Bu araştırma R35GM148160 (C. C.) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Eğitim Hibesi T32 GM007270 (R. C. S) tarafından desteklenmektedir.

NOT: Şekil 1'de bu etüdü gerçekleştirmek için gerekli malzemeler gösterilmektedir.
1. Deney için dikkat edilmesi gereken noktalar ve hazırlıklar
<ol><li>Larvaların aşırı kalabalıklaşmasını önleyin. NOT: Eksplant larva beyinlerinin kalitesi, diseksiyon öncesi larvaların sağlığı ve kalitesi ile doğrudan ilişkilidir. Aşırı kalabalıktan yetersiz beslenen larvalar genellikle daha düşük kaliteli beyinler verir30.<ol><li>Yetersiz beslenmeyi önlemek için yemek kapağı kabı başına 20-30'dan fazla larva bulunmadığından emin olun. Bunların örnekleri Şekil 2'de görülebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kullanmadan önce Schneider'in ortamını filtreleyin ve aliquot edin.<ol><li>Her diseksiyon için, alıntılanan Schneider'in böcek besiyerini% 1 sığır büyüme serumu (BGS) ile destekleyerek taze görüntüleme ve diseksiyon ortamı hazırlayın. Bir görüntüleme deneyi için genellikle 5 mL'lik bir diseksiyon ve görüntüleme ortamı hacmi yeterlidir.</li>
		<li>Kullanmadan önce takviye edilen ortamı oda sıcaklığına (RT) ısıtın.</li>
	</ol></li>
	<li>Toplanacak filmin uzunluğunu düşünün ve görüntüleme ortamının takviyesini, montaj yaklaşımını ve mikroskobun edinme ayarlarını hesaba katmak için bunu kullanın. NOT: En uygun koşullar altında, sadece BGS ile desteklenen beyinlerdeki NB'ler, 3 saate kadar sağlam bir şekilde bölünecektir.<ol><li>Daha uzun filmler gerektiren deneyler yaparken 4 saatten önceki bölünmeleri desteklemek için görüntüleme ortamına larva yağlı vücut dokuları ekleyerek görüntüleme ortamını destekleyin. NOT: Yağlı cisimler NB proliferasyonunu destekleyen mitojenler salgılar31 ve 10 larvadan gelen tüm yağlı vücutlar dört ila beş beyni desteklemek için yeterlidir. Ayrıca, membrana bağlı bir slaytla görüntülenen örneklerin 10 saat13,32'den fazla bölündüğü gösterilirken, çok kuyucuklu bir slaytla görüntülenen örnekler genellikle daha az bölünür (yayınlanmamış gözlemler).</li>
		<li>Alternatif olarak, daha önce açıklandığı gibi daha uzun filmler için daha karmaşık bir görüntüleme ortamı uygulayın33. En iyi sonuçlar için pozlama süresini, lazer gücünü ve örnekleme frekansını ayarlayarak fotohasarı en aza indirin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Larva evrelemesi ve toplanması (Şekil 2)
<ol><li>İstenilen genotipte döl üretmek için 1-5 günlük dişi bakire sinekleri 1-7 günlük yetişkin erkek sineklerle geçin. Optimum verim için, 10-15 dişi bakireyi 5-10 erkekle geçin. Bu sinekleri bir yemek kapağı olan bir sinek kafesine koyun (Şekil 2A-C) ve 25 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Yemek kapağını günlük olarak değiştirin. Bu, yemek kapaklarının larvalarla aşırı kalabalıklaşmasını önler, bu da disseke beyinlerin kalitesini düşürür.</li>
	<li>Yemek kapağı larvalarla önemli ölçüde kaplıysa (yani, >30), bu yemek kapağını ikiye bölün ve yarısını da ikiye kesilmiş taze bir yemek kapağıyla değiştirin. Alternatif olarak, yemek kapaklarını daha sık değiştirin (yani, her 24 saatte bir yerine her 12 saatte bir). Aşırı nüfuslu yemek kapaklarının örnekleri Şekil 2E, F'de görülebilir.</li>
	<li>Larvalar istenen yaşa ulaşana kadar yemek kapağını larvalarla 25 ° C'de inkübe edin.</li>
</ol>3. Larva yağlı vücut diseksiyonu (Şekil 3)
NOT: Bu protokol, 3 kuyucuklu bir diseksiyon kabı kullanarak diseksiyonları açıklar.
<ol><li>Pipet, 3 delikli bir diseksiyon kabının her bir kuyucuğuna ~ 400 μL diseksiyon ve görüntüleme ortamı.</li>
	<li>On adet 72-96 saatlik iyi beslenmiş vahşi tip larvaları, diseksiyon forsepsleri ile hafifçe tutarak ve tüm gıda partikülleri yıkanana kadar en alttaki kuyuya diseksiyon çözeltisinin içine ve dışına daldırarak yıkayın. Durulamadan sonra, temiz larvaları orta kuyuya taşıyın.</li>
	<li>Bir cımbız seti kullanarak, larvaları ağız kancalarından tutun. Diğer cımbız seti ile larvaların kütikülünün bir tarafını yırtın.</li>
	<li>Bu yırtılma, yağlı cisimlerin larvadan dökülmesine neden olacaktır. Yağ cisimleri kirli beyaz ve yarı yarı saydamdır ve kafes benzeri bir yapıya sahip olacaktır (Şekil 3I). Yağlı cisimler ayrıca kendilerine ve diseksiyon cımbızlarına yapışma eğiliminde olacaktır. Tanımlandıktan sonra, her larvadan mümkün olduğunca fazla yağ gövdesi toplayın ve forseps ile 400 μL RT diseksiyon ortamı ile en üstteki kuyuya aktarın.</li>
</ol>4. Larva beyin diseksiyonu (Şekil 3)
<ol><li>Deneysel larvaları yiyecek artıklarından arındırmak için yukarıdaki gibi diseksiyon ve görüntüleme ortamında yıkayın. En iyi sonuçlar için, disseke edilmemiş larvaları diseksiyon çözeltisinde saklamaktan kaçının. Bu, larvaların "boğulmasına" neden olacak ve disseke edilmiş beyinlerin kalitesini olumsuz yönde etkileyecektir.</li>
	<li>Bir cımbız seti kullanarak, larvaları ağız kancalarından tutun. Başka bir cımbız seti kullanarak, larvaların yaklaşık 1 / 3'ünü arka taraftan yavaşça kesin / sökün (Şekil 3A). Bu, sindirim sisteminin, yağ gövdelerinin, bağ dokusunun ve sinir sisteminin elemanlarının larvaların yırtılmış tarafından "patlamasına" neden olacaktır (Şekil 3B).</li>
	<li>Bir cımbız seti kullanarak, larvaları ağız kancalarından tutun. Diğer cımbız seti ile, kütikülü ağız kancalarına doğru nazikçe fırçalayın, tüm larva içten dışa dönene kadar ağız kancalarını tutan cımbızlarla içeri doğru "iterek". Bu hareket bir çorabı "içten dışa" çevirmeye benzer (Şekil 3C, D).</li>
	<li>Larvaları ters çevirin, böylece merkezi sinir sistemi ve diğer dokular hala kütiküle bağlıyken dışa doğru bakar. Bu adımda, yanlışlıkla çıkarılmasını önlemek için merkezi sinir sistemini (CNS) bulun. Cımbız kullanarak, CNS olmayan tüm dokuları nazikçe çıkarın, sadece CNS ve beyni kütiküle bağlı bırakın (Şekil 3E).</li>
	<li>Beyin, aksonal bağlantılar yoluyla kütiküle bağlanacaktır. Mikrodiseksiyon makası kullanarak, beyni kütikülden serbest bırakmak için bu aksonal bağlantıları kesin. Bunu yapmak için, önce beyin loblarının altını yavaşça kesin (Şekil 3F). Ventral sinir kordonunun altındaki bağlantılarla tekrarlayın. NOT: Bu adım, mikrodiseksiyon makası mevcut değilse cımbızla yapılabilir. Cımbız kullanırken, kütikülden çıkarılırken beyin dokusunun aşırı gerilmediğinden emin olmak için özel dikkat gösterin, çünkü mekanik stres beyin sağlığını olumsuz yönde etkileyecektir.</li>
	<li>Diseke edilen beyni diseksiyon ve görüntüleme ortamı ile bir kuyuya aktarın. 3 saatten daha uzun görüntüleme deneyleri için, yukarıda açıklandığı gibi yağlı cisimlerle desteklenmiş diseksiyon ve görüntüleme ortamı kullanın. Diseksiyon süresini 20 dakikanın altında tutmak için larvaları gruplar halinde diseke edin.</li>
</ol>5. Montaj ve görüntüleme (Şekil 4)
<ol><li>Membrana bağlı slayt34 ile görüntüleme için:<ol><li>Diseksiyon kabının son kuyusunda hem disseke edilmiş beyinleri hem de izole edilmiş yağ gövdelerini toplayın.</li>
		<li>Slaytın yarısını, slaytın arkasına gaz geçirgen bir membran yerleştirerek birleştirin ve bölünmüş halkayı yerinde tutarak merkeze bastırın (Şekil 4A-C).</li>
		<li>200 μL'lik bir mikropipet kullanarak, ~ 130-140 μL diseksiyon ve görüntüleme ortamında 10 adede kadar disseke edilmiş beyni ve mümkün olduğunca fazla yağ gövdesini (yukarıya bakın) membrana aktarın. Ortamı, numunelerle birlikte gaz geçirgen membranın ortasına bıraktığınızdan emin olun (Şekil 4D, E).</li>
		<li>Beyinleri, görüntülenecek NB popülasyonu ve kullanılan mikroskop türü için yönlendirin (Şekil 4E). Numuneyi mikroskopun amacına mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Örneğin, merkezi beyin loblarındaki NB'leri görüntülemek için, beyinleri beyin lobları hedefe en yakın olacak şekilde yönlendirin (Şekil 4H).</li>
		<li>Beyinler yönlendirildikten sonra, zardaki çözeltinin üzerine yavaşça bir cam örtü parçası yerleştirin. Bu, beyinleri ve yağ gövdelerini içeren çözeltinin zarın tamamına yayılmasına neden olacaktır (Şekil 4F).</li>
		<li>Bir laboratuvar dokusunu kapak kayma kenarına yakın tutarak aşırı çözeltiyi lekeleyin. En uygun çözüm miktarı, beyinler ezilmeden kapak kaymasına dokunduğunda elde edilir. Bu adımda yeniden yönlendirme gerekiyorsa, beyinleri hareket ettirmek için kapak kaymasını dikkatlice hareket ettirin.</li>
		<li>Bir boya fırçası ile kapak kaymasının kenarları boyunca erimiş petrol jölesi uygulayarak kapak kaymasını hareketsiz hale getirin. Jölenin katılaşmasına izin verin (Şekil 4G).</li>
	</ol></li>
	<li>Çok kuyulu görüntüleme slaytı ile görüntüleme için (Şekil 4):<ol><li>Çok kuyucuklu bir slaytın bir kuyucuğuna 400 μL görüntüleme ortamı ekleyin (burada yapılan deneyde, odacıklı 8 delikli bir mikro [μ] slayt kullanılmıştır; Şekil 4I). Daha önce disseke edilmiş yağ cisimleri bu kuyuya aktarın (bkz. adım 3.4).</li>
		<li>Kuyunun merkezine yakın bir kümede 10 adede kadar beyin biriktirin (Şekil 4J).</li>
		<li>Beyinleri, görüntülenecek NB popülasyonu ve kullanılan mikroskop türü için, adım 5.1.4'te açıklandığı gibi yönlendirin (Şekil 4K). Örnekleri birbirine yakın olacak şekilde düzenleyin. Bu, aşamanın numuneler arasında hareket etmesi gereken mesafeyi en aza indirecek ve bu da alım sırasında numune sürüklenmesini azaltacaktır.</li>
		<li>Beyinler kuyuya yönlendirildikten sonra, beyinlerin 2-5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Bu, taşıma / görüntüleme sırasında stabilitelerini arttırır. Bu süre zarfında mikroskopu edinim için hazırlayın.</li>
		<li>μ slaytı slayt kapağıyla örtün ve mikroskopa aktarın. Fotobeyazlatmayı en aza indirmek için mümkün olan en düşük lazer gücü ve pozlama süresi ile edinmeye başlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Veri işleme ve yönetimi için en iyi uygulamalar
<ol><li>Verileri mevcut analiz yazılımına göre gerektiği gibi işleyin.<ol><li>Burada gösterilen örnek için, elde edilen verileri SlideBook yazılımıyla SlideBook Image File (.sld) olarak kaydedin.</li>
		<li>Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü kullanarak Imaris'in tescilli dosya türüne (.ims) dönüştürmek için, Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü ayrı bir pencerede açın. .sld dosyalarını tıklayın ve Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nün " giriş" bölümüne sürükleyin.</li>
		<li>Dönüştürülen dosyalar için istediğiniz çıktı konumunu belirleyin ve "Tümünü başlat" ı tıklayın.</li>
		<li>Dönüştürmeden sonra, Imaris yazılımındaki verileri görüntüleyin ve bunlara açıklama ekleyin. NOT: Görüntü analizi için Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) veya diğerleri gibi Imaris yerine alternatifler kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Doğru kayıt tutma için orijinal verilerin mümkün olduğunca çoğunu saklayın. Örneğin, edinme yazılımı bir dosya biçiminde kaydedilmiş, ancak analiz için farklı bir biçime dönüştürülmüşse, verilerin edinilen sürümünü koruyun.</li>
	<li>Veri analizi için, örnek ve edinme ayarları hakkında mümkün olduğunca çok ayrıntının kaydını tutun. Saklanacak anahtar bilgiler, disseke edilen larvaların genotipini, diseksiyondan önce larvaların yaşını, yetiştirildikleri yemek kapağının durumunu, görüntüleme sırasında kullanılan lazer gücünü, maruz kalma süresini, edinim uzunluğunu ve zamansal çözünürlüğü içerir.</li>
</ol>7. Hücre döngüsü uzunluğunun örnek nicelleştirilmesi (Şekil 5)
NOT: Bu örnekte, polarite işaretleyici Pinleri (Pins::EGFP16) ve mikrotübül bağlayıcı protein Jüpiter25'i (cherry::Jüpiter13) ifade eden larvalar görüntülenmiştir. Sonraki analiz Imaris yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.
<ol><li>Seçtiğiniz görüntü analiz yazılımını kullanarak filmi açın. Bölünen NB'leri tanımlamak için filmin uzunluğu boyunca ilerleyin ve ileride başvurmak üzere etiketleyin. Bölünen NB'leri farklı mitotik iğlerine göre tanımlayın (Şekil 5C-E).</li>
	<li>Hücre döngüsü uzunluğunu belirlemek için bir referans hücre döngüsü aşaması tanımlayın. Bu örnekte, metafaz başvuru olarak kullanılmıştır.</li>
	<li>Ardışık metafazlar arasındaki kare sayısını el ile belirleyin ve bir hücre döngüsünü tamamlamak için geçen süreyi belirlemek için bunu dakikalara veya saatlere dönüştürün.<ol><li>Bunu, filmin zamansal çözünürlüğünü alarak ve metafazlar arasındaki kare sayısıyla çarparak yapın. Örneğin, filmin zamansal çözünürlüğü her 5 dakikada bir kareyse ve metafazlar kare 13 ve kare 35'te gözlenirse, bu metafazlar arasındaki süre 110 dakika olacaktır ([35 − 13] × 5).</li>
	</ol></li>
	<li>Verileri uygun herhangi bir yazılımla çizin. Burada gösterilen veriler PRISM yazılımı kullanılarak çizilmiştir.</li>
</ol>8. Hücre mili hizalamasının örnek nicelleştirilmesi (Şekil 5)
NOT: Bu örnekte, analiz Imaris yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.
<ol><li>Film dosyasını Imaris'te veya tercih edilen başka bir yazılımda açın. Bölünen NB'leri tanımlamak için filmin uzunluğu boyunca ilerleyin ve ileride başvurmak üzere etiketleyin.</li>
	<li>Apikal ve bazal sentrozomları ( m ile temsil edilen) kullanarak iş mili kutupları tarafından oluşturulan vektörü aşağıdaki gibi belirleyin: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq01.jpg" style="margin: auto;"> burada Ax, Ay ve Az , apikal sentrozomun koordinatlarıdır ve Bx, By ve Bz , bazal sentrozomun koordinatlarıdır. Benzer şekilde, bölünme vektörünün ekseni ( n ile temsil edilir) apikal Pinlerin orta noktası tarafından oluşturulur::EGFP hilali ve bazal korteks: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq02.jpg" style="margin: auto;"> burada Ax, Ay ve Az , Pinlerin orta noktasının koordinatlarıdır::EGFP hilali ve Bx, By ve Bz , bazal korteksin orta noktasının koordinatlarıdır.</li>
	<li>m ve n vektörlerinin büyüklüğünü belirleyin: m büyüklüğü:<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq03.jpg" style="margin: auto;"> n'nin büyüklüğü:<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq04.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>m ve n'nin nokta ürününü (k ile temsil edilen) belirleyin: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq05.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Nokta çarpımı k ve vektör büyüklükleri m ve n'yi kullanarak, vektörler arasındaki açıyı belirleyin: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq06.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Verileri tercih ettiğiniz yazılımda çizin. Burada gösterilen veriler Microsoft Excel'de hazırlanmış ve PRISM'de görselleştirilmiştir.</li>
</ol>

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Canlı Beyin Eksplantlarının Görüntülenmesi

<ol>
	<li>Delgado, M. K., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+cell+size,+fate,+and+behavior+during+asymmetric+cell+division.">Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division.</a> Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).</li><li>Sunchu, B., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+mechanisms+of+asymmetric+cell+division.">Principles and mechanisms of asymmetric cell division.</a> Development. 147 (13), (2020).</li><li>Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+A+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+neuroblasts:+A+model+for+asymmetric+stem+cell+divisions.">Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+does+asymmetry+come+from?+Illustrating+principles+of+polarity+and+asymmetry+establishment+in+Drosophila+neuroblasts.">Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).</li><li>Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+temporal+patterning+to+neuronal+connectivity+in+Drosophila+type+I+neuroblast+lineages.">From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).</li><li>Oon, C. H., Prehoda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+recruitment+and+actin+dependent+cortical+flows+drive+the+neuroblast+polarity+cycle.">Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 8, e45815 (2019).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Oon, C. H., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phases+of+cortical+actomyosin+dynamics+coupled+to+the+neuroblast+polarity+cycle.">Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 10, e66574 (2021).</li><li>LaFoya, B., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-dependent+membrane+polarization+reveals+the+mechanical+nature+of+the+neuroblast+polarity+cycle.">Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle.</a> Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).</li><li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis1/dynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).</li><li>Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NuMA-related+Mud+protein+binds+Pins+and+regulates+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spindle-independent+cleavage+furrow+positioning+pathway.">A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway.</a> Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).</li><li>Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cortical+extension+shifts+cleavage+furrow+position+in+Drosophila+neuroblasts.">Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).</li><li>Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+regulates+biased+myosin+activity+and+dynamics+during+asymmetric+cell+division+via+Drosophila+rho+kinase+and+protein+kinase+N.">Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N.</a> Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).</li><li>Montembault, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+efflux+promotes+cell+elongation+to+coordinate+chromosome+segregation+with+cell+cleavage.">Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage.</a> Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).</li><li>Roubinet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+separated+cortical+flows+and+spindle+geometry+establish+physical+asymmetry+in+fly+neural+stem+cells.">Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).</li><li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome.">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Lerit, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+centrosome+organization+by+the+PLP-Cnn+scaffold+is+required+for+centrosome+function.">Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function.</a> Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).</li><li>Gallaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+centriolar+localization+of+Polo+and+Centrobin+in+early+mitosis+primes+centrosome+asymmetry.">Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry.</a> PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).</li><li>Ramdas Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microcephaly-associated+protein+Wdr62/CG7337+is+required+to+maintain+centrosome+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).</li><li>Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centriolar+protein+Bld10/Cep135+is+required+to+establish+centrosome+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).</li><li>LaFoya, B., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consumption+of+a+polarized+membrane+reservoir+drives+asymmetric+membrane+expansion+during+the+unequal+divisions+of+neural+stem+cells.">Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells.</a> Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).</li><li>Sunchu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+chromatin+retention+and+nuclear+envelopes+separate+chromosomes+in+fused+cells+in+vivo.">Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo.</a> Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).</li><li>Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+animal+development:+How+hormones+and+metabolism+regulate+developmental+transitions+and+brain+formation.">Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation.</a> Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).</li><li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila:+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms.">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).</li><li>Lee, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Aurora-A+kinase+inhibits+neuroblast+self-renewal+by+regulating+aPKC/Numb+cortical+polarity+and+spindle+orientation.">Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation.</a> Genes &amp; Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).</li><li>Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+Drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages.</a> PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jupiter,+a+new+Drosophila+protein+associated+with+microtubules.">Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+Drosophila+tissues.">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).</li></ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir finansal açıklama bulunmamaktadır.

Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarından canlı eksplant beyinlerinin görüntülenmesi için bir yaklaşımı özetlemektedir. Burada açıklanan protokol, eksplant beyinlerinin doğru deneysel koşullar altında 12-20 saat boyunca gözlemlenmesini sağlar. Numunelerin hazırlanmasına ve istenen deneylerin tasarımına özel dikkat gösterilmelidir. Yukarıda belirtildiği gibi, disseke edilmiş dokunun kalitesini belirleyen en kritik faktörlerden biri larvaların sağlığıdır. Mümkün olan en ...

Asimetrik hücre bölünmesi (ACD), RNA, proteinler ve organeller gibi hücre altı bileşenlerinyavru hücreler 1,2 arasında eşit olmayan bir şekilde bölündüğü süreçtir. Bu süreç, farklı gelişimsel kaderlere sahip yavru hücrelere yol açmak için ACD'ye maruz kalan kök hücrelerde yaygın olarak görülür. Drosophila NB'ler, kökünü koruyan bir NB ve bir ganglion ana hücresi (GMC) üretmek için asimetrik olarak bölünür. GMC, farklılaştırıcı nöronlar veya glia3 üretmek için daha fazla bölünmeye uğrar. Asimetrik olarak bölünen NB'ler, mikroskopi ile kolayca gözlemlenen üçüncü instar larvalarının gelişmekte olan beyinlerinde bol miktarda bulunur. Üçüncü instar larva aşamasında, her bir merkezi beyin lobundayaklaşık 100 NB bulunur 3,4,5,6.
Asimetrik hücre bölünmesi oldukça dinamik bir süreçtir. Canlı hücre görüntüleme protokolleri, hücre polaritesi 7,8,9,10, iğ oryantasyonu11,12,13, aktomiyosin korteksdinamiği 14,15,16,17,18, mikrotübül ve sentrozom biyolojisi 19,20 dinamiklerini ölçmek ve ölçmek için kullanılmıştır,21,22,23,24,25,26,27 ve membran 10,28 ve kromatin dinamiği 29. ACD'nin nitel ve nicel açıklamaları, sağlam canlı beyinlerde NB'leri bölmek için sağlam yöntemlere ve protokollere dayanır. Aşağıdaki protokol, iki farklı montaj yaklaşımı kullanarak in vivo canlı hücre görüntüleme için üçüncü instar larva beyinlerini hazırlama, disseke etme ve görüntüleme yöntemlerini özetlemektedir. Bu yöntemler, kök hücre bölünmelerinin mekansal zamansal dinamiklerinin yanı sıra diğer beyin hücrelerindeki bölünmelerle ilgilenen araştırmacılar için en uygun olanıdır, çünkü hücresel olayların kısa ve uzun vadeli gözlemlerine izin verirler. Ek olarak, bu tekniklere alana yeni gelenler için kolayca erişilebilir. Bu yaklaşımın etkinliğini ve uyarlanabilirliğini, floresan olarak etiketlenmiş mikrotübül ve kortikal füzyon proteinlerini eksprese eden larva beyinleri ile gösteriyoruz. Ek olarak, analiz yöntemlerini ve diğer çalışmalarda uygulama için dikkat edilmesi gerekenleri tartışıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone (PES) Membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-231</td>
			<td>Vacuum-driven filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>20-248</td>
			<td>granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>NA</td>
			<td>Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30541.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Imaging Slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-machined metal slide</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5024343</td>
			<td>3-well porcelain micro spot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas-permeable membrane</td>
			<td>YSI</td>
			<td>98095</td>
			<td>Gas-permeable membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-03</td>
			<td># 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>NA</td>
			<td>Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris File Converter</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Yeast</td>
			<td>Saf-Instant</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molasses</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>62-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628161</td>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Vaseline</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook acquisition software</td>
			<td>3i</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 &#181;&#181;m PES membrane filter</td>
			<td>Genesee Scientific, GenClone</td>
			<td>25-231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of drosophila melanogaster third instar larval brains

Drosophila nöral kök hücreleri (nöroblastlar, bundan sonra NB'ler) asimetrik bölünmelere uğrar, kendini yenileyen nöroblastı yenilerken, aynı zamanda iki nöron veya glia'ya yol açmak için ek bir bölünmeye uğrayacak olan farklılaştırıcı bir gangliyon ana hücresi (GMC) oluşturur. NB'lerde yapılan çalışmalar, hücre polaritesi, iğ oryantasyonu, nöral kök hücre kendini yenileme ve farklılaşmanın altında yatan moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. Bu asimetrik hücre bölünmeleri, canlı hücre görüntüleme yoluyla kolayca gözlemlenebilir, bu da larva NB'leri canlı dokudaki asimetrik hücre bölünmesinin mekansal zamansal dinamiklerini araştırmak için ideal hale getirir. Besin takviyeli ortamda düzgün bir şekilde diseke edildiğinde ve görüntülendiğinde, eksplant beyinlerindeki NB'ler 12-20 saat boyunca sağlam bir şekilde bölünür. Daha önce açıklanan yöntemler teknik olarak zordur ve bu alanda yeni olanlar için zorlayıcı olabilir. Burada, yağ vücut takviyeleri kullanılarak canlı üçüncü instar larva beyin eksplantlarının hazırlanması, diseksiyonu, montajı ve görüntülenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Olası problemler de tartışılmakta ve bu tekniğin nasıl kullanılabileceğine dair örnekler verilmektedir.

Pinleri ifade eden merkezi beyin lobu NB'lerinin diseksiyonu ve görüntülenmesi::EGFP ve Cherry::Jüpiter Bu protokolü sergilemek için, UAS güdümlü Kiraz::Jüpiter13'ü ifade eden larvalar ve endojen olarak etiketlenmiş Pinler::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jüpiter/CyO; Pinler::EGFP/TM6B, Tb) çok kuyulu görüntüleme slaytları kullanılarak tarif edilen protokol kullanılarak 4 saat boyunca görüntülendi (Şekil 5C,D<...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants at JoVE.com

Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Burada, fizyolojik koşullar altında hücresel ve hücre altı dinamikleri gözlemlemek için Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarından canlı eksplant beyinlerini hazırlamak, parçalamak, monte etmek ve görüntülemek için bir iş akışını tartışıyoruz.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Araştırmamız, asimetrik hücre bölünmesinin veya ACD'nin kök hücre proliferasyonu ve farklılaşması üzerindeki etkisini incelemeye odaklanmaktadır. Asimetrik hücre bölünmesinin gelişim ve nörogenez üzerindeki mekanizmalarını, düzenlemelerini ve etkilerini anlamak için Drosophila nöral kök hücrelerini veya nöroblastlarını bir model olarak kullanıyoruz. Yapay zekadaki son gelişmeler, yaşam hücresi görüntüleme alanını önemli ölçüde geliştiren görüntü nicelleştirme ve analizinde büyük adımlar atmaktadır.Uzun vadeli bir film için örnek kalitesini korumak, uzun süredir devam eden bir zorluktur. Bir numuneyi sekiz ila 10 saat boyunca gözlemlemek anlayışlı olsa da, numunenin görüntüleme gereksinimleri ve mevcut görüntüleme araçları gibi lojistik kısıtlamalar bunu zorlaştırır. Protokolümüz, numunenin kalitesini etkilemeden uzun süreli görüntüleme göstererek bunu ele almaktadır.Tekniğimiz yeni gelenler tarafından kolayca benimsenebilir ve alana uygulanabilir. Biraz zaman ve pratikle, anlayışlı ve anlamlı veriler üretme potansiyeline sahip kısa ve uzun vadeli filmler üretilebilir.

live-cell-imaging-drosophila-melanogaster-third-instar-larval

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

1.4K Görüntüleme.  University of Washington. Araştırmamız, asimetrik hücre bölünmesinin veya ACD'nin kök hücre proliferasyonu ve farklılaşması üzerindeki etkisini incelemeye odaklanmaktadır. Asimetrik hücre bölünmesinin gelişim ve nörogenez üzerindeki mekanizmalarını, düzenlemelerini ve etkilerini anlamak için Drosophila nöral kök hücrelerini veya nöroblastlarını bir model olarak kullanıyoruz. Yapay zekadaki son gelişmeler, yaşam hücresi görüntüleme alanını önemli ölçüde geliştiren görüntü n...

Video: Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Gelişim Biyolojisi

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Meyve Fly Yetiştirme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal metabolism. By combining the vast array of Drosophila genetic tools with the ability to survey large swaths of intermediary metabolism, a metabolomics approach can reveal complex interactions between diet, genotype, life-history events, and environmental cues. In addition, metabolomics studies can discover novel enzymatic mechanisms and uncover previously unknown connections between seemingly disparate metabolic pathways. In order to facilitate more widespread use of this technology among the Drosophila community, here we provide a detailed protocol that describes how to prepare Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomic analysis. Our protocol includes descriptions of larval sample collection, metabolite extraction, chemical derivatization, and GC-MS analysis. Successful completion of this protocol will allow users to measure the relative abundance of small polar metabolites, including amino acids, sugars, and organic acids involved in glycolysis and the TCA cycles.

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

This protocol describes how to prepare Drosophila larvae for GC-MS-based metabolomic analysis.

Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Drosophila melanogaster endokrin bozulma test yöntemleri

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Optik lob görselleştirmesi için larva ve erişkin drosophila beyinlerinin diseksiyonu, immünohistokimyası ve montajı

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.