrifüj edilir ° C. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir pipet ve hava kuru pelet ile herhangi bir kalıntı% 70 ETOH çıkarın. </li><li> RNaz / DNaz ücretsiz su veya gerektiği gibi başka bir uygun ses 20-40 ul süspanse edin. <ol class="lalpha"><li> Örnek şimdi bu tür qRT-PCR veya mikroarray gibi, daha aşağıda uygulama için hazır hale gelir. </li><li> Nanodrop spektrofotometre örnek konsantrasyon değerlendirilmesinde kullanılabilir, ancak değerli örnekleri ile, bu savurgan ve nispeten yanlış olabilir olarak nanodropping örnekleri önlemek için yararlı olabilir. Biz değerli veya düşük verim örnekleri için saflık ve IP etkinliğini değerlendirmek için temizlik gen transkript normalizasyon örnekleri öneririz. </li></ol></li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Prosedürü iyileştirilmiş ve doğru yapılırsa, immünopresipitasyon mRNA hedeflerin belirgin zenginleşme boyun eğmek zorundadır. GenellikleQRT-PCR ile değerlendirildiği zaman 50 kat -, RBP ve mRNA hedef (ler) bağlı olarak, biz yaklaşık 10 zenginleştirme bakın. RBPs Birçok hedefleri mikroarray analizi kullanılarak topluca tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem qRT-PCR ile karşılaştırıldığında bozulmaya karşı daha duyarlıdır. RBP bağlı olarak, hedefleri ve reaksiyon verimini sayısı, mikro yeni hedeflere yüzlerce ortaya çıkarabilir, ya da eğer varsa, sadece bir kaç ortaya çıkarabilir. Örneğin, iyi karakterize edilen RNA bağlayıcı proteinler Hur biri, post-transkripsiyonel olarak çok önemli fizyolojik genler 1, 2, ekspresyonu ve çeviri kontrol eder. Göğüs kanser hücre dizilerinde RIP-çip üzerinden Hur-ribonucleo-kompleksinin izole edilmesi, örneğin, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi qRT-PCR kullanılarak β-aktin dahil olmak üzere, pek çok önemli bilinen Hur hedefleri, zenginleştirilmesi saptandı. Kanseri hücre hatları hem de β-aktin 12 zenginleştirilmiş - 15 kat. Tipik olarak, uygun yapıldığı takdirde biz önemli bir enr bakınhücre hatlarının çeşitli β-aktin ichment. RIP β-aktin için önemli bir zenginlik ortaya değilse Ancak, bu RIP ile ilgili bir sorun olduğunu gösterir ve prosedürü tekrar edilmesi gerekebilir. Ayrıca, bu hücre hatları immunoprecipitated örnekleri mikroarray çeşitli östrojen reseptörü Hur hedeflerin farklı ifade alt (ER) olarak ER negatif MB-231 göğüs kanseri hücre çizgileri karşı pozitif kanser MCF-7 hücreleri Şekil 2, 1 de gösterilmiştir saptandı. Ya ilişkili veya kanser ile ilişkili değildi bilinen ve bilinmeyen Hur hedefleri: Bu hedefler birkaç kategoriye ayrılır. Örneğin, CALM2 CD9 ve hem de daha önce Hur hedefler olarak tespit edilmemiştir kanser genlerdir. 180-kat Hur protein ve hedef genler arasında belirgin bir etkileşim gösteren Hur pelet içinde zenginleştirilmiş - qRT-PCR, CALM2 ve CD9 ile mikroarray kullanılması ile teyit 5 olduğu bulunmuştur. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Şekil 1&quot; /&gt; Şekil 1. Immünopresipitasyon ve MB-231 içinde RIP (ER-) ve MCF-7 (ER +) meme kanseri hücreleri. Immunoprecipitations anti-Hur monoklonal antikor (3A2) ve IgG1 izotip kontrol kullanarak MB-231 veya MCF-7 hücre lizatları gerçekleştirildi. 3A2 tarafından tespit edilen Hur A. IP Batı beklenen boyutu bant saptandı. Sağdaki Panel yükleme kontrolü olarak β-tubulin ile, hem hücre hatları kullanılmaktadır lizatları giriş Hur miktarlarda ortaya koymaktadır. Kantitatif RT-PCR ile B. Kontrol sırasıyla MB-231 ve MCF-7, gelen 3A2 IP olarak, β-aktin-on beş, on kat zenginleşme, bilinen bir Hur hedef gösterdi. Tüm ΔΔCT değerler GAPDH normalize edildi. Deneyler, (n = 2), iki kopya halinde yapıldı. <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Hur RIP CHIP ER + ve ER-meme kanseri hücrelerinde farklı genetik profilleri tanımlar.Hur immunoprecipitations MB-231 veya Hur antikor ve Illumina Sentrix diziler (47,000 genler) ile melezleştirilebilir IgG1 izotip kontrol kullanarak MCF-7 hücre lizatları gerçekleştirildi. Kontrol sinyalleri çıkartılmıştır. Sonuçlar 12 farklı diziler gelen kümülatif verileri temsil eder. Deneyler, uygun kontroller ile her bir hücre hattı için üç kopya (n = 3) olarak yapılmıştır. Scales log2 vardır.

<ol>
	<li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer.">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li><li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis.">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li><li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP-Chip:+the+isolation+and+identification+of+mRNAs,+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts.">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li><li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonomics:+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays.">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera.">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+RIP-Chip+Analysis.">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li><li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR.">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li><li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR:+post-transcriptional+paths+to+malignancy.">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors.">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li><li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery.">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li><li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export.">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li><li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability.">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Bu deneyde, optimizasyon ve deneyim doğası nedeniyle başarıyla amaçlanan sonuçları elde etmek için sadece garantili yolu olacaktır. Bu işlem birçok adım olarak, sıcaklık ve reaktifler ve ürünlerin etkin kullanım kritik önem taşır. Uygun planlama ve tekniğin uygulanması deney önerilen optimum sıcaklıkta uygun bir süre içinde yapıldı sigorta yardımcı olacak. RNA izolasyonu deneyler ile önemli bir sorunu RNaz azalmayla RNA&#39;ların hassasiyetidir. Tüm reaktifler RNaz ücretsiz ve saklanan veya RNaz ücretsiz kaplarda kullanılan olması gerekir. Bu mRNA örnek bütünlüğünü sağlamak için önemli bir adımdır. Deney, doğru uygulanmak bile, bununla birlikte, arzu edilen sonuç RBP ve hedef mRNA arasındaki etkileşimin doğasını dolayı elde edilemez. Bir potansiyel sorun düşük veya RIP-Chip izole RNA hatta hiçbir sinyal yaşıyor.Total RNA sinyali olabilir rağmen, bu boncuklar tarafından aşağı çekilerek yetersiz bağlayıcı protein sonucu olabilir. İlk sorun giderme adımı kullanılan hücresel lizat belirli RBP yeterli ifadesi olduğunu teyit etmektir. Teyit sonra, protein nihai NT2 yıkamadan sonra izole edilebilir ve 5 dk için Laemmli tampon ya da başka bir uygun denatüre edici tampon içinde yeniden asıldı ve 95 ° C&#39;ye ısıtılmış. Western blot analizi yeterli ilişkili protein aşağı çekme sağlamak için giriş lisatı hem de negatif kontroller ile koordineli olarak bu örnekler üzerinde kullanılabilir. Bundan başka, hücre parçalama bu bileşenlerin ulaşmak için gerekli olduğu için, normal olarak ayrılan proteinler ve mRNA arasında anormal ve istenmeyen etkileşimler için potansiyel sokulabilir. Bu etkileşimler potansiyel bağlamak ve nonspesifik etkileşimler aracılığıyla hedef mRNA veya bağlayıcı proteinler &quot;içinize çekin&quot; olabilir. Bu değişen co Ayrıca, proteinlerşulları çoklu varyasyonlarda katlayabilirsiniz ve bağlayıcı motifleri bunların etkileşimi engelleyerek, kendi hedef mRNA için erişilemez hale gelebilir. Bunların her ikisi de verimli çalışma yanı sıra bu istenmeyen etkileşimler sınırlamak için listelenen en uygun sıcaklıklar kullanmanın önemini güçlendirmektedir. Ayrıca, belli bir hedef protein için yıkama koşulları optimize etkileşim saflığı en üst düzeye çıkarmak için önemli olacaktır. Daha sıkı yıkama koşullarına tabi olabilir. Örneğin, yıkama tamponu SDS ya da sinyal çıkışı da spesifik olmayan etkileşimleri ve arka planı azaltmak için ürenin uygun bir miktarda ilave edilebilir. Bu deneycinin hedef RBP yanı sıra bunların tek fizyolojik koşullar altında hedef mRNA üzerinde tamamen bağlı olacaktır. Bazı koşullar örneklerinin hazırlanması belirtilmelidir belirli mRNA analizi araçları için uygun olmayacaktır. Sonunda, olsa RIP RNA zenginleşmesine başarılı-RBP etkileşimleri, RIP (CHIP) yöntemi ile bilinen bir sorunu geçici mRNA hedeflere RBP belirli bağlayıcı etki tespit etmek yetersizliğidir. Çeşitli çapraz bağlama teknikleri benzersiz dizi hedef izole etmek için RIP takiben de kullanılabilir, ancak kısa dalga boyunda UV kullanımı nükleik asit hasara yol açma eğilimindedir. PAR-CLIP veya photoactivatable Ribonükleozit çapraz ve immuoprecipitation olarak bilinen yeni bir yöntem istikrarlı ve geçicidir hem RNA etkileşimi benzersiz bağlanma yerlerinin tanımlanmasına izin veren yeni doğmakta olan RNA&#39;ya thiouridine dahil uzun dalga UV kullanır. Genel olarak, RIP-Chip grubumuzun yanı sıra diğer birçok araştırma grubu tarafından RNA bağlayıcı proteinler ve mRNA hedefleri arasındaki etkileşimleri yalıtmak ve incelemek için kullanılan mükemmel bir araç olarak kurulmuştur. Doğa ve uygulamada hassas olsa da, bu işlemin uygun yürütülmesi son zamanlara kadar, inacc olmuştur bu RNP komplekslerin izolasyonu, verecektirkeşif ve analiz için essible.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 1 M ditiotreitol </td><td> Balıkçı </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNaz 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNaz ücretsiz </td></tr><tr><td> Tetraccetic Asit ethylendiamin </td><td> Balıkçı </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glikojen </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7.0 &#39; </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Balıkçı </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl2 </td><td> Balıkçı </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Tampon </td><td> * Aşağıda bak </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysome Lizis Tampon </td><td> * Aşağıda bak </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl tabletler </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Protein A Sepharose boncuk </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Balıkçı </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü Out RNaz </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ul </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Balıkçı </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat </td><td> Balıkçı </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCI </td><td> Balıkçı </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7.4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Vanadyl Ribonükleozit Kompleksi </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif İncelemeler </td></tr><tr><td> RNaz / DNaz ücretsiz, DEPC işlenmiş cam reaktifler hazırlayın </td></tr><tr><td> Polysome lizis Tampon </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES (pH 7.0) </td></tr><tr><td> % 0.5 NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 ünite / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 400 mcM VRC </td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl tableti </td></tr><tr><td> Polysome lizis tamponu 5 mL </td></tr><tr><td> 1 M HEPES 50 ul (pH 7.0) ekleyin </td></tr><tr><td> 1 M KCL 500 ul </td></tr><tr><td> 1 M MgCl2 ve 25 ul </td></tr><tr><td> NP40 ve 25 ul </td></tr><tr><td> 4.7 ml RNase-DNaz-serbest H 2 O </td></tr><tr><td> 1 M DTT ve 50 ul </td></tr><tr><td> 100 U / ml RNaz 12.5 ul Out </td></tr><tr><td> 200 ul Proteaz inhibitörü kokteyl (üreticiye göre çözünmüş) </td></tr><tr><td> 10 ul 200 mM VRC (kullanım sırasında) </td></tr><tr><td> NT2 Tampon </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> % 0.05 NP40 </td></tr><tr><td> NT2 Tampon 1 L </td></tr><tr><td> 50 ml Tris (pH 7.4) </td></tr><tr><td> 30 ml 5 M NaCI </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 ul NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml RNase-DNaz-serbest H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

Yüksek işlem dizileme ve verimli mikroarray gelişiminin bir sonucu olarak, küresel gen ekspresyon analizi veri toplama ve kolay bir kullanıma hazır formu haline gelmiştir. Ancak pek çok araştırma ve hastalık modellerinde, hedef genin mRNA kararlı durum seviyeleri her zaman doğrudan kararlı durum protein düzeyleri ile ilişkili değildir. Post-transkripsiyonel gen regülasyonu ikisi arasındaki farklılığın olası bir açıklamadır. RNA Bağlayıcı Proteinler (RBP) bağlama tarafından Driven, post-transkripsiyonel regülasyonu hedef mRNA ile ribonükleoprotein (RNP) kompleks oluşturarak mRNA lokalizasyonu, istikrar ve çeviri etkiler. RNP karmaşık hücresel özlerinden bu bilinmeyen de novo mRNA hedeflerin belirlenmesi anlayışı mekanizmaları ve RBP ve protein miktarı üzerine oluşabilecek etkisi fonksiyonları için kilit önem taşımaktadır. Bu protokol, s tanınabilir RNP immünopresipitasyon-mikrodizi (RIP-Çip) olarak adlandırılan bir yöntem önerilmektedirdaha bireysel araştırmacı için bir deney optimize etmek için seçenekleri ile birlikte pecific mRNA&#39;ların, değişen deneysel koşullar altında, ribonükleoprotein kompleksi ilişkilidir. Bu önemli deneysel aracı sayesinde araştırmacılar, post-transkripsiyonel gen regülasyonu yanı sıra diğer ribonükleoprotein etkileşimleri ile ilişkili karmaşık mekanizmalar keşfedebilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip at JoV

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

27.4K Görüntüleme.  University of Missouri. RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

Video: Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biyoloji

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Prosedür bitki özleri gelen Dağınık Parçacıkların çıkarması için Flokülantlar Verimliliği değerlendirin

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...