<img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 papain ile sistatin B kompleks (mavi) (sarı), üç boyutlu yapısı. Mutasyona uğramış sistatin B artıkları kırmızı renkte gösterilmiştir. 1. Biacore Sistemleri kullanarak Etiket Etkileşim Analizi İlkeleri Biacore sistemini kullanarak tipik bir etiket bağlayıcı deneyde, biyomolekülün &#39;ligand&#39; bir sensör çipi yüzeyinde bağlı olarak nitelendirdi. Bir akış kanalları sistemi, algılama yer alan yonga yüzeyi ile temas &#39;analit&#39; olarak adlandırılan bağlayıcı ortağı getiriyor. Analit ligand bağlanır, yüzeyde biriken kitle olarak ortaya çıkan değişim yüzey plazmon rezonans (SPR) tarafından tespit edilmiştir. SPR yanıt bağlayıcı analit miktarı ile doğru orantılıdır. Bağlayıcı gerçek zamanlı olarak ölçülmeye başladığından beri, kinetik dernek ve belirli bir etkileşim için disosiasyon hız sabitleri tespit edilebilir. Bu sabitleri, yakınlık denge asitlik sabiti olarak hesaplamak mümkündür. Bu kararlı durum veri bağlama yakınlık hesaplamak için de mümkündür. Benzer bir yöntem de, yüzey üzerinde özel bir ligand bağlanır bir protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılır. 2. Bir protein-protein etkileşimleri kinetik özellikleri analizi Biacore X100, kinetik analiz tek döngüsü kinetiği kullanılarak yapılabilir. Tek bir döngüsü kinetik deneyde, analit konsantrasyonu serisi enjeksiyonlar arasındaki yüzey yenilenme olmadan tek bir analiz döngüsü enjekte edilir. Uygun yenilenme koşulları bulmak zordur Bu nedenle, tek-döngüsü kinetiği, kinetik analiz sağlar. Kinetik bir deney için veriler tahsil edildikten sonra, Biacore X100 değerlendirme yazılımı bir etkileşim modeli veri uyan k, k, d ve K D değerleri üretir. 3. Protein Konsantrasyonu Belirlenmesi Yaklaşımlar Biyomoleküllerin arasındaki etkileşimler incelendiğinde, kendi işlevlerini anlamak için önemlidir. Nükleik asit bağlayıcı proteinlerin diğer proteinleri karakterize, ya da küçük moleküllerin biyokimyasal araştırma için temel ve ilaç keşfi de dahil olmak üzere diğer birçok alanda kullanım bulur. Iki etkileşen proteinler arasındaki etkileşim kinetiği doğru ölçümü için analit olarak kullanılan deneysel örnek özellikle bağlayıcı protein konsantrasyonu bilmek şarttır. A 280 veya kolorimetrik testleri gibi bir spektrofotometre okuma Bradford reaktifi istihdam genellikle total protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılır. Ancak, protein kirleri sonucu etkileyebilir. Daha da önemlisi, protein hem aktif ve inaktif formları, total protein konsantrasyonu dahildir. Özellikle yanlış katlanması nedeniyle inaktif olabilir rekombinant proteinlerin, durumunda, bu örnek özel bağlayıcı protein yüzdesini belirlemek önemlidir. Biacore X100, belirli bağlayıcı aktivite ilgili konsantrasyon ya bilinen bir standart ya da daha yakın bir zamanda tanıtıldı metodoloji Kalibrasyon Konsantrasyon Analizi (CFCA) kullanılarak elde edilen kalibrasyon eğrisi için bağlayıcı tepki düzeylerinin karşılaştırılması ile belirlenir. CFCA bir standarda bağlı değildir. Bu nedenle, CFCA standartlar genellikle mevcut değildir proteinlerin mutant formları, eğitim söz konusu olduğunda özellikle yararlıdır. Çip yüzeyine örnek difüzyon hızı sınırlayıcı bir CFCA deneyde, ilk bağlama oranı koşullarda farklı debilerde ölçülen. İlk bağlama oranı 1,2 belirli bağlayıcı konsantrasyonu hesaplanırken analitin difüzyon katsayısı, akış hücresi ve akış oranları boyutları dikkate alınır. Kinetik deneyde, analit konsantrasyonu kinetik örgütlenme oranı sürekli ve deneysel veriler yakınlığı hesaplanmasında kullanılır. CFCA ve Biacore sistemlerde kinetik ölçüm hem de aynı etkileşim özelliklerine güveniyor. Bu nedenle, Biacore analizi tarafından belirlenen belirli bağlayıcı konsantrasyonu, yerine toplam protein konsantrasyonu, sonuçların güvenilirliğini artırır. 4. Sistatin B ve Papain Arasında Etkileşim Karakterizasyonu için Biacore analizi kullanarak Memeli sistatin B Bu proteinler başlıca nons katılan papain sistein proteinazı gibi, öncelikle katepsin B, H, K, L ve S. geri dönüşümlü, rekabetçi ve sıkı bağlayıcı protein inhibitörüseçmeli hücre içi protein parçalanması. Cystatins bu enzimler tarafından uygunsuz proteoliz hücre ve dokuları korumak için olduğu tahmin ediliyor. Ayrıca, parazitler ve virüsler sistein proteinazı inaktive gibi enfeksiyöz ajanların işgaline karşı savunma katılabilir. Buna ek olarak, cystatins, papain olarak sık sık bir model enzim yapı-işlev çalışmalarında olarak kullanılan birkaç bitki sistein proteinazı, inhibe ederler. Inhibitörü taraftan, N-ve C-terminal uçları ve iki adet saç tokası döngüler tarafından sağlanan, hidrofobik kişiler, iki protein arasındaki etkileşimi hakim olduğu papain 3 gösterileri ile sistatin B kompleks üç boyutlu yapısı ( Şekil 1). Bu çalışmada, sığır sistatin kullanarak papain bağlama için C-terminal uç ve sistatin B ikinci bağlayıcı döngü önemini incelemek papain ile etkileşim alanlarında nokta mutasyonları içeren B varyasyonları. Biz belirli bağlayıcı kullanılan dört sistatin B türevleri konsantrasyon, vahşi tip proteinin yanı sıra ilk kez belirler. Aktif sistatin B belirli bağlayıcı konsantrasyonu belirlendikten sonra, yabani tip ve mutant türevleri sistatin B papain için bağlayıcı oranı ve sıhri sabitleri Biacore X100 kullanılarak ölçülür. 5. Cihaz ve Reaktifler <ol><li> Sistatin B türevleri Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly Cys3Ser/Tyr97Ala ve Cys3Ser önceden 4 açıklanan üretilmektedir. Tüm mutantlar sistatin B. disülfit bağlantılı inaktif dimerleri oluşumunu önlemek için, konumu 3 serin için ek bir ikame sistein içerir </li><li> Daha önce 5 açıklandığı gibi papain hedefi de hazırlanır. S-(methylthio), katalitik olarak inaktif proteaz render aktif yarık Cys25 bağlı bir methylthio grubuna sahip papain (MMTS papain). </li><li> Biacore X100 Plus Paketi ile Biacore X100, belirli bağlayıcı konsantrasyonu ve bağlayıcı kinetiği ölçmek ve analiz etmek için kullanılır. </li><li> MMTS papain Biacore Amine Kaplin Kiti kullanarak Sensör Çip CM5 immobilize. </li><li> Çalışır, 25 ° C&#39;de ve tampon pH 7.4 &#39;de 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0,0034 M EDTA, ve% 0.05&#39; polisorbat 20. </li><li> Sistatin B her varyant arasında, sensör yüzeyi 10 ul / dk akış hızında 30 saniye süreyle 20 mM NaOH ile yeniden oluşturulur. </li></ol> Ligand MMTS-papain, 6.Immobilization Kovalent eklenti MMTS-papain CFCA analizi CFCA analit molekülleri yüzeye difüzyon (toplu taşıma sınırlaması) oranı ile sınırlı koşullar altında bağlama oranı ölçümü dayanmaktadır. Bu ligand yüksek immobilizasyon seviyeleri tarafından tercih edilmektedir. MMTS-papain immobilizasyonu kurmak ve Biacore X100 Control yazılımı immobilizasyon sihirbazı kullanarak çalışacak. <ol><li> Succinimide (NHS) ve carbodiimide (EDC) 7 dakika 10 ul / dk akış hızında bir karışımı enjeksiyon yüzey akış hücresi 2 etkinleştirin. Flow hücre 1 referans yüzey olarak kullanılmak üzere değiştirilmeden bırakılır. </li><li> 50μg/ml az 5 ul / dk akış hızında 15 dakika boyunca pH 4.5 sodyum asetat tamponunda MMTS-papain enjekte edilir. </li><li> Etanolamin 7 dakika 10 ul / dk kalan aktif esterleri devre dışı bırakmak için bir akış hızında enjekte edilir. </li></ol> Tüm kaplin prosedürü neden ~ 3000 akış hücresi 2 immobilize RU MMTS-papain. Kinetik analizi için MMTS-papain Kovalent eklenti Tek fark kinetik analizi, immobilizasyon düzeyinde bağlayıcı oranı difüzyon ile sınırlı olma önlemek için düşük gerektiğini, kinetik analizi için MMTS-papain hareketsizleştirir için aynı prosedürü kullanılır. Flow hücre 1 referans yüzey olarak kullanılmak üzere de bu adımı değiştirilmeden bırakılır. <ol start="4"><li> 7.1 &#39;NHS ve EDC karışımı ile yüzey aktivasyonu sonra, MMTS papain 50 saniye için 1μg/ml enjekte edilir. Bundan sonra yüzey etanolamin adım 7.3 gibi bir enjeksiyon ile de aktive edilir. </li></ol> Kaplin bu işlemden sonra yaklaşık 50 RU olmalıdır. 7. CFCA testi kullanılarak belirlenmesi Sistatin B konsantrasyonu <ol><li> CFCA deney Biacore X100 Plus Paket CFCA sihirbazı göre ayarlanır. Yaklaşık 10 nM protein akış hızları 10 ve 100 ul / dak 48 saniye için yinelenen enjekte edilir. Yüzeyi her çevrim arasındaki 20 mM NaOH ile yeniden oluşturulur. </li><li> Her akış hızı için boş enjeksiyonları içerir. </li><li> Protein konsantrasyonu daha sonra th kullanarak veri bağlama (Şekil 3) tespitBiacore X100 Plus Paket değerlendirme yazılımı e CFCA değerlendirme özelliği. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2, 10 ve 100 ul / dak akış hızlarında elde edilen sensorgrams CFCA yabani tip sistatin B. belirli bağlayıcı konsantrasyon verileri analiz sonuçları elde edildi . <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 mutantlar. Konsantrasyonlar 280 ölçümü (n = 3) ve (n = 2) CFCA kullanılarak belirlendi. Standart hatalar, hata çubuklarla gösterilir. (6) açıklandığı gibi azı emme katsayıları hesaplandı. Iki yöntem tarafından belirlenir Cys3Ser/Leu73Gly mutant konsantrasyon değerleri büyük bir fark görülebilir. </li><li> CFCA tarafından A 280 ölçümü ile belirlenen konsantrasyon kıyaslarken, çoğu durumda protein Cys3Ser/Leu73Gly varyant, tamamen aktif iken, aktif protein fraksiyonu (Şekil 3) çok düşük olduğu, bu açıktır. Aşağıdaki tablo, bir 280 toplam konsantrasyonları ile ilgili sistatin B türevleri faaliyetleri gösterir . <table border="0"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> A 280 (%) ile ilgili olarak CFCA </td></tr><tr><td> Vahşi tip </td><td> 94 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 101 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 99 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 83 </td></tr></tbody></table></li></ol> 8. Ölçüm Papain bağlayıcı Sistatin B Kinetiği <ol><li> CFCA ölçümlere göre, 2.5 sistatin B türevleri her biri için 40 nM arasında değişen bir iki kat konsantrasyon serisi hazırlamak. </li><li> Kinetik deneyi Biacore X100 kinetik sihirbazını kullanarak tek döngüsü yaklaşımı ile kurulur. Enjeksiyonlar arasındaki yüzey rejenere, ancak her analiz döngüsünün sona ermesinden sonra yenilenme çözüm olarak 20 mM NaOH kullanılarak değildir. </li><li> Örnek içeren her döngüsü örnek yerine tampon enjekte edilir, boş bir döngü ile çevrili, böylece deney ayarlayın. </li><li> Biacore X100 kinetik değerlendirme özelliği otomatik olarak referans boş çıkarmalar gerçekleştirmek için kullanın 1:1 etkileşim modeli takmadan önce veri çıkarılır. </li><li> Papain için sistatin B türevleri bağlama için elde edilen deneysel veriler Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Aşağıdaki tabloda, dernek ve disosiasyon oranı sabitler ve kinetik analiz elde edilen denge ayrılma sabitleri özetlemektedir. <table border="0"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> k bir (M -1 s -1) </td><td> k d (s -1) </td><td> K-Ge (M) </td></tr><tr><td> Vahşi tip </td><td> 1.8 x 10 6 </td><td> 0.41 x 10 -3 </td><td> 2.3 x 10 -10 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 1.1 x 10 6 </td><td> 1,7 x 10 -3 </td><td> 1.5 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 1.1 x 10 6 </td><td> 23 x 10 -3 </td><td> 2.2 x 10 -8 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 1.7 x 10 6 </td><td> 12 x 10 -3 </td><td> 7,1 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 0.9 x 10 6 </td><td> 0.53 x 10 -3 </td><td> 5,8 x 10 -10 </td></tr></tbody></table> <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 MMTS-papain bağlayıcı sistatin B varyasyonları için kinetik profilleri tek çevrim kinetiği kullanılarak belirlenmiştir. Sensorgrams boş ve gösteri referans siyah, üst üste 01:01 etkileşim modeli için kinetik oturuş veri çıkarılır. </li><li> Mutantların dernek oranları vahşi tip proteini (Şekil 5, üst panel) ile karşılaştırılabilir olmasına rağmen, mutantlar ayrışma hız sabitleri denge disosiasyon karşılık gelen bir artış, yakın büyüklükte iki sipariş yüksek olabilir sabit (Şekil 5, alt panel). <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 oranı ve yakınlık sabitleri hesaplamalar CFCA elde edilen konsantrasyonları dayalı idi. Mutasyonları ile ilişkili k, k d ve K D değişiklikler grafikler tasvir edilmektedir. </li><li> Örnek konsantrasyonu deneysel veriler sabit dernek oranının hesaplanmasında bir parametre olduğundan,doğru olması önemlidir. Leu73 yerine CFCA A 280 ölçüm dayalı konsantrasyonu kullanarak değiştirme diğer sistatin B türevleri yaklaşık 10 kat daha yavaş dernek gibi görünüyor dernek oranı, önemli olduğu sonucuna yol açacak. Ancak, CFCA tarafından ölçülen belirli bağlayıcı konsantrasyonu sadece yaklaşık% 10 bu durumda total protein. Bu dikkate alındığında Leu73 için dernek oranı diğer varyantları benzer olduğunu açık hale gelir. Bu nedenle, CFCA, böylece etkileşim mekanizmasının uygun yorumlanması mümkün k ve K D doğru bir şekilde değerlendirilmesi için sağlar . </li></ol>

<ol>
	<li>Christensen, L. L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+protein+concentration+determination+using+biosensor+technology+under+conditions+of+partial+mass+transport+limitation.">Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation.</a> Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).</li><li>Sigmundsson, K., M&#226;sson, G., Rice, R., Beauchemin, N., &#214;brink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+active+concentrations+and+association+and+dissociation+rate+constants+of+interacting+biomolecules:+an+analytical+solution+to+the+theory+for+kinetic+and+mass+transport+limitations+in+biosensor+technology+and+its+experimental+verification.">Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification.</a> Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).</li><li>Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+refined+2.4+A+X-ray+crystal+structure+of+recombinant+human+stefin+B+in+complex+with+the+cysteine+proteinase+papain:+a+novel+type+of+proteinase+inhibitor+interaction.">The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction.</a> EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).</li><li>Pol, E., Bj&#246;rk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+second+binding+loop+and+the+C-terminal+end+of+cystatin+B+(Stefin+B)+for+inhibition+of+cysteine+proteinases.">Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases.</a> Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).</li><li>Bj&#246;rk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+the+association+and+dissociation+rate+constants+for+binding+of+cystatins+to+target+proteinases+occurring+on+N-terminal+truncation+of+the+inhibitors+indicate+that+the+interaction+mechanism+varies+with+different+enzymes.">Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.</a> Biochem. J. 299, 219-225 (1994).</li><li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li></ol>

Yazar, bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten GE Healthcare tarafından istihdam edilmektedir.

Bu çalışmada, dört mutantlar ve yabani tip sistatin B ikinci bağlayıcı döngünün önemini değerlendirmek ve C-terminal sistatin B ve papain arasındaki etkileşimi sona amacıyla üretildi. Bu çalışmada, belirli bağlayıcı konsantrasyonu belirlemek ve protein-protein etkileşimleri kinetiği yapı-işlev ilişkileri anlamak için analiz Biacore X100 kullanmanın avantajı ve kolaylığı göstermiştir. Biz total protein konsantrasyonu ölçüm Bu durumda afinitesi ve kinetiği belirlenmesinde önemli bir ölçüm hatası tanıttı bağlanma aktivitesi azalır, protein çeşitleri çıkmamasına gösterdi. Sistatin B türevleri belirli bağlayıcı konsantrasyonu Biacore X100 CFCA kullanarak tespit edildi. Kinetik analizi için girdi olarak CFCA konsantrasyon ölçümlerinin kullanılması, böylece etkileşim mekanizmasının doğru yorumlanması sağlayan, güvenilir oranı ve yakınlık sabitleri sonuçlandı. K sadece biraz etkilenir iken mutant azalma akrabalıklar, neredeyse sadece bir artış k d-değeri nedeniyle. Bu davranış, ikinci bağlayıcı döngü bölge ve C-terminal uç inhibitörü papain için bağlayıcı oranı için önemli olmadığını gösterir. Bunun yerine, öncelikle karmaşık oluşmuş bir kez inhibitörü enzim bağlı tutarak afinitesi katkıda bulunur.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1100-73</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 Plus Package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1007-98</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Sensor Chip CM5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-14</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Amine Coupling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetate buffer pH 4.5, 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1003-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1008-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Vials &Oslash; 11 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1002-87</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber caps, type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1004-11</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis 

Bu çalışmada, biz Biacore X100 kullanarak gerçek zamanlı etiket analizi, sığır sistein proteaz inhibitörü sistatin B ve bir bitki sistein proteaz papain (Şekil 1), katalitik olarak inaktif bir formu arasındaki etkileşim keşfetmek. Papain ile etkileşim alanları ile birkaç nokta mutasyonlarının sistatin B türevleri üretilmektedir. Her sistatin B varyantında için kalibrasyon konsantrasyon analizi kullanarak kendine özgü bağlayıcı konsantrasyonu (CFCA) belirlemek ve A tarafından belirlenen total protein konsantrasyonu ile elde edilen değerleri karşılaştırmak<sub&gt; 280</sub&gt;. Bundan sonra, papain için bağlayıcı her sistatin B varyantında kinetiği tek döngüsü kinetiği (SCK) kullanılarak ölçülür. Biz incelemek dört sistatin B türevleri bir bağlama için sadece kısmen etkin olduğunu göstermektedir. CFCA ortaya koyduğu bu kısmi faaliyet, örgütlenme oranı sürekli bir önemli farkı çevirir (<em&gt; K</em<sub&gt; Bir</sub&gt;) Ve sıhri (<em&gt; K</em<sub&gt; D</sub&gt;), Total protein konsantrasyonu kullanılarak hesaplanan değerler karşılaştırıldı. Bir yapı-fonksiyon çalışmada kinetik analizi ile birlikte CFCA kullanarak, güvenilir sonuçlar elde etmek için katkıda bulunur ve etkileşim mekanizmasının doğru yorumu yapmak için yardımcı olur.

Watch this Scientific Journal Video about The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis at JoVE.com

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Biz geçerlidir etiket kinetik karakterizasyonu ile papain birkaç sistatin B mutantlar bağlayıcı yapı-işlev analizi için ücretsiz Biacore X100 kullanarak protein etkileşim analizi. Kalibrasyon konsantrasyon analizi (CFCA) standart eğri gerek kalmadan muhafaza bağlayıcı aktivite ile protein konsantrasyonu ölçer. Biz CFCA kinetik analiz güvenilirliğini artırır ve bu kinetik sabitler güvenilir bir rekombinant proteinin aktivitesi azalır bile tespit edilebilir kullanarak bu onay konsantrasyonlarının göstermektedir.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

the-importance-correct-protein-concentration-for-kinetics-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

20.4K Görüntüleme.  GE Healthcare Bio-Sciences AB. Biz geçerlidir etiket kinetik karakterizasyonu ile papain birkaç sistatin B mutantlar bağlayıcı yapı-işlev analizi için ücretsiz Biacore X100 kullanarak protein etkileşim analizi. Kalibrasyon konsantrasyon analizi (CFCA) standart eğri gerek kalmadan muhafaza bağlayıcı aktivite ile protein konsantrasyonu ölçer. Biz CFCA kinetik analiz güvenilirliğini artırır ve bu kinetik sabitler güvenilir bir rekombinant proteinin aktivitesi azalır bile tespit edile...

Video: The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Biyoloji

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

Doğru DOKU Çok doku blokları her zaman nokta

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...