Kurban edilmiş hamile bir fareyi sırtına bir diseksiyon tahtasına koyarak başlayın. Forseps kullanarak, abdominal orta hattı sıkıştırın. Bir çift keskin makasla karnını deriden ve peritondan cinsel organdan göğüs kafesine kadar orta hat üzerinden kesin.
Embriyoları içeren uterusu çıkarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Plasenta taraflarındaki yumurta sarısı kesesini dikkatlice kesin ve embriyoları çıkarın. Daha sonra, kafası kesilmiş embriyonik kafaları kalsiyum ve magnezyum eksikliği olan HBSS içeren buzlu bir kaba yerleştirin.
Kafayı sola bakan 35 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Bir gözü forsepsin kenarıyla delin, çeneyi diğeriyle sıkıca tutun. Kafa derisi derisini enseden orta hat boyunca buruna doğru nazikçe yırtın.
Beyaz oval omurilikten girmek için açılı forsepsleri kullanın ve kafatasını orta hat boyunca açarak beyni açığa çıkarın. Kafatasını yavaşça yanlardan soyun. Ardından, beyni kafatasından çıkarın ve kafatasını atın.
Meninksleri çıkarmak için forseps kullanın. Beyinleri iki mililitre kalsiyum ve magnezyum eksikliği olan HBSS içeren bir bijou'ya yerleştirin. Bijou'ya 250 mikrolitre 10X tripsin ekleyin.
Bijou'yu sallayarak beyinleri üçe katlayın ve ardından 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Daha sonra, her bijou'ya iki mililitre soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin. İnhibitörü eşit şekilde dağıtmak için çalkalayın.
Santrifüj yapmadan, her bir bijou'dan iki mililitre süpernatantı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Beş mililitrelik bir şırıngaya bağlı 19 gauge iğne kullanarak, bijou'da kalan hücreleri tritüre etmek için süspansiyonu iki kez aspire edin. Aspirasyonu 21 gauge iğne ile iki kez tekrarlayın.
23-G'lik bir iğne kullanarak, hücreleri bijou'dan hücre süpernatantını içeren 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüj. Beş milimetrelik serolojik pipet kullanarak, tüm süpernatantı pelet rahatsız etmeden yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın.
Her iki santrifüjleme adımından kombine peletleri içeren bir tüpe 10 mililitre kaplama malzemesi ekleyin ve bütün bir süspansiyon oluşturmak için iyice karıştırın. Hücreleri tripan mavisi ile lekeleyin ve bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak sayın. Murin E17 embriyonik beyin hücresi süspansiyonunun gerekli hacmini bir kuyu plakasına ekleyerek hücreleri plakalayın.
Hücreleri iki ila dört saat boyunca% 5 ila% 7 karbondioksit altında 37 santigrat derecede inkübe edin. Medyayı çıkardıktan sonra, her bir kutucuğa yeni farklılaştırma medyası ekleyin. Steril bir pipet ucu kullanarak yüzen kapak fişlerini bastırın.
Süpernatantın bir kısmını çıkararak ve haftada üç kez taze farklılaşma ortamıyla değiştirerek kültürleri koruyun. Kültürler, gelişimsel belirteçler olarak NG2 ve nestin, nöronal belirteçler olarak SMI31, MBP ve NeuN ve glial belirteçler olarak CNP, GFAP ve Iba1 için immünofloresan boyama ile görselleştirildi Kültürlerin nörotropik Semliki Orman virüsü ile enfeksiyonu oligodendrositleri ve nöronları etkiledi. Enfekte hücrelerin qRT-PCR incelemeleri, interferon beta ile tedavi edilen kültürlerde kemotaktik sitokin Ccl5 mRNA'nın upregülasyonunu göstermiştir.
ELISA çalışmaları, süpernatantta artmış Ccl5 gösterdi, böylece mRNA ve protein ekspresyonu arasında bir korelasyon gösterdi. Tek hücreli süspansiyonun akış sitometrik çalışmaları, hücrelerin% 70'inin canlı kaldığını göstermiştir. Çok sayıda mikroglia, nöron ve astrosit mevcutken, oligodendrositler en az bol olanıydı.
