Bu yöntem, karmaşık örneklerden ve bakteriyofaj esaslı tanı ve tedavilerden bakteriyofajların numaralandırması ile ilgili viroloji ve mikrobiyoloji alanlarındaki temel sorunların yanıtına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, geleneksel tahlillerle mümkün olmayan çok sayıda faj görüntü biyopanning deneylerinden elde edilen çok sayıda numunenin zaman verimli ve doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamasıdır. Prosedürü gösteren Rashmi Mohanty ve Jasmim Leal, benim laboratuvar dan lisansüstü öğrenciler olacaktır.
Astarları tasarladıktan ve stok konsantrasyonu oluşturduktan sonra, mikrolitre başına 0,1 mikrogram konsantrasyonla referans T7 faj DNA'sı elde edin. Ultra saf su kullanarak, 0.2 mililitre PCR tüplerde mikrolitre başına bir milyon femtogramdan mikrolitre başına bir femtograma kadar bu DNA'yı on kat daha fazla seyreltin. Her konsantrasyon20 mikrolitre hazırlayın, pipet ipuçlarını değiştirmek ve seyreltme her aşaması arasında tüpler girdap emin olun.
Daha sonra T7 faj referans DNA konsantrasyonunu mikrolitre başına femtogramdan mikrolitre başına genom kopyalarına dönüştürün. İlk olarak, pipet 200 mikrolitre numune T7 faj klon 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp her 10 istenen örnekler için. Her tüpe iki mikrolitre DNase ekleyin.
Tüpleri kaplayın ve ısıtılmış kuru banyoda 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sonra 100 derecede 15 dakika ısıtılmış kuru banyoda kuluçkaya yatırın. Isıl işlem görmüş fajları içeren tüpleri 18, 534 kez g 10 saniye santrifüj edin.
Fantazileri karıştırmak için 10 saniye boyunca dokunmatik aktivasyon modunda ayarlanmış bir girdap karıştırıcıüzerine santrifüjlü tüpler yerleştirin. 10 saniye boyunca 18, 534 kez g tekrar döndürün. Bundan sonra, oda sıcaklığına kadar soğutmak için yaklaşık bir saat laboratuvar bankında örnekleri bırakın.
QPCR premixini bilinmeyen konsantrasyondaki 10 biyopanned faj örneği ve trilikatta standart konsantrasyonlardan yedi örnek için hazırlayın. 255 mikrolitre qPCR ana karışımı, 51 mikrolitre astar ve 102 mikrolitre su içeren 51 numune için premix elde edin. Aliquot hazırlanan PCR sekiz mikrolitre 96-iyi qPCR plaka 51 kuyuiçine karıştırın.
Daha sonra bu kuyuların her birine ısıl işlem görmüş T7 faj örneklerinin iki mikrolitresini ekleyin ve qPCR premixinin yüzeyinin altına dağıtın. Yapışkan film kullanarak plakayı kapatın. Floresan fotoğraf ağartma en aza indirmek için alüminyum folyo plaka sarın ve daha sonra qPCR ekipman plaka çalıştırmak için devam edin.
Metin protokolünde belirtildiği gibi döngü koşullarını ve erime eğrisi ayarlarını ayarlayın. QPCR çalıştırıldıktan sonra, amplifikasyon çizimi, erime eğrisi çizimi ve çok bileşenli çizim ham verilerden analiz edilir. Amplifikasyon çizimi, her bir örneğin PCR amplifikasyonunun başarılı olup olmadığını gösterir.
Çok bileşenli çizim, amplifikasyon döngüleri boyunca floresan sinyalin amplifikasyonunu ve çürümesini temsil eder. Her PCR ürününün benzersiz bir erime sıcaklığı olduğundan, erime eğrisi çizimi astarların özgüllüğünü doğrulamak için kullanılır. Standart eğri daha sonra referans DNA'dan oluşturulur.
Burada amplifikasyon verimliliği bir qPCR çalışmadan% 92.4 Temsili veri olarak hesaplanır sonra mikrolitre başına 10 ila 10 milyon genom kopyaları test aralığında bir çift katmanlı plak testi ile ölçülen aynı faj ile karşılaştırılır. Burada görüldüğü gibi, qPCR niceliklerinde faj sayısı plak testinden daha yüksektir. Varyans katsayısı ile temsil edilen qPCR yönteminin tekrarlanabilirliğinin 2,85 ile %27,2 arasında değişen değerlere sahip olduğu görülmektedir, bu işlem denenirken, numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesi ve hazırlanması ve ilgili ekipmanların kalibrasyonu da dahil olmak üzere, qPCR'nin geliştirilmesi ve kullanımında çok sayıda husus un bulunduğu unutulmamalıdır.
Bu yöntemden sonra, karmaşık çevre örneklerinde vivo biopanning, faj kütüphanesi DNA hazırlama ve yeni nesil sıralama ve faj tespiti dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda faj partiküllerini sayısallaştırmak için başka teknikler de yapılabilir. Fajların laboratuvarda biyolojik tehlike olarak görüldüğünü ve eldiven ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin prosedürü gerçekleştirirken her zaman giyilmesi gerektiğini unutmayın.
