Başlamak için, HEK 293T hücreleri elde edin ve takviye edilmiş DMEM ortamında 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında oyuk başına 800.000 hücre plakasını elde edin. % 60 ila 80 birleşme elde etmek için plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Daha sonra, her plazmit DNA'nın bir mikrogramını 200 mikrolitre serumsuz DMEM ve altı mikrolitre transfeksiyon reaktifi ile karıştırın.
15 dakikalık inkübasyondan sonra, hücrelerin oyuğu başına 100 mikrolitre transfeksiyon karışımı dağıtın. Gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörde inkübe edin. Üçüncü günde, hücrelere ayrı ayrı uygun miktarda rapamisin veya etanol ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörde bir saat inkübe edin.
Ardından plakayı buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri üç mililitre soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, rapamisin veya etanol içeren 300 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve hücreleri bir hücre kazıyıcı ile kazıyın. Numuneyi 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 1.000 g'da 10 dakika mikrosantrifüj edin.
Ekspresyon seviyelerini kontrol etmek için, süpernatanın 20 mikrolitresini yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe alın. Numuneyi% 5 beta merkaptoetanol içeren 20 mikrolitre 2x Laemmli tamponu ile 95 ila 100 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.
