Bu çalışma kısmen hibe no tarafından desteklenmiştir. 213/09 İsrail Bilim Vakfı, hiçbir hibe. 2005258 BSF kuruluşundan itibaren, hiçbir hibe. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) 201.665 ve Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü tarafından Technion. Biz Siyanobakterinin arz ve işlenmesiyle ilgili Technion Kimya Schulich Fakültesi Prof. Noam Adir ve Faris salame yardım kabul ediyorsunuz. Technion Mikro-Nano Fabrikasyon Ünitesi Svetlana Yoffis yardım ve desteği büyük ölçüde takdir edilmektedir.

1. ESR Micro görüntüleme Genel Bakış Öncelikle, kısa bir açıklama ESR, ESR mikroskopi ve sisteminin çeşitli bileşenleri sağlamak ve o zaman gerçek görüntüleme deneyleri anlatacağız. Elektron spin rezonans, altına yerleştirilen bir dış statik manyetik alan (Şekil 1), belirli bir frekansta elektromanyetik radyasyon eşleşmemiş elektron spin molekülleri tarafından emildiği bir spektroskopik tekniktir. ESR, serbest radikaller ve paramanyetik merkezleri ve kimlik tespiti için, kimya, biyoloji, fizik, malzeme bilimi gibi bilim geniş alanlarda istihdam edilmektedir. Bu canlı türlerinin paramanyetik moleküllerin çevre eğitimi için güçlü bir yöntemdir ve asitlik (pH), viskozite, oksijen, ve reaktif oksijen türleri konsantrasyonları 3 hakkında bilgi sağlar. ESR, heterojen örnekleri için, spektral bilgileri, manyetik alan gradyanlar 4 kullanımı yoluyla, mekansal çözüme bir şekilde (yani, bir görüntü elde ederek) elde edilebilir. Bu esas olarak proton spin gözlemler manyetik rezonans görüntüleme (MRG) daha yaygın yöntem çok benzer. Şimdiye kadar, bu ESR görüntüleme teknikleri birkaç santimetre nispeten büyük boyutu ve çözünürlük mm çaplı canlı örnekler için uygulanmıştır. ESR görüntülemede (Örneğin Şekil 2, 5 referans alınan bakın.) Nispeten yeni bir gelişme milimetre ve alt milimetre boyutunda örneklerin ölçümleri milimetre çaplı çözünürlükte küçük hayvanlar bakarak yeteneklerini uzantısı mikron ölçekli çözünürlüğü. Bu alan, 1 mikron 2 (Şekil 3 temsilcisi örneklerini görmek) yaklaşan bir çözünürlüğe sahip 3D ESR görüntüleri sağlayabilir bugün ESR mikroskopi olarak bilinir . ESR mikroskop aslında geleneksel bir ESR spektrometresi benzer. Bu satın alma süreci ve veri işleme kontrol etmek için statik alan, spin eksitasyon ve sinyal tespiti için bir mikrodalga sistemi, örnek tutmak için bir sonda ve bilgisayarlı bir konsol üretmek için bir mıknatıs vardır. Diğer bileşenler benzersiz ESR genel görüntüleme ve ESR küçük kopya da mevcut görüntüleme probu bulunmaktadır manyetik elektronik sistemin bir parçası alanında degrade kaynakları, ve degrade bobinleri. Bizim özel sistem hakkında daha fazla bilgi protokol filmde gösterilen ve referans 2&#39;de açıklanmıştır. 2. ESR Micro görüntüleme Numune Hazırlama Bu aşama, ESR mikro görüntüleme deney için numune hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Bu aşamada hücreler sonunda trityl radikal 6 tampon çözelti ile birlikte, özel olarak hazırlanmış cam ESR mikroskopi numune kabı alt yerleştirilir . Bu protokol siyanobakteriler hücrelerinin ölçüm açıklar ve bu nedenle, diğer hücre türleri için uygun ayarlamalar numune hazırlama aşamasında gerekli olabilir. <ol><li> İlk olarak, ~ 400 400 mikron boyutunda emici kağıt birkaç kareler alınan ve daha sonra 1.2 mL (40 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon) siyanobakteriler süspansiyon ile dolu bir Eppendorf tüp içine yerleştirilir. </li><li> Süspansiyon bir mikrosantrifüj 6000 RPM 2 dakika süreyle santrifüj edilir. </li><li> Bunu takiben, supernatant tampon ~ 50 mcL siyanobakteriler dehidratasyonu önlemek için sol dışında tamamen kaldırılır. Bu sürecin bir sonucu olarak, emici kağıt siyanobakteriler hücreleri tarafından doymuş yağlardır. </li><li> Ince cımbız kullanarak, birkaç lif kağıt ayıklanır ve bir bardak gibi özel olarak hazırlanmış cam numune tutucu 7 altına yerleştirilir. Trityl BG-11 çözüm 8, 9, 3 mM (bkz: Programı 1) ince bir şırınga yardımıyla numune tutucu eklenir . Sahibi, daha sonra küçük bir hava çıkışı açık bırakarak, UV yapıştırıcı kullanarak mühürlü. <table border="1"><tbody><tr><td> Stok 4 </td><td> Stok 3 </td><td> Stok 2 </td><td> Stok 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Ferrik amonyum sitrat 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Sitrik asit: 1H2O 0.6g/liter </td&gt; </tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Programı 1. BG-11 ortamın hazırlanması. </li></ol> 3. ESR Micro-görüntüleme Deneyler <ol><li> Görüntüleme deney başlamak için, ESR mikro görüntüleme sistemi açmak ve görüntüleme probu içine girdiğini rezonatör örnek eklemek. </li><li> Şimdi, bilgisayar kontrol yazılımı kullanarak, &quot;Dinle&quot; modunda sistem ve ESR ölçümleri için kullanılan prob rezonans mikrodalga frekans bulmak. </li><li> Ki, darbe dizisi için zamanlama parametrelerini ayarlamak, uygulanan mikrodalga frekans eşleşen değer statik manyetik alan ve emin olmak için ESR sinyali gözlemlemek ardından bu sistemi fonksiyonları ve örnek iyi hazırlanmış. </li><li> Sonra, piksel sayısını görüntüleme parametreleri, gradyanlar gücünü ve gerekli değerleri degrade bakliyat uzunluğu ayarlayın. </li><li> Kurulum sonrasında interpulse ayırma, değerleri  500, 600, 700 ns ile Hahn eko görüntüleme darbe dizisi (Şekil 4), üç 3D ESR görüntüleri toplamak. </li><li> Örnek olarak tahmin Işık gerekli deneysel koşullara bağlı olarak açık ya da kapalı. </li><li> Satın alma sırasında, veriler otomatik olarak kaydedilir. Tezler ham veri dosyaları sonra trityl radikal konsantrasyon ve gevşeme zamanı önceden varolan bir kalibrasyon ile bir oksijen konsantrasyonu görüntü çevrilmiştir T 2 harita görüntülerini sağlamak için Matlab yazılımı komut dosyası üzerinden işlenir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Deney sonuçlarının farklı τ değerleri kaydedilmiş üç boyutlu birkaç ESR mikro-görüntüleri. Tipik ham veri görüntüleri Şekil 5&#39;te verilmektedir. Karanlık koşullar altında ölçülen en büyük üç fotoğraf, sinyal yoğunluğunda azalma dışında çok benzer. Öte yandan, örnek farklı yerlerinde farklı dinlenme süreleri nedeniyle ışık ışınlama altında görüntü düzeni değişir. Bu veriler, Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi ve aynı zamanda gevşeme zamanı, T 2 (Şekil 7) görüntüleri bir genlik görüntü elde etmek için 1 işlenmiş olabilir. T 2 görüntüleri denklemi üzerinden rahatlama zaman oksijen konsantrasyonu bağlantılar önceden varolan bir kalibrasyon eğrisi ile oksijen konsantrasyonu değerleri çevrilir: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Denklem 1" /> Burada, T 2 0 prob spin-spin relaksasyon zamanı anoksik koşullar altında (prob konsantrasyon, C ve D difüzyon katsayısı bağlı olarak), ve k bir orantılılık sabittir. Çoğu durumda, difüzyon katsayısı (gerekirse, prensip olarak doğrudan ESR 6, 10 ile de değerlendirilebilir, fakat) canlı örnekler için çok değişmez, ve spin konsantrasyon görüntüleme işlemi sırasında elde edilir. Bu nedenle, bu ilişkiyi doğrudan oksijen konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir. Şekil 6 geri dönecek olursak, siyanobakteriler hücreler esas numune tutucu sağ tarafta yer olduğunu genlik görüntü açıktır. Ayrıca, Şekil 7 dayalı, ışık O 2 üretimi başlatır ve özellikle siyanobakteriler yakın vokseller, çözümün O 2 konsantrasyonunda önemli bir artışa neden olduğu açıktır. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: elektron spin rezonans enerji seviyeleri. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Tipik bir Tümör taşıyan fare oksijen konsantrasyonu görüntü. MRI görüntü dayalı anatomik bilgi, soldaki görüntü gösterir. Kararlı bir serbest radikal organik fare enjekte ve kendi ESR özellikleri, çevresi (sağda), oksijen konsantrasyonu sağlar. ESR tabanlı sonuçları MRG anatomik görüntü üzerine bindirilmiş. Görüş alanı 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: yüksek çözünürlüklü mikro ölçekli ES iki örnekPhotolithographically N @ C 60 tozu (solda) ve LiPc paramanyetik kristalleri ile oluşturulan örnek R görüntüleri (sağda) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4: mikrodalga (MW) gösteren ve degrade, G x, G y ve G z bakliyat Tipik Hahn görüntüleme darbe dizisi <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5: Tipik ham veri ESR mikro görüntüler: a, b ve c = 500.600.700 ns sırasıyla τ ölçülen ışık aydınlatma cyanobacterium örnek ham veriler. Öğeler, d, e, ve a, b ve c gibi ama ışık aydınlatması ile aynıdır. Yoğunluğu keyfi ölçeğinde çizilmiştir (ancak, üç karanlık veya hafif ham veri görüntüleri her içinde tutarlı) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6: Genlik radikal çözüm konsantrasyonu (keyfi ölçekli) karşılık gelen görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7: T 2 görüntüler ve ilgili [O 2] değerleri koyu (solda) ve ışık koşulları altında (sağda).

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

Bu protokol, ESR mikro-görüntüleme canlı küçük örnekler yanında oksijen konsantrasyonu haritaya nasıl uygulanabileceğini gösteriyor. Mekansal çözünürlükte ~ 30 x 30 x 100 mikron yakın mikromolar oksijen konsantrasyonu duyarlılık ve voksel başına alt femtomole mutlak oksijen hassasiyeti göstermiştir. ESR mikro görüntüleme kullanımı hücrelerin yakın oksijen haritalama için mikro elektrotlar veya fosforesans / floresan dayalı mevcut teknikleri tamamlar. Ayrıca, uygun paramanyetik probu ile, hücre içi oksijen mikro-görüntüleme, diğer yöntemlerle elde etmek için çok zor bir yeteneği kolayca uygulanabilir olacaktır. Yakın bir gelecekte, süper oksit konsantrasyonu, asitlik (pH), prob difüzyon katsayısı ve tabii ki, oksijen konsantrasyonu gibi kontrast parametreleri sağlayarak, daha birkaç mikron çözünürlüğü ile canlı örnek görüntüler elde etmek için bu metodoloji geliştirmek planlıyoruz. Bu yetenekler, kontrast tip açısından ve hem de örnekleri özellikleri (bazı durumlarda örneğin şeffaf olmayan kalın örnekleri, hücre içi vs. Ekstrasellüler ölçümler) mevcut optik tabanlı yöntemlere tamamlayıcı niteliktedir.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

Bu protokol mikron ölçekli çözünürlük 1 canlı hücreleri derhal ortamda oksijen düzeyleri üç boyutlu haritalama için bir elektron spin rezonans (ESR) mikro görüntüleme yöntemi açıklamaktadır. Oksijen yaşam döngüsünde en önemli moleküllerden biridir. Mitokondride oksidatif fosforilasyon terminal elektron alıcısı olarak görür ve reaktif oksijen türlerinin üretiminde kullanılır. Oksijen ölçümleri, mitokondriyal ve metabolik fonksiyonları, sinyal yolları, çeşitli uyaranların, membran geçirgenlik ve hastalık farklılaşma etkisi çalışması için önemlidir. Oksijen tüketimi, bu nedenle, bütün organizmaların hücreleri mitokondri çeşitli biyolojik sistemler geniş uygulanabilir hücre metabolizması, bilgilendirici bir göstergedir. Önemi nedeniyle, pek çok yöntem canlı sistemlerde oksijen ölçümleri için geliştirilmiştir. Şu girişimleri yüksek çözünürlüklü oksijen görüntüleme sağlamak için, özellikle yüksek foto-toksisite ve düşük oksijen hassasiyeti problar istihdam olarak tatmin edici sonuçlar sağlamak için başarısız optik floresans ve fosforesans yöntemleri dayanmaktadır. ESR, örnek dışsal paramanyetik probları sinyal ölçer, oksijen konsantrasyonu çok hassas ölçümler sağlamak için bilinir. Tipik bir vakada, ESR ölçümleri prob lineshape genişletilmesi ve / veya yerel oksijen konsantrasyonu doğrudan bağlantılı olan dinlenme süresini kısaltarak haritası. (Oksijen paramanyetik; bu nedenle, dışsal paramanyetik probu ile çarpışan, onun rahatlama kez darlığı.) Geleneksel olarak, bu tür deneyler, düşük çözünürlüklü, küçük hayvanlar görüntüleme için milimetre çaplı ESR ile yürütülmektedir. Burada da küçük canlı örneklerin incelenmesi için ESR görüntüleme mikron ölçeğinde yapılmalıdır nasıl göstermektedir. ESR mikro görüntüleme, oda sıcaklığında 2 1 mikron yaklaşan bir çözünürlük ile mekansal çözüme ESR sinyalleri toplanmasını sağlayan nispeten yeni bir metodoloji . Bu protokol kağıt ana amacı, bu yeni yöntem, yeni geliştirilen oksijen duyarlı problar ile birlikte, küçük canlı örneklerinde oksijen düzeyleri haritalama uygulanabilir nasıl göstermektir. Mekansal çözünürlükte ~ 30 x 30 x 100 mikron yakın mikromolar oksijen konsantrasyonu duyarlılık ve voksel başına alt femtomole mutlak oksijen hassasiyeti göstermiştir. ESR mikro görüntüleme kullanımı hücrelerin yakın oksijen haritalama için mikro elektrotlar veya fosforesans / floresan dayalı mevcut teknikleri tamamlar. Ayrıca, uygun paramanyetik probu ile, aynı zamanda hücre içi oksijen mikro-görüntüleme, diğer yöntemlerle elde etmek için çok zor bir yeteneği kolayca uygulanabilir olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping at JoVE.com

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Bu protokol, elektron spin rezonans mikroskobu ile canlı hücreler hemen ortamda oksijen konsantrasyonu mikron ölçekli üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanır.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Görüntüleme.  The Technion, Israel Institute of Technology. Bu protokol, elektron spin rezonans mikroskobu ile canlı hücreler hemen ortamda oksijen konsantrasyonu mikron ölçekli üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanır.

Video: Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biyoloji

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IX'a Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

ÇiftLeşme Bal Arısı Kraliçeleri için Tarımsal Kimyasal Riskin Değerlendirilmesi

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...