Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR), il Peter Lougheed Medical Research Foundation, il programma di McGill in Neuroingegneria, Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ), e la Fondazione canadese per l&#39;innovazione (CFI ). D. Sébastien Langlois è stato sostenuto dal Premio La formazione di un Master presso il Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e da un Frederick Banting e Charles Premio per la Migliore Canada Laurea Borse di Studio del Maestro dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Siamo grati a Jessica MT Pham per l&#39;assistenza con figure.

1. Dissezione del cavo embrionale dorsale spinale di ratto Raccomandazioni generali Tenere L-15 di media su ghiaccio e cambiare spesso il medium nel piatto dissezione per mantenere gli embrioni freschi. Questo aiuta a preservare l&#39;integrità dei tessuti. Tutti i passaggi vengono eseguiti con due paia di pinzette Dumont # 5, a meno indicato. Per evitare la contaminazione, spruzzare tutti gli strumenti e le superfici di lavoro con il 70% di etanolo e mantenere medie bottiglia dissezione chiuso. Per trasferire embrioni tra piatti, usare una pipetta di plastica tagliata o un mestolo forato. E &#39;fondamentale non danneggiare il midollo spinale (intaccare, stretching) per completare con successo la dissezione. Preparazione <ul><li> Freddo L-15 di media </li><li> 50 mL di L-15 + inattivato al calore del 10% siero di cavallo (HiHS). Tenere su ghiaccio. </li></ul> Dissezione del midollo spinale <ol><li> Euthanize uno E13 gravidanza scena ratto (E0 = primo giorno giorno dopo l&#39;accoppiamento) con una camera di CO 2 secondo le linee guida istituzionali. </li><li> Spray etanolo al 70% sul ventre. Pizzicare e tirare la pelle della regione addominale inferiore con una pinza e taglio con le forbici chirurgiche. Ripetere l&#39;operazione per tagliare il muscolo e strati peritoneale per raggiungere la cavità addominale. Creare una forma a V incisione dal taglio del tessuto lungo i lati del ventre, fino al torace. Sollevare e tirare indietro il tessuto per esporre la cavità addominale. </li><li> L&#39;utero è fissato in tre sedi: al centro dell&#39;addome inferiore, e ad entrambi gli angoli laterali superiori. Sollevare l&#39;utero afferrando il tessuto tra sacche embrionali. Tagliare il tessuto connettivo per rimuovere l&#39;utero e posto in una capsula di Petri riempite con L-15 su ghiaccio. </li><li> I passi successivi sono fatta sotto un microscopio dissezione. Per separare un embrione da extraembrionali tessuti e delle membrane embrionali, afferrare il tessuto tra sacche uterina con un paio di pinze,. Con l&#39;altra coppia, pizzicare la parte più trasparente del sacco per tagliare attraverso le membrane superficiali (il lato oscuro è la placenta). Strizzare l&#39;embrione premendo delicatamente la placenta lato del sacco. Rimuovere tutti gli embrioni e posto in una capsula di Petri riempite con L-15 su ghiaccio. </li><li> Mettete un embrione in un piatto da 10 cm Petri riempite con ghiaccio-freddo L-15. Utilizzando microscissors, tagliare via la testa e le parti posteriori ad angolo mostrato in figura 1a. Taglio a questi angoli aiuterà posizione l&#39;embrione, quando sono immessi &quot;faccia ventrale giù&quot;. </li><li> Posizionare l&#39;embrione &quot;faccia ventrale giù&quot; (anteriore rivolta in direzione opposta, posteriore rivolta verso lo sperimentatore) (fig. 1b). </li><li> Tengono saldamente l&#39;embrione da un lato, utilizzando le pinze a &quot;fissare&quot; l&#39;embrione (fig. 1c). Non spostare le pinze, in quanto strappare il tessuto. Con l&#39;altra coppia di pinze, togliere la pelle che copre la parte posteriore dell&#39;embrione a partire dalla regione tra la &quot;holding&quot; pinze (fig. 1d-e). Questo esporre il midollo spinale che, a questo punto, è avvolto da membrane (le meningi). Prendete la pelle dai lati anziché da sopra il midollo spinale per evitare di intaccare il midollo spinale. </li><li> Parzialmente staccare il tessuto sul lato destro del midollo spinale (fig. 1f). Partendo a livello della pinza detenzione, colpire il tessuto con una pinza chiusa, il più vicino possibile al midollo spinale. Poi, aprire lentamente le pinze per strappare il tessuto. Questo dovrebbe staccare i gangli della radice dorsale (DRG) dal midollo spinale, e dovrebbe anche disturbare gli organi ventrale. Lasciare un po &#39;di tessuto attaccati alle estremità anteriore e posteriore. Tessuti Lasciando collegato aggiunge peso per l&#39;embrione, impedendo così di essere tirato verso l&#39;alto durante il passo successivo. Inoltre, che il tessuto utilizzato per contenere al embrione nelle fasi successive. </li><li> A partire dalla fine anteriore, utilizzare il gancio a forma di ago di tungsteno per tagliare le meningi e aprire il midollo spinale lungo la roofplate (fig. 1g). </li><li> Ruotare l&#39;embrione di 180 gradi (posteriore in direzione opposta, puntando verso l&#39;anteriore sperimentatore) (fig. 1 ora). Questo permette lo sperimentatore di utilizzare la stessa mano per staccare il tessuto dal lato dell&#39;embrione. </li><li> Tenere l&#39;embrione afferrando sul lato precedentemente distaccato, e distruggere il tessuto dalla parte rimanente con lo stesso metodo (vedi 1.8.). Al termine, staccare completamente il tessuto su entrambi i lati del midollo spinale. Alternativa: staccare completamente il tessuto rimanente sul lato sinistro, ma lasciare un po &#39;di tessuto allegato alla fine anteriore e posteriore sul lato destro. Questo a volte può aiutare a mantenere la colonna vertebrale in posizione al punto 1.12. </li><li> Posizionare il midollo spinale su un lato e rimuovere la maggior parte del rimanente tessuto mesenchimale e DRG (fig. 1 decies). </li><li> A questo punto, le meningi e il midollo spinale sono due &quot;fogli&quot; di tessuto apposto su ogni altro. Definire con precisione il più grande, più a porzione anteriore del midollo spinale, e staccare un breve segmento di meningi dal cor spinaled (fig. 1j, a sinistra). Ora, tenere i due segmenti separati da afferrare tutto con una pinza, e staccare le meningi con un movimento regolare e costante (fig. 1j). Irregolare &quot;peeling&quot; porterà alla rottura del midollo spinale e / o il livello di meningi. Di solito non è possibile recuperare la parte del midollo spinale ancora attaccato al meningi. </li><li> Utilizzando una pipetta di plastica, trasferire il midollo spinale isolato di una piastra di Petri contenente L-15 HiHS + 10% e lasciare sul ghiaccio. Tipicamente, il midollo spinale di tutti gli embrioni vengono raccolti prima sezionare le porzioni dorsale. </li></ol> Dissezione dorsale del midollo spinale <ol start="15"><li> Mettete un midollo spinale in una capsula di Petri contenente L-15 HiHS +10%, disteso in una configurazione &quot;libro aperto&quot;. Tagliare via più ampio, porzione anteriore (che comprende parte del romboencefalo) (1k fig.). </li><li> Il tessuto dorsale si trova nella maggior parte laterale del midollo spinale (fig 1l, a sinistra). Mentre appuntare il cordone ombelicale con un ago di tungsteno dritta, utilizzare la forma di L ago di tungsteno per tagliare una striscia che è 1/5th la larghezza della metà del midollo spinale. (Fig. 1 litro, a destra). Mettere le strisce dorsale in un tubo di plastica da 15 ml contenente L-15 + HiHS 10% su ghiaccio. Dorsale sezioni del tubo neurale del ~ 12 E13 embrioni produrrà ~ 3,5-4000000 cellule per la placcatura, dopo dissociazione. Più celle possono essere ottenute eseguendo una dissezione grossolana del midollo spinale dorsale (il taglio più larghe dorsale), ma la purezza neurone commissurali sarà ridotto. </li></ol> 2. Commissurali neurone cultura Raccomandazioni generali Tutti i passaggi devono essere eseguite in condizioni di sterilità in una cappa di coltura tissutale salvo diversa indicazione. Usare un mezzo fresco e supplementi appena scongelati e reagenti. La dissociazione e passi triturazione vengono eseguiti a Ca 2 + / Mg 2 + senza HBSS per minimizzare Ca 2 + / Mg 2 +-dipendente adesione. Preparazione <ul><li> coprioggetto patinata (l&#39;uso di vetro tedesco Desag) o piastre di coltura tissutale (vedere la procedura di rivestimento sotto). </li><li> terreni in piastra calda Neurobasal (vedi sotto), in piatti coltura tissutale e CO 2 equilibrato nel tessuto culturale incubatore per almeno 1,5 ore prima della placcatura. </li><li> 2,5% tripsina nel 37 ° C a bagno-maria </li><li> 2 bottiglie di HBSS Ca 2 + / Mg 2 +-free, una a 4 ° C, uno a 37 ° C. </li><li> due incendi lucidato vetro pipette Pasteur uno con un diametro grande la metà di consueto, e uno con un diametro leggermente inferiore alla metà. Usa sterilizzati pipette Pasteur. A fuoco lucidare le pipette, utilizzare un becco Bunsen (la parte superiore della fiamma luce blu) per fondere la punta a diminuire leggermente il diametro. Perché questo passo è eseguito al di fuori della cappa coltura tissutale, spruzzare le pipette con etanolo al 70% prima di mettere sotto il cofano coltura di tessuti. Per un recupero più efficiente dei neuroni, cappotto le pipette Pasteur con supporti contenenti siero prima dell&#39;inizio della dissociazione o poco prima del passo triturazione (pipette riempire con i media e mantenere per 30 secondi). Questo consentirà di evitare le cellule di attaccarsi alla parte interna della pipetta Pasteur durante la triturazione. </li><li> acqua sterile per il lavaggio MilliQ PLL rivestite piatti o coprioggetto </li><li> MgSO 12,5% 4 soluzione in HBSS </li></ul> Poli-L-lisina rivestimento Se si utilizza coprioggetto di vetro, acido-lavaggio per 24 ore e sterilizzare prima della placcatura (vedi Kaech e Banker, 2006). Usare la lingua tedesca coprioggetto di vetro Desag. Per rivestire poli-L-lisina su coprioggetto di vetro o di plastica piatti coltura dei tessuti: <ul><li> sotto una cappa colture di tessuti, ricoprire le superfici con una piccola cupola di 100 ug / ml soluzione PLL per 1,75-2 ore. </li><li> lavare due volte con acqua MilliQ, almeno 5 minuti per lavaggio (può essere effettuata durante la fase cellula dissociazione di seguito). </li><li> conservare in acqua fino al momento dell&#39;uso. Non lasciate che il PLL rivestita superficie asciutta. Per ridurre gli sprechi PLL per il rivestimento coprioggetto, collocare il coprioggetto in sterili piatti batterica Petri. Cappotto e lavare i coprioggetti mettendo una cupola di liquido sul coprioggetto. I piatti batterica Petri sono idrofobiche, in modo che il liquido deve rimanere sul coprioggetto di vetro. Trasferire i coprioggetti ai piatti coltura dei tessuti poco prima placcatura le cellule. Per i neuroni placcato su piatti di plastica coltura tissutale, l&#39;adesione è normalmente più alto, così allungamento dei neuriti potrebbe essere diminuita. </li></ul> Dissociazione e placcatura <ol><li> Verificare che le strisce dorsale si sono stabiliti fino al fondo della provetta. Eliminare la maggior parte HiHS L-15 +10% con una pipetta Pasteur. Lavare rapidamente le strisce dorsale del tubo neurale, una volta con l&#39;aggiunta di 3 ml di freddo (4 ° C) HBSS. </li><li> Lasciate che le strisce dorsale del tubo neurale accontentarsi di 2 minuti, quindi rimuovere la HBSS con una pipetta Pasteur. </li><li> Aggiungi caldo (37 ° C) HBSS ad un volume di 4,7 ml. Tgallina aggiungere 0,3 ml di tripsina 2,5% per ottenere una concentrazione finale di 0,15% tripsina. </li><li> Incubare a 37 ° C in bagnomaria per 7 min. Mescolare delicatamente una volta a metà strada attraverso l&#39;incubazione. </li><li> Aggiungere 30 microlitri DNAsi (25 000 U / mL) per una concentrazione finale di 150 U / mL. Aggiungere 60 ml di MgSO 4 e mescolare brevemente, per una concentrazione finale di 0,15%. Per il tessuto da dissezioni grossolani, incubare per un extra di 1 minuto a 37 ° C in bagnomaria. In questa fase, le sezioni del tubo neurale dorsale dovrebbe essere frammentato. Se le sezioni dorsale del tubo neurale non hanno cominciato a frammento, in genere significa che lo stock di tripsina 2,5% è vecchio, e archivi fotografici dovrebbero essere scongelati, o il lavaggio con HBSS freddo non rimuovono efficacemente il HiHS dal campione. </li><li> Centrifugare i frammenti di tessuto a 200 g per 4 min. </li><li> Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur, lasciando ~ 50-100 ml di liquido sul fondo della provetta. </li><li> Flick il tubo dolcemente per allentare il pellet, poi lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 5 ml di HBSS caldo. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 2 min. </li><li> Centrifugare a 200 g per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur, lasciando ~ 50-100 ml di liquido sul fondo della provetta. </li><li> Flick il tubo dolcemente per allentare il pellet e risospendere le cellule in parte. Poi aggiungere 2 ml di HBSS caldo. </li><li> Utilizzare il piccolo (metà diametro) fuoco lucido vetro pipetta Pasteur di dissociare le cellule lentamente pipettando su e giù 4-6 volte. Evita di fare bolle, e pipetta il liquido contro la parete del tubo. Non troppo triturare. </li><li> Utilizzare il più piccolo incendio lucidato vetro pipetta Pasteur di dissociarsi ulteriormente le cellule lentamente pipettando su e giù 3-4 volte. Evita di fare bolle, e pipetta il liquido contro la parete del tubo. Non troppo triturare. Per il tessuto da dissezioni grossolana, aggiungere un ulteriore 1 ml di HBSS caldo al tubo al termine della dissociazione. Quando dissociare le cellule, non è necessario dissociare tutti i grumi di cellule e aggregati. Fermare pipettando su e giù o passare a una pipetta Pasteur con un diametro inferiore se si vede non diminuire ulteriormente le dimensioni degli aggregati di cellule con pipettaggio ulteriormente. </li><li> Lasciate che i frammenti residui di tessuto stabilirsi nella provetta per 1 min. Non è necessario trasferire le cellule in una nuova provetta. </li><li> Prelevare 20 ml di sospensione cellulare e aggiungere 5 ml di trypan blu. Contare le celle su un emocitometro. I neuroni devono essere ≥ 95% valida per esclusione trypan blu. </li><li> Piastra i neuroni in Media Placcatura Neurobasal (vedi ricette di seguito). <ul><li> Densità di placcatura suggerito per l&#39;ottenimento di neuroni isolati (a bassa densità culture al fine di evitare i neuroni aggregazione o sovrapposti tra loro): </li><li> 120 000 - 180 000 cellule / pozzetto di una piastra ben 6 </li><li> 60 000 - 75 000 cellule / pozzetto di una piastra 12 pozzetti </li></ul></li><li> 16-18 ore più tardi, cambiare il supporto a Media crescita Neurobasal (vedi ricette di seguito) Non usare una pompa a vuoto per aspirare il contenuto del piatto quando si cambia la cultura dei media; delicatamente con una pipetta. Questo evita sloggiare i neuroni. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Quattro ore dopo la placcatura, i neuroni devono avere aderito al poli-L-lisina (PLL)-superficie rivestita. Sotto illuminazione a contrasto di fase, corpi cellulari aderito sono in genere relativamente piatto e di forma ovale (fig. 2a). Cellule che non hanno ben aderito appaiono come sfere che si muovono leggermente quando il piatto è molto delicatamente colpita sul lato. Molti fattori potenzialmente in grado di impedire l&#39;adesione delle cellule (vedi discussione). Dopo 30 ore in vitro, la maggior parte dei neuroni hanno esteso un assone con un cono di crescita visibile (fig 2c, d). Se la scarsa crescita assonale si osserva, verificare che i mezzi di crescita Neurobasal è stato fatto con terreno fresco e supplementi. I neuroni restano sani per almeno 6 giorni in queste condizioni. Questa procedura ha dimostrato di resa affidabile preparazioni altamente arricchito nei neuroni commissurali, con ~ 90% dei neuroni che esprimono DCC (Yam et al. 2009). La larghezza della striscia dorsale del midollo spinale che viene utilizzato per la preparazione della sospensione cellulare influenzerà la purezza della cultura, con una maggiore purezza quando sottili strisce sono utilizzati. Un esempio di applicazione è mostrato in figura 3 (immunofluorescenza). Vedi l&#39;articolo di Yam et al. (2009) per ulteriori esempi. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schemi di passi dissezione del midollo spinale. D = dorsali, V = ventrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1773/1773fig1.jpg">Clicca qui per vedere una figura più grande.</a> <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Risultato Rappresentante del commissurali isolatoneuroni placcato su un PLL rivestita coprioggetto di vetro. a, b) 4 ore dopo la placcatura, i neuroni hanno aderito alla superficie. Bar = 20 micron. c, d) 30 ore dopo la placcatura, la maggior parte dei neuroni hanno esteso un assone con un cono di crescita visibile. Bar = 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Un neurone commissurali immunostained di gamma-tubulina (verde), con F-actina etichettati da falloidina (F-actina, rosso) e il nucleo di DAPI (blu). Ricette e commenti Terreni in piastra Neurobasal <ul><li> Neurobasal </li><li> 10% di siero FBS (HiFBS) </li><li> 2 mM L-glutammina (da 200 mM soluzione stock) Opzionale: antibiotici penicillina / streptomicina (usa la metà della concentrazione normale) </li></ul> La crescita media Neurobasal <ul><li> Neurobasal </li><li> B27 (1 / 50 di diluizione a magazzino) </li><li> 2 mM L-glutammina (da 200 mM soluzione stock) </li><li> Opzionale: antibiotici penicillina / streptomicina (usa la metà della concentrazione normale) Una volta che i media è fatta, può essere conservato a 4 ° C per due settimane. Per equilibrare la temperatura e il pH del supporto prima placcatura le cellule, i media luogo in piastre di coltura tissutale Petri e posto in una coltura di tessuti incubatore per almeno 1,5 ore. </li></ul> Neurobasal Dopo una bottiglia di medio Neurobasal è stato aperto, può essere conservato per un mese a 4 ° C al buio. Smaltire Neurobasal che è stato aperto per più di un mese altrimenti la sopravvivenza delle cellule sarà più bassa. Inattivati ​​al calore siero fetale bovino (HiFBS) o siero di cavallo (HiHS) Per riscaldare-inattivare calore FBS o HS, a 56 ° C a bagnomaria per 30 minuti. Agitare il flacone ogni 10 minuti circa o giù di lì. (Per la precisione l&#39;uso di una bottiglia di dimensioni simili riempito d&#39;acqua. Inserire un termometro nella bottiglia d&#39;acqua per vedere quando 56 ° C è stata raggiunta. Begin tempi a questo punto.) Calore-inattivato FBS può essere necessario centrifugare per cancellare precipitati, e può essere aliquotati e ri-congelato a -20 ° C. L-Glutammina Sempre disgelo una nuova aliquota di L-glutamina per ciascun esperimento. B27 Aliquote di B27 può essere mantenuta a 20 ° C per una conservazione a lungo termine, oppure a 4 ° C per un massimo di un mese.

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	<li>Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. , 113-1111 (2003).</li><li>Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+ipsilateral+retinal+ganglion+cell+axons+at+the+optic+chiasm+requires+the+Shh+Receptor+Boc.">Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc.</a> Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).</li><li>Helms, A. W., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitors+of+dorsal+commissural+interneurons+are+defined+by+MATH1+expression.">Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression.</a> Development. 125, 919-928 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boc+is+a+receptor+for+sonic+hedgehog+in+the+guidance+of+commissural+axons.">Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons.</a> Nature. 444, 369-373 (2006).</li><li>Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+axons+through+a+noncanonical,+Src-family-kinase-dependent+signaling+pathway.">Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway.</a> Neuron. 62, 349-362 (2009).</li></ol>

Abbiamo descritto un metodo per analizzare e cultura neuroni commissurali dal midollo spinale di ratto embrionale. Questa procedura è stata utilizzata di routine nel nostro laboratorio per la preparazione affidabile neuroni per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di orientamento degli assoni. Per la biologia cellulare e gli esperimenti immunochimica, dissezione di una cucciolata produce i neuroni sufficienti. Quando le cellule sono più necessari, come in molti esperimenti di biochimica, la dissezione di due c...

Dissezione del cavo embrionale dorsale spinale di ratto (vedi anche tabella I) <ul><li> E13 gravidanza scena ratto </li><li> Etanolo al 70% </li><li> Forbici chirurgiche, strumenti Scienze Arti </li><li> Pinza, Dumont # 5, Strumenti Scienze Arti </li><li> Petri </li><li> L-15 di media </li><li> Dissezione microscopio, Leica </li><li> Pipette di plastica </li><li> Microscissors, Strumenti Scienze Arti </li><li> Aghi di tungsteno e titolari pin (un gancio a forma di ago, un L-forme ago, un ago dritto), Strumenti di Scienze Arti </li><li> Inattivato al calore Horse Serum (HiHS) </li><li> Provette da 15 ml di plastica </li></ul> Commissurali neurone cultura (vedi anche tabella I) <ul><li> Tessuto incubatori cultura (37 ° C, 5% CO 2, umidità controllata) </li><li> Tedesco coprioggetto di vetro Desag e / o plastica piatti coltura dei tessuti </li><li> Poli-L-lisina, Sigma </li><li> Sterili MilliQ H 2 O </li><li> Neurobasal, Invitrogen </li><li> Inattivati ​​al calore siero fetale bovino (HiFBS) </li><li> L-Glutammina </li><li> B27, Invitrogen </li><li> Penicillina / streptomicina antibiotici </li><li> 37 ° C a bagno-maria </li><li> Pipette Pasteur sterile </li><li> Bunsen bruciatore a gas </li><li> HBSS, Ca 2 + / Mg 2 +-free, Invitrogen </li><li> DNAsi, Worthington </li><li> MgSO 4 </li><li> Centrifuga </li><li> Emocitometro </li><li> Tricloroetano Soluzione </li></ul>

dissection and culture of commissural neurons from embryonic spinal cord

Commissurali neuroni sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi alla base di guida degli assoni durante lo sviluppo embrionale del midollo spinale. I corpi cellulari di questi neuroni si trovano nel midollo spinale dorsale e la loro assoni seguire traiettorie stereotipati durante lo sviluppo embrionale. Assoni commissurali inizialmente progetto ventralmente verso il fondello. Dopo aver attraversato la linea mediana, questi assoni svolta anteriormente e verso il progetto del cervello. Ognuno di questi passi è regolata dall&#39;azione di spunti di guida diversi. Culture altamente arricchito nei neuroni commissurali sono ideali per molti esperimenti affrontare i meccanismi di pathfinding assone, tra cui saggi di tornitura, immunochimica e biochimica. Qui, descriviamo un metodo per analizzare e cultura neuroni commissurali dalla E13 del midollo spinale dorsale di ratto. In primo luogo, il midollo spinale è isolato e strisce dorsali sono sezionati fuori. Il tessuto dorsale è poi dissociata in una sospensione cellulare da tripsinizzazione e distruzione meccanica. I neuroni sono placcati su poli-L-lisina rivestite coprioggetto di vetro o dei tessuti-cultura piatti. Dopo 30 ore<em&gt; In vitro</em&gt;, La maggior parte dei neuroni hanno esteso un assone. La purezza della cultura (Yam<em&gt; Et al.</em&gt; 2009), di solito oltre il 90%, può essere valutata immunomarcatura con la DCC commissurali marcatori neurone, LH2 e TAG1 (Helms e Johnson, 1998). Questa preparazione neuronale è un utile strumento per<em&gt; In vitro</em&gt; Gli studi dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni commissurali e la guida durante lo sviluppo del midollo spinale.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Questo video illustra un metodo per analizzare e cultura neuroni commissurali dalla E13 del midollo spinale dorsale di ratto. Dissociato neuroni commissurali sono utili per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni e di orientamento.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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16.8K Views.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal. Questo video illustra un metodo per analizzare e cultura neuroni commissurali dalla E13 del midollo spinale dorsale di ratto. Dissociato neuroni commissurali sono utili per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni e di orientamento.

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Ricerca

Neuroscienze

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissezione e Cultura della gangliari Chick Statoacoustic Espianti e del midollo spinale in gel di collagene per saggi crescita dei neuriti

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Un gruppo motore funzionale nella piastra di coltura: Co-coltura degli espianti midollo spinale e le cellule muscolari

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...