Bu protokol, spektral odaklamalı SRS mikroskobunun uygulanmasını ve optimizasyonunu ve gerçek zamanlı uyarılmış Raman histolojisi uygulamaları için nasıl kullanılabileceğini gösterecektir. Bu tekniğin temel avantajı, enstrümantasyon düzgün bir şekilde hizalandıktan sonra numunelerin işlenebilme hızıdır, çünkü SRS doku işleme ve boyama gerektirmez. Bu protokol sadece histoloji ile sınırlı değil, diğer SRS uygulamaları için de geçerlidir.
Bu tür uygulamalar arasında küçük moleküller, ilaçlar, hücreler ve dokular bulunur. Lazer ışını boyutunu başlangıç noktası olarak iki kat büyütmek için pompa ışını için bir çift akromatik lens takarak başlayın. 100 ve 200 milimetrelik bir lensi birbirinden yaklaşık 300 milimetreye yerleştirin.
Ardından pompa ışını her iki lensin ortasından hizalayın. Ardından, ışını bir metreden daha uzaktaki bir duvara doğru göndermek için ikinci lensten sonra bir ayna yerleştirin. Kirişi aynadan duvara bir IR kartı ile izleyin ve ışının boyutunun değişip değişmediğini kontrol edin.
Kiriş, mesafenin bir fonksiyonu olarak boyut olarak değişirse kirişi kolimasyona alın. Ayarlama için birkaç direksiyon aynası ile dikroik bir ayna takarak iki lazer ışınını birleştirin. Dikroik aynadan sonraki ışınları yaklaşık bir metre uzaklıktaki iki farklı konumda izleyerek pompanın ve Stokes'un uzamsal örtüşmesini optimize edin.
Stokes kirişini pompa kirişi ile hizalamak için direksiyon aynasını ve ardından dikroik aynayı yinelemeli olarak ayarlayın. Tarama aynaları park edilmiş konumdayken bir çift direksiyon aynasını ayarlayarak kombine ışınların lazer tarama mikroskobunun tarama aynalarının merkezine gönderildiğinden emin olun. Kondenserden sonra, iletilen ışını fotodiyota iletmek için sırasıyla 100 milimetre ve 30 milimetre odak uzaklığına sahip başka bir lens çifti kullanın ve her iki ışının da fotodiyot içinde yer almasını sağlayın.
Ardından, modüle edilmiş Stokes ışınını engellemek için iki alçak geçirgen filtre takın. Işının% 10'unu almak için Stokes ışın yoluna bir ışın örnekleyici yerleştirin ve 80 megahertz darbe trenini algılamak için hızlı bir fotodiyota gönderin. Yayma tamponunun çıkışlarından birini alın ve 20 megahertz sinüzoidal dalga elde etmek için bir bant geçiş filtresi ile filtreleyin.
Ardından, çıkış tepe noktasından tepe voltajına yaklaşık 500 milivolta ayarlamak için bir RF zayıflatıcı kullanın. Elde edilen çıkışı, RF fazının bir voltaj kaynağıyla hassas bir şekilde ayarlanmasını sağlayan bir faz değiştiriciye gönderin. Bu çıkışı bir RF güç amplifikatörüne gönderin ve amplifikatörün çıkışını EOM'ye bağlayın.
Stokes ışınının blokajını açtıktan sonra, ışın yoluna bir fotodiyot yerleştirerek ilk EOM'nin modülasyon derinliğini optimize edin. Modülasyon derinliği tatmin edici görünene kadar EOM voltajını ve çeyrek dalga plakasını ayarlayın. Lazer ışınını algılamak için dikroik aynadan sonra bir fotodiyot yerleştirin.
Önce Stokes ışınını bloke edin, ardından osiloskop üzerindeki pompa darbe piklerinden birini yakınlaştırın. Osiloskop ile bu zirvenin zamansal konumunu işaretlemek için dikey bir imleç yerleştirin. Şimdi pompa kirişini bloke edin ve Stokes kirişinin blokajını kaldırın.
Osiloskop üzerindeki tepe konumlarını geçici olarak önceki adımda işaretlenmiş konumla eşleştirmek için gecikme aşamasını çevirin. İki kirişi eşleştirmek için gereken gecikme mesafesini hesaplayarak, ardından daha hızlı kirişin kiriş yolunu uzatarak veya daha yavaş kirişin kiriş yolunu kısaltarak. Daha sonra, numuneyi slayt ve bir kapak kayması arasında tutmak için DMSO ve çift taraflı bant ile bir ara parça olarak bir mikroskop slayt örneği hazırlayın.
Numuneyi, kapak kayması tarafı mikroskop hedefine bakacak şekilde mikroskop üzerine yerleştirin ve numuneyi parlak alan aydınlatması altında I parçasından gözlemleyin. Cam bant arayüzündeki hava kabarcıklarının hem üst hem de alt katmanında numunenin odağını bulun, ardından odağı bandın iki katmanı arasında olacak şekilde hareket ettirin. Daha sonra ayarlanabilir ışın çıkışını 798 nanometreye ayarlayın.
Kondenserin optik çıkışına bağlı olarak, optik gücü pompa ve Stokes ışınları için objektif odakta her biri yaklaşık 40 miliwatt olacak şekilde ayarlayın. Ardından MATLAB'da tarama görüntüsünü açın ve taramaya başlamak için focus etiketli düğmeye tıklayın. DC sinyalini kanal bir ekranda ortalamak için galvo tarayıcıdan önce direksiyon aynasını ayarlayın.
Motorlu gecikme aşamasını hareket ettirin ve kanal iki ekranında gösterilen kilitleme çıkışını yakından izleyin. Son olarak, AC sinyal yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için zaman gecikmesini ayarlayın. Dikroik aynayı, SRS sinyalini AC kanalında ortalayacak şekilde ayarlayın.
Ardından, sinyali en üst düzeye çıkarmak için kilitli amplifikatörün fazını ayarlayın. Numuneyi mikroskopa monte ettikten ve her iki ışının gücünü daha önce gösterildiği gibi numune odağında her biri yaklaşık 40 miliwatt'a ayarladıktan sonra. MATLAB'dan tarama görüntüsünü açın.
Ardından, DMSO'nun 2.913 ters santimetre Raman zirvesine karşılık gelen gecikme aşamasını tarayarak maksimum SRS sinyalini bulun. DMSO'nun 2.913 ters santimetre Raman zirvesine karşılık gelen bir SRS görüntüsü elde edin. Görüntüyü ImageJ'de açın ve çerçevenin ortasında küçük bir alan seçin.
Seçilen alandaki değerlerin ortalama ve standart sapmasını hesaplamak için hesaplama işlevini kullanın. Frekans erişim kalibrasyonu için, DMSO'nun 2, 913 ve 2.994 ters santimetre Raman zirvelerini kapsayan gecikme aşaması aralığıyla hiperspektral bir tarama kaydedin. Ardından, hiperspektral veri kümesine karşılık gelen sahne alanı konumlarını kaydedin.
Sahne alanı konumları için doğrusal regresyon gerçekleştirin ve Raman 2, 913 ve 2.994 ters santimetrede kayıyor. Doğrusal regresyon denklemini kullanarak, gecikme konumlarını karşılık gelen Raman frekanslarına dönüştürün. Spektral çözünürlüğün kalibrasyonu için, çubukların yerleştirilmesi nedeniyle artan optik yol uzunluğu ile önceki konuma göre aşama konumunu tahmin edin.
Cam çubuklar eklendiğinde kirişin hafif sapması nedeniyle kirişlerin uzamsal örtüşmesini yeniden hizalayın. İlk EOM'den sonra ıslatma ışını yoluna polarize edici bir ışın ayırıcı, çeyrek dalga plakası ve ikinci bir EOM takın. Sinyal girişini ikinci EOM'ye çıkarın, ardından sinyal girişini ilk EOM'ye takın ve açın.
Stokes ışınını ilk EOM'den geçirerek 20 megahertz'de modüle edin. Işının EOM kristali boyunca ortalandığından emin olmak için ilk EOM'nin eğimini ve konumunu ayarlayın. Çift taraflı bant, mikroskop slayt ve kapak camı ile bir doku slayt örneği hazırlayın.
Numuneyi, kapak kayması tarafı mikroskop hedefine bakacak şekilde mikroskop üzerine yerleştirin. Epi-mod SRS görüntüleme için, mikroskopa giren ışının polarizasyonunu değiştirmek için ışın mikroskopa girmeden önce yarım dalga plakası takın. Depolarize edilmiş geri yansıyan ışının dedektöre ulaşmasına izin vermek için hedefin üzerine polarize edici bir ışın ayırıcı yerleştirin.
Ardından, arka dağınık fotonları hedefin arka diyafram açıklığından fotoğraf dedektörüne aktarmak için 75 milimetrelik bir akromat lens ve 30 milimetrelik asferik lens kullanın. Polarize edici ışın ayırıcı tarafından yönlendirilen arkaya dağılmış ışığı toplamak için dedektörü monte edin. Ardından, modüle edilmiş ışının dedektöre girmesini engellemek için bir filtre takın.
Çubuk uzunluklarının değiştirilmesi spektral çözünürlüğü etkiler. Cam cıvıl cıvıl çubuklar kullanılmadığında, DMSO'dan gelen iki Raman zirvesi hiç çözülmez. Cam cıvıl cıvıl çubukların sayısındaki artış, iki tepeyi tatmin edici bir noktada çözmeye başlar.
Eşleşen cıvıltı her iki tepe noktasını da çözer ve sahne pozisyonlarını frekansa göre kalibre etmek için kullanılabilir. DMSO spektrumlarını görüntülemek için kullanılan iki kez gecikmiş ortogonal polarizasyon darbe treni, kabul edilebilir modülasyon derinliği ve zamansal ayırma ile SRS uyarımları arasındaki zaman gecikmesini gösterir. Buna karşılık, zayıf iki renkli SRS faz kayması, ters çevrilmiş veya negatif zirvelere yol açar.
Burada ex vivo fare beyin dokusunun 2, 850 ve 2.930 ters santimetresinde gerçek zamanlı iki renkli SRS görüntüleme gösterilmektedir. Ham lipit ve protein görüntüleri, lipit ve protein katkılarını gösteren tek bir görüntü üretmek için renk kodluydu. Patolojik uygulamalar için hematoksilin ve eozin boyamasını taklit etmek için yanlış hematoksilin ve eozin yeniden renklendirme de yapıldı.
Uzamsal zamansal örtüşme ve uzamsal çözünürlük optimizasyonu, SRS'nin uzamsal odaklanma yaklaşımı için en önemli adımlardır. Bu yöntem genellikle geçici absorpsiyon mikroskobu gibi diğer pompa probu mikroskopi deneyleri için geçerlidir. Yöntem ayrıca hücrelerde ve dokularda floresan olmayan moleküllerin görüntülenmesine izin verir.
Burada sunulan yöntem, klinikte uyarılmış Raman histolojisinin gelecekteki çevirisi için görüntü elde etme süresini hızlandırmaktadır.
