Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR), Peter Lougheed Tıbbi Araştırma Vakfı, Neuroengineering McGill Programının hibeleri ile desteklenen, Viyana de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ve Yenilik Kanada Vakfı (CFI .) Viyana Master Eğitim Ödülü Sébastien D. Langlois tarafından desteklenen de la Recherche en santé du Québec (FRSQ) ve Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüleri Frederick Banting ve Charles tarafından En İyi Kanada Lisansüstü Bursları Master Ödülü. Biz rakamları ile yardım için Jessica MT Pham müteşekkiriz.

1. Embriyonik sıçan dorsal spinal kord diseksiyonu Genel öneriler L-15 orta boy buz üzerinde tutun ve sık sık diseksiyonu çanak orta embriyoların serin tutmak için. Bu doku bütünlüğünü korumaya yardımcı olur. Belirtilmediği sürece tüm adımları Dumont # 5 forseps iki çift ile yapılır. Kontaminasyonu engellemek için,% 70 etanol ile tüm araçlar ve çalışma yüzeylerinde sprey ve diseksiyon orta şişe kapalı tutmak. Yemekler arasında embriyolar transfer etmek için, bir kesim plastik pipet veya delikli bir kaşık kullanın. Diseksiyonu başarıyla tamamlamak için omurilik (germe, nick) zarar görmemesi için kritik öneme sahiptir. Hazırlık <ul><li> Soğuk L-15 orta </li><li> L-15 50 ml +% 10 ısı ile inaktive edilmiş at serumu (HiHS). Buz üzerinde tutun. </li></ul> Omurilik diseksiyonu <ol><li> Euthanize E13 gebelik aşamalı sıçan (E0 = çiftleşme gün sonra ilk gün) kurumsal kurallarına göre CO 2 odalı. </li><li> Karın% 70 etanol Sprey. Cerrahi makas ile forseps ve kesme alt karın bölgesi, cilt sıkın ve yukarı çekin. Karın boşluğuna ulaşmak için kas ve peritoneal katmanları üzerinden kesmek için tekrarlayın. Toraks, karın kenarlarında doku kesme bir V şeklinde kesi oluşturun. Asansör ve karın boşluğuna maruz doku geri çekin. </li><li> Rahim üç yerde bağlı olduğu alt merkezi karın ve her iki üst lateral köşelerinde. Embriyonik keseler arasındaki doku üzerinde kapma rahim kaldırın. Bağ dokusu, rahim ve buz üzerinde L-15 ile dolu bir Petri kabındaki kaldırmak için kesin. </li><li> Sonraki adımları bir diseksiyon mikroskop altında yapılır. Extraembryonic doku ve embriyonik membranlar bir embriyo ayırmak için, bir çift forseps ile rahim keseler arasındaki doku kapmak. Diğer çifti ile, yüzeysel membranlar (karanlık tarafı plasenta) yoluyla kesmek için kesenin daha şeffaf yan tutam. Embriyo kesesinin plasenta tarafında hafifçe basarak sıkın. Buz üzerinde L-15 ile doldurulmuş bir Petri kabındaki bütün embriyolar ve yer çıkarın. </li><li> Buz gibi L-15 ile doldurulmuş 10 cm Petri kabı yerleştirin, tek bir embriyo. Microscissors kullanarak, şekil 1a gösterilen açıda baş ve arka parçalar kesip. Bu açıda kesme pozisyonu embriyo &quot;aşağı ventral yüzü&quot; yerleştirilmesini yardımcı olacaktır. </li><li> Pozisyon embriyo &quot;ventral yüzü aşağı&quot; (anterior yere dönük, deneyci doğru işaret posterior) (Şekil 1b). </li><li> (Şekil 1c) embriyo &quot;aşağı pin&quot; forsepsi kullanarak, bir taraftan embriyo sıkıca tutun. Doku gözyaşı gibi, forseps hareket ettirmeyin. Forseps diğer çifti, deri soyulabilir &quot;tutma&quot; forseps (Şekil 1d-e) arasındaki bölgede başlayan embriyonun arkasına kapsayan. Bu, bu noktada, membranlar (meninksler) tarafından sarılmış, omurilik gösterecektir. Taraftan deri omurilik üzerinde değil, omurilik nicklemek önlemek için tut. </li><li> Kısmen omurilik (Şekil 1f) sağ tarafında doku ayırın. Holding forseps düzeyinde başlayarak, omurilik mümkün olduğu kadar yakın, kapalı forseps ile doku karıştırmak. Sonra yavaş yavaş, doku gözyaşı forseps açık. Bu, omurilik dorsal kök gangliyon (DRG) ayırmak gerekir ve ventral organları engel olmamalıdır. Böylece sonraki adım sırasında yukarı doğru çekilerek önlenmesi, bağlı bırakmak doku, embriyo ağırlık katan ön ve arka ucunda bağlı bazı doku bırakın. Buna ek olarak, bu doku, sonraki adımlarda embriyo üzerinde tutmak için kullanılır . </li><li> Ön ucundan başlayarak, meninksler kesme ve roofplate (Şekil 1g) boyunca omurilik açmak için kanca şeklinde tungsten iğne kullanın. </li><li> Embriyo 180 derece (posterior anterior deneyci dönük uzakta, işaret) (Şekil 1s) döndürün. Bu deneyci embriyonun diğer taraftan doku ayırmak için aynı eli kullanmanıza olanak sağlar. </li><li> Daha önce müstakil yüzüne kapma embriyo tutun ve (bakınız 1.8.) Aynı yöntemi kullanarak diğer taraftan doku bozabilir. Bittiğinde, omuriliğin her iki tarafta doku tamamen ayırın. Alternatif: Tamamen sol tarafında kalan doku ayırmak, ancak sağ taraftaki ön ve arka sonunda eklenen bazı doku bırakın. Bu bazen adım 1.12 pozisyonda spinal kord korumaya yardımcı olabilir. </li><li> Yan omurilik yerleştirin ve kalan mezenkimal doku ve DRG&#39;ler çoğu (Şekil 1i) kaldırmak. </li><li> Bu aşamada, beyincik ve omurilik birbiri üzerine apposed doku iki &quot;levha&quot;. Spinal kor menenjlerin kısa bir bölümü kapalı, büyük, en ön-omurilik kısmı ve kabuğu aşağı pind (Şekil 1j, sol). Şimdi, forseps ile arasında kapma ayrılmış iki segmentleri tutun ve bir düz, sabit bir hareketi (Şekil 1j) ile meninksler soyulabilir. Eşitsiz omurilik ve / veya meninksler katmanı kırılmaya yol açacaktır &quot;soyma&quot;. Hala meninksler bağlı omurilik kısmını kurtarmak için genellikle mümkün değildir. </li><li> Plastik bir pipet kullanarak, L-15 +% 10 HiHS içeren Petri izole spinal kord transferi ve buz üzerinde bırakın. Tipik olarak, tüm embriyoların omurilik dorsal kısımlarını diseksiyon önce toplanır. </li></ol> Dorsal omurilik diseksiyonu <ol start="15"><li> L-15 +10% HiHS içeren bir &quot;açık-kitap&quot; yapılandırma düz yalan bir Petri kabındaki bir omurilik. Kesip daha geniş, ön kısmı (Beyin parçası içerir) (Şekil 1k). </li><li> Dorsal dokusunun omurilik (incir 1l, sol) en lateral kısımlarında yer almaktadır. , Genişliği yarım omurilik 1/5th bir şerit, düz bir tungsten iğne ile kablosu bağlantılarını kesmek için L-şekilli tungsten iğne kullanın. (Şekil 1l, sağ). 15 ml plastik tüp buz üzerinde L-15 +% 10 HiHS içeren bir sırt şeritleri yerleştirin. ~ 12 E13 embriyoların dorsal nöral tüp bölümlerini disosiasyon sonra kaplama için ~ 3.5-4 milyon hücre verecektir. Dorsal spinal kord (geniş dorsal şeritler kesme) bir kaba diseksiyonu yaparak daha fazla hücre elde edilebilir, ancak commissural nöron saflık azalacaktır. </li></ol> 2. Commissural nöron kültürü Genel öneriler Tüm adımları, aksi belirtilmedikçe, doku kültürü kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır . Taze orta ve taze çözülmüş takviyeleri ve reaktifler kullanın. Bölünmeler ve ezerek toz haline getirme adımları Ca 2 + / Mg 2 + Ca 2 en aza indirmek için ücretsiz HBSS + / Mg 2 + bağımlı adezyon yapılmaktadır. Hazırlık <ul><li> kaplamalı lamelleri (Alman Desag cam kullanmak) veya doku kültürü levhalar (aşağıda kaplama yordama bakın). </li><li> sıcak Neurobasal Kaplama Medya (aşağıya bakın), doku kültürü yemekleri ve kaplama önce en az 1.5 saat süreyle doku kültürü inkübatörde 2 dengelenmiş CO. </li><li> 37 ° C su banyosunda% 2.5 tripsin </li><li> 2 şişe HBSS Ca 2 + Mg / 2 + ücretsiz, 4 ° C, az bir 37 ° C. </li><li> iki yangın parlatılmış cam Pasteur çapı yarım olağan boyutta ve yarısından biraz daha küçük bir çapa ile bir pipetler. Sterilize Pasteur pipetler kullanın. Pipetler ateş-lehçe için, çapı biraz azaltmak için ucu eritmek için (açık mavi alev üst) Bunsen beki kullanın. Bu adımı doku kültürü kaputu dışında olduğundan, doku kültürü kaputun altında yerleştirmeden önce% 70 etanol ile pipetler spreyi. Nöronlar, mont, başlamadan önce sadece öğütme adım önce ayrışma veya (pipetler medya ile doldurun ve 30 saniye boyunca tutun) içeren serum medya ile Pasteur pipetler daha verimli geri almak için Bu hücreleri öğütme sırasında Pasteur pipeti içine yapışmasını önleyecektir. </li><li> PLL kaplı yemekleri veya lamelleri yıkamak için steril milliQ su </li><li> HBSS% 12.5 MgSO 4 çözüm </li></ul> Poli-L-lisin kaplama Cam lamelleri, 24 saat boyunca asit yıkama ve kaplama (bkz. Kaech ve Banker, 2006) önce sterilize kullanıyorsanız. Alman Desag cam lamelleri kullanın. Kat, cam lamelleri ya da plastik doku kültürü yemekleri poli-L-lizin: <ul><li> bir doku kültürü kaputu altında, 1,75-2 saat için 100 ug / ml PLL çözüm küçük bir kubbe ile yüzeyleri kapsar. </li><li> milliQ su, yıkama başına en az 5 dakika (aşağıda hücre disosiasyon adım sırasında yapılabilir) ile iki kez yıkayın. </li><li> kullanımı kadar su saklayın. PLL kaplı yüzeyi kuru izin vermeyin. Lamelleri kaplama için PLL israfını azaltmak için, bakteri steril Petri yemekler lamelleri yerleştirin. Coat ve lamelleri üzerinde sıvı bir kubbe yerleştirerek lamelleri yıkayın. Bakteriyel Petri yemekler hidrofobik, bu nedenle sıvı cam lamelleri kalmalıdır. Hücrelerin sadece kaplama önce doku kültürü yemekleri lamelleri aktarın. Plastik doku kültürü yemekleri kaplama nöronlar için, yapışma, normalde daha yüksek, dolayısıyla neurite uzama azalmış olabilir. </li></ul> Bölünmeler ve kaplama <ol><li> Dorsal şeritler tüpün dibine yerleşmiş olduğunu kontrol edin. Pasteur pipeti ile L-15 +10% HiHS en çıkarın. Hızlı soğuk (4 ° C) HBSS 3 ml ekleyerek, bir kez dorsal nöral tüp şeritler yıkayın. </li><li> Dorsal nöral tüp şeritleri 2 dakika dinlendiriniz, daha sonra Pasteur pipeti ile HBSS çıkarın. </li><li> 4.7 ml bir birime sıcak (37 ° C) HBSS ekleyin. Then% 0.15 tripsin son bir konsantrasyon elde etmek için 0.3 ml% 2.5 tripsin ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 7 dakika süreyle su banyosunda inkübe edin. Kuluçka yoluyla kez yarı yolda hafifçe karıştırın. </li><li> 150 U / mL son konsantrasyon için 30 ul DNAz (25 000 U / ml) ekleyin. 60 ul MgSO 4 ekleyin ve son bir konsantrasyon için% 0,15, kısaca karıştırın. Için 37 ekstra 1 dakika boyunca inkübe kaba diseksiyonları doku ° C su banyosunda. Bu aşamada, dorsal nöral tüp bölümleri parçalanmış olmalıdır. Dorsal nöral tüp bölümler parçalanmaya başlamış yoksa, genellikle% 2.5 tripsin stok eski olduğu anlamına gelir ve yeni hisse senedi çözülmüş olmalıdır, ya da soğuk HBSS yıkama etkili örnek HiHS kaldırmak vermedi . </li><li> 4 dakika için 200 g doku parçaları santrifüjleyin. </li><li> Tüpün alt kısmında yaklaşık 50-100 ul sıvı bırakarak, Pasteur pipeti ile süpernatantı. </li><li> Pelet gevşetmek için tüp hafifçe Flick, sonra 5 ml sıcak HBSS ekleyerek hücrelerin yıkayın. Oda sıcaklığında 2 dakika dinlendiriniz. </li><li> 5 dakika için 200 gr santrifüjleyin. </li><li> Tüpün alt kısmında yaklaşık 50-100 ul sıvı bırakarak, Pasteur pipeti ile süpernatantı. </li><li> Tüp yavaşça pelet gevşetin ve kısmen hücreleri tekrar süspansiyon Flick. Daha sonra 2 ml sıcak HBSS ekleyin. </li><li> Küçük (yarı çap) yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti hücreleri yavaş yavaş 4-6 kez ve aşağı yukarı pipetleme ayırmak. Kabarcıkları yapmaktan kaçının ve tüpün kenarına sıvı pipetle. Aşırı çiğnemek etmeyin. </li><li> Yavaş yavaş 3-4 kez ve aşağı yukarı pipetleme hücreleri ayırmak küçük yangın parlatılmış cam Pasteur pipet kullanın. Kabarcıkları yapmaktan kaçının ve tüpün kenarına sıvı pipetle. Aşırı çiğnemek etmeyin. Kaba diseksiyonları doku için, ayrışma sonunda tüpe 1 ml sıcak HBSS ekstra bir ekleyin. Hücrelerin dissociating, tüm hücre kümeleri ve agrega ayırmak gerekli değildir. Yukarı ve aşağı pipetleme durdurun ya da daha fazla pipetleme hücre agrega boyutu daha fazla azalma görürseniz küçük çaplı bir Pasteur pipeti . </li><li> Kalan herhangi bir doku parçaları tüp içinde 1 dakika dinlendiriniz. Bu hücreler yeni bir tüpe transfer için gerekli değildir. </li><li> 20 ul hücre süspansiyonu ve tripan mavi 5 ul ekleyin. Bir haemocytometer hücreleri saymak. Nöronlar tripan mavisi dışlama ≥% 95 uygulanabilir olmalıdır. </li><li> Neurobasal Kaplama Medya nöronların (aşağıya bakınız Tarifler) Levha. <ul><li> Izole nöronların (düşük yoğunluklu kültürler birbiriyle örtüşen veya topaklanma nöronlar önlemek için) elde etmek için önerilen kaplama yoğunlukları: </li><li> 120 000 - 180 000 hücre / 6 plaka </li><li> 60 000 - 75 000 hücre / 12 plaka </li></ul></li><li> 16-18 saat sonra, (aşağıda Tarifler) Neurobasal Büyüme Medya ortamı değiştirmek Medya değişen kültür çanak medya aspire bir vakum pompası kullanmayın; hafifçe bir pipet kullanın. Bu nöronlar yerinden oynatmamaya önler. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Dört saat sonra kaplama, nöronlar poli-L-lisin (PLL) kaplı yüzey uyulması gerekirdi. Faz kontrast aydınlatma altında, yapıştırılır hücre gövdeleri genellikle nispeten düz ve oval şekilli (Şekil 2a). Iyi yapışmış hücreler çanak tarafında çok hafifçe vurdu zaman hafifçe hareket küre gibi görünür. Birçok faktör potansiyel olarak (tartışma) hücre yapışmasını engelleyebilir. In vitro olarak 30 saat sonra, en fazla nöron, gözle görülür bir büyüme konisi (Şekil 2c, d) bir akson genişletmiştir . Kötü aksonal büyüme görülürse Neurobasal Büyüme Medya taze orta ve besin takviyeleri ile yapılmış olduğunu doğrulayın. Nöronlar, bu koşullarda en az 6 gün süreyle sağlıklı kalır. Bu prosedür nöronlar ~% 90 DCC (Yam ve ark 2009) ifade ile, güvenilir, yüksek commissural nöronlarda zenginleştirilmiş hazırlıkları verim kanıtlamıştır. Hücre süspansiyonu hazırlamak için kullanılan dorsal spinal kord şerit genişliği, ince şeritler kullanılmaktadır daha fazla saflıkta, kültürünün saflığını etkileyecektir. Örnek bir uygulama Şekil 3 (immünofloresan) gösterilir. Yam ark makalesine bakın. Daha fazla örnek için (2009). <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig1tmb.jpg" border="0" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 omurilik diseksiyonu adımları Şemalar. D = Dorsal, V = Ventral <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1773/1773fig1.jpg">daha büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.</a> <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 izole commissural Temsilcisi sonucunöronlar bir PLL kaplı cam lamel kaplamalı. a, b) 4 saat sonra kaplama, nöronlar yüzeye yapıştırılır. Bar = 20 mikron. c, d) 30 saat sonra kaplama, nöronlar, gözle görülür bir büyüme koni ile bir akson uzatıldı. Bar = 20 mikron. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 commissural nöron Phalloidin (F-aktin, kırmızı) ve DAPI (mavi) çekirdeği etiketli F-aktin, gama-tubulin (yeşil) immunohistokimyasal. Tarifler ve yorumlar Neurobasal Kaplama Media <ul><li> Neurobasal </li><li> % 10 Isı inaktive FBS (HiFBS) </li><li> 2 mM L-glutamin (200 mM stok solüsyonu) İsteğe bağlı: Penisilin / Streptomisin antibiyotik (yarısı normal konsantrasyon kullanmak) </li></ul> Neurobasal Büyüme Ortamı <ul><li> Neurobasal </li><li> B27 (1 / 50 dilüsyon stok) </li><li> 2 mM L-glutamin (200 mM stok solüsyonu) </li><li> İsteğe bağlı: Penisilin / Streptomisin antibiyotik (yarısı normal konsantrasyon kullanmak) Medya yapıldıktan sonra, iki hafta süreyle 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Hücre, doku kültürü Petri kutularına medya ve doku kültürü inkübatör yer kaplama en az 1,5 saat önce, sıcaklık ve medya pH dengelenmesi için . </li></ul> Neurobasal Neurobasal orta bir şişe açıldıktan sonra, bir ay boyunca, 4 tutulmalıdır ° C karanlıkta. , Aksi halde hücre sağkalım daha düşük olacaktır bir aydan fazla açılmıştır Neurobasal atın. Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HiFBS) veya at serumu (HiHS) 56 ısı inaktive FBS veya HS, ısı ° C su banyosunda 30 dakika. Swirl şişe yaklaşık olarak her 10 dakika kadar. Isı-inaktive FBS çökeltileri temizlemek için santrifüj gerekebilir (doğruluk yerleştirin. Bu noktada zamanlama başlayın. Şişe su, 56 ° C ulaşıldığında görmek için bir termometre, su ile dolu benzer büyüklükteki bir şişe kullanın) ve -20 ° C&#39;de aliquoted ve tekrar dondurulmuş olabilir L-Glutamine Her zaman her bir deney için L-glutamin taze bir kısım Çözülme. B27 B27 Alikot 20 ° C Uzun süreli depolama ya da 4 ° C ile bir ay kadar saklanabilir.

<ol>
	<li>Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. , 113-1111 (2003).</li><li>Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+ipsilateral+retinal+ganglion+cell+axons+at+the+optic+chiasm+requires+the+Shh+Receptor+Boc.">Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc.</a> Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).</li><li>Helms, A. W., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitors+of+dorsal+commissural+interneurons+are+defined+by+MATH1+expression.">Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression.</a> Development. 125, 919-928 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boc+is+a+receptor+for+sonic+hedgehog+in+the+guidance+of+commissural+axons.">Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons.</a> Nature. 444, 369-373 (2006).</li><li>Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+axons+through+a+noncanonical,+Src-family-kinase-dependent+signaling+pathway.">Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway.</a> Neuron. 62, 349-362 (2009).</li></ol>

Biz embriyonik sıçan omurilik commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem tanımlanmıştır. Bu prosedür, laboratuvarda rutin olarak güvenilir bir akson rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları çalışma nöronların hazırlamak için kullanılır olmuştur. Hücre biyolojisi ve immünokimyanın deneyler, bir çöp diseksiyonu için yeterli nöron üretir. Daha fazla hücreler ihtiyaç olduğunda, birçok biyokimya deneyler, iki litre diseksiyonu gibi gerekli olabilir. Eğitimli bir kişi i...

Embriyonik sıçan dorsal spinal kord diseksiyonu (Tablo ayrıca görüyorum) <ul><li> E13 sıçan gebelik aşamalı </li><li> Etanol 70% </li><li> Cerrahi makas, Güzel Bilim Araçları </li><li> Forseps, Dumont # 5 Güzel Bilim Araçları </li><li> Petri kutularına </li><li> L-15 orta </li><li> Diseksiyon mikroskobu, Leica </li><li> Plastik transferi pipetler </li><li> Microscissors, Güzel Bilim Araçları </li><li> Tungsten iğne ve pim sahipleri (kanca şeklinde bir iğne, bir L-şekilleri iğne, bir düz iğne), İnce Bilim Araçları </li><li> Isı ile inaktive At Serum (HiHS) </li><li> 15 ml plastik tüpler </li></ul> Commissural nöron kültürü (Tablo ayrıca bkz.) <ul><li> Doku kültürü inkübatörler (37 ° C,% 5 CO 2, nem kontrollü) </li><li> Alman Desag lamelleri cam ve / veya plastik doku kültürü yemekleri </li><li> Poli-L-lizin, Sigma </li><li> Steril milliQ H 2 O </li><li> Neurobasal, Invitrogen </li><li> Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HiFBS) </li><li> L-Glutamine </li><li> B27, Invitrogen </li><li> Penisilin / Streptomisin antibiyotik </li><li> 37 ° C su banyosunda </li><li> Steril Pasteur Pipetler </li><li> Bunsen gaz yazıcı </li><li> HBSS, Ca 2 + Mg / 2 + ücretsiz, Invitrogen </li><li> DNAz, Worthington </li><li> MgSO 4 </li><li> Santrifüj </li><li> Hemasitometre </li><li> Tripan Mavi Çözümü </li></ul>

dissection and culture of commissural neurons from embryonic spinal cord

Commissural nöronların yaygın, embriyonik omurilik gelişim sırasında akson rehberliği altında yatan mekanizmaları araştırmak için kullanılmaktadır. Bu nöronların hücre gövdeleri dorsal omurilik bulunur ve aksonlar embriyonik gelişim sırasında kalıplaşmış yörüngeleri takip. Commissural aksonlar ilk Taban doğru ventral proje. Orta hatta geçtikten sonra, bu aksonlar, beyin tarafına doğru anteriora ve proje çevirin. Bu adımların her biri birkaç rehberlik ipuçlarının eylem tarafından düzenlenir. Commissural nöronlar yüksek oranda zenginleştirilmiş Kültürler ideal dönüm deneyleri, immünokimyanın ve biyokimya da dahil olmak üzere, akson yol bulma mekanizmaları, birçok deneyler için uygundur. Burada, E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem açıklanmaktadır. İlk olarak, omurilik, izole edilir ve dorsal şeritler disseke vardır. Dorsal doku trypsinization ve mekanik bozulması hücre süspansiyonu sonra ayrışmış. Nöronlar, poli-L-lizin kaplı cam lamelleri veya doku kültürü yemekleri üzerine kaplanmıştır. 30 saat sonra<em&gt; In vitro</em&gt; En nöronların akson uzatıldı. Kültür saflık (Yam<em&gt; Ve ark.</em&gt; 2009), tipik olarak% 90 üzerinde, commissural nöron belirteçlerinin DCC, LH2 ve tag1 (Helms ve Johnson, 1998) ile immunolabeling tarafından değerlendirilir olabilir. Bu nöronal hazırlanması için yararlı bir araçtır.<em&gt; In vitro</em&gt; Hücresel ve moleküler mekanizmaları omurilik gelişimi sırasında commissural akson büyüme ve rehberlik çalışmalar.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Bu video E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem gösteriyor. Disosiye commissural nöronların akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için yararlıdır.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

dissection-culture-commissural-neurons-from-embryonic-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K Görüntüleme.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal. Bu video E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem gösteriyor. Disosiye commissural nöronların akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için yararlıdır.

Video: Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Nörobilim

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...