Biz Michael Reth, Hermann Schägger ve Margarita Camacho-Carvajal bilimsel destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BIOS&#39;ları Bundesministerium für Bildung ve Forschung (BMBF) FORSYS tarafından finanse edilen ve Alman Federal ve Eyalet Hükümetleri Mükemmellik Girişimi (GSC-4, Spemann Enstitüsü tarafından desteklenen .)

<ol>
	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells.">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li><li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li><li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li></ol>

Bu çalışmada, biz MPCs BN-PAGE ile analizi açıklanmaktadır. 2D bir yaklaşım doğal koşullar altında ilk ayrı MPCs kullanılır ve daha sonra ikinci bir boyut SDS-PAGE ile onları kendi içerisinde münferit bileşenlerine ait bölümlere ayrılması için. Örnekleri hücre lizatları hazırlanmıştır. Birçok MPCs çözünürleştirme için, uygun bir deterjan protein komplekslerinin yapısını korur ihtiyaç vardır. Burada,% 0.1 Triton X-100 kullanın. Ancak, en iyi deterjan ve uygun konsantrasyonda her MPC için deneysel olarak belirlenmelidir. Durumunda Triton X-100, örneğin, düşük deterjan konsantrasyonları F 1 dimerik formu kimlik izin verdiği rapor edilmiştir F 0-ATPaz kompleksi (Arnold, Pfeiffer ve ark 1998). Yüksek Triton X-100 konsantrasyonları Ancak, dimer ayrışma ve monomerik F 1 F 0-ATPaz kompleksi karşılık gelen bir artış yol. Yüksek konsantrasyon veya başka bir deterjan kullanımı digitonin sonuçları denilen oysa bizim eski çalışmalar doğrultusunda, düşük konsantrasyonlarda Brij 96 ile ekstrakte multivalent T-hücre reseptör kompleksi (TCR) korunmuş olduğunu gösterir edildi monomerik TCR çıkarımı (Schamel, Arechaga ve ark 2005). Yaygın olarak kullanılan deterjan test edilebilir digitonin (% 0.5 ila% 1), Triton X-100 (% 0.1 ila% 0,5), Brij 96 (% 0.1 ila% 0,5), ya da dodecylmaltoside (% 0.1 ila% 0,5) içermektedir. Bu reaktifler, noniyonik deterjan, MPC istikrar için en iyi olma eğilimindedir. SDS ve diğer güçlü deterjanlar ile temas (Camacho Carvajal, Wollscheid ve ark 2004) kaçınılması gerektiğini farkında olun. Diyaliz lizatları BN-jel MPC ayırma (Camacho-Carvajal, Wollscheid ve ark 2004) ulaşmak için gerekli; (Heiss, Junkes ve ark 2005). Bu, tuz konsantrasyonu veya düşük molekül ağırlıklı kirliliklerin kaldırılması ayar yüksek çözünürlük için çok önemli olduğunu görünüyor. Immunopurified ve daha sonra antikor yıkandı, membran hazırlıklar ve MPCs, BN-PAGE için uygundur (Swamy, Siegers ve ark 2006) dikkat çekicidir. Her iki durumda da, örnekler membran lizis veya elüsyon BN-lizis tamponu yürütülen ise, BN-PAGE ayrılması için diyalize zorunda değilsiniz. BN-PAGE ile protein ayırma için, boya Coomassie mavi unspecifically proteinlerine bağlanır ve onları olumsuz ücretleri kapsayan ihtiyaç vardır. Böylece, Coomassie mavi nötr pH (Schägger ve von Jagow 1991) katot doğru proteinlerin elektroforetik mobilite sağlar; (Schägger, Cramer ve ark 1994). Ayrıca, Coomassie mavi yığın jel elektroforez sırasında protein agregasyonunu önler. BN-PAGE, Coomassie G250 Coomassie mavi R250 veya kolloidal Coomassie mavi yerine kullanılmalıdır. BN-jel çalıştırmadan önce, jel yüzde PPK faiz beklenen boyutuna uygun olduğundan emin olmak için gereklidir. BN-jeller Prekast farklı gradyanlar ve uygun tamponlar Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Jel Sistemi) temin edebilirsiniz. Ancak, BN-jeller de bir persistaltic pompa ile birlikte bir degrade mikser kullanılarak hazırlanmış olabilir. Sağlam bir degrade garanti etmek için, sıvı dökme ve kabarcıkları kaçınmak olmalıdır sırasında sürekli akmalıdır. Aşırı yükleme elektroforez işlemi sırasında protein yağış yol açabilir, çünkü jel üzerine farklı numune dilüsyonları yükleme tavsiye ederiz. Buna ek olarak, BN-jeller 4 çalıştırmak olmalıdır ° C proteini bozulmasını önlemek için ve MPCs sağlam tutmak için. MPCs BN-PAGE, görselleştirme Coomassie parlak mavi boyama, gümüş boyama veya immunoblotting elde edilebilir sonra. Coomassie veya gümüş boyama ile görüntülendi protein bantları kütle spektrometresi (Camacho Carvajal, Wollscheid ve ark 2004) tarafından daha fazla analiz için uygundur. Immunoblotting durumunda, ilgi MPCs için en iyi transferi koşulları deneysel olarak belirlenmelidir. Coomassie mavi BN-jel blot sırasında da transfer olduğunu farkında olun. Bu nedenle, membran mavi bir renk uygulamayın ise jel, başarılı transferinden sonra renksiz olacak. Ayrıca, SDS-PAGE sonra tespiti için çalışan her primer antikor, BN-PAGE üzerine immunoblotting için geçerli olduğunu söylemek çok önemlidir. Bu onların epitop proteinlerin doğal yapısındaki gizli olduğu için antikorlar ilgi MPC görmezsek bu gerçekleşebilir. Bu sorunu aşmak için, BN-jel içinde transfer etmek için önce kısa bir süre jel 1x SDS numune tamponu kaynatarak proteinler denatüre mümkündür. Bizim örneğimizde, protein bantları tespit doğrudan BN-jel tabi değildi. Bunun yerine, daha ikinci bir dimensi BN-PAGE ayrılmış lizat bölünmüşSDS-PAGE. Monomerik proteinler SDS-jel ikinci boyutu, ikinci boyut (Camacho Carvajal, Wollscheid ve ark, 2004) ilk ve doğrusal jel gradient jel nedeniyle bir hiperbolik çapraz içinde göç ederler. Bu hiperbolik çapraz altında lokalize olduğundan bu MPCs kolay kimlik sağlar. İkinci boyut SDS-PAGE bir dikey çizgi biri ayrı bir MPC Alt Bileşenleri ayrılır. Birkaç dinstinct MPCs bileşenleri Bileşenleri MPC büyüklüğüne göre yatay bir çizgi üzerinde tespit edilebilir. Ancak, tek bir dikey çizgi görünen birçok protein noktalar da BN-SAYFA aynı pozisyonda göç eden ayrı bir kompleksleri parçası olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Aynı MPC mevcut olduğunu son kanıtı, antikor bazlı bir jel vardiya yöntemi ile elde edilebilir. Bu testte, hücresel lizat biri BN-SAYFA önce belirlenen noktalar tarafından temsil edilen bir protein karşı bir antikor ile inkübe edilir. Bu sonuçlar ilk boyut daha yüksek bir moleküler kütlesi doğru bu protein içeren tüm MPCs bir kayma. Bu MPCs bir parçası olan diğer proteinleri bu karmaşık özel bir değişime ve bu nedenle ikinci boyut SDS-jel tanımlamak daha kolay olacaktır. Sadece MPCs bileşimi BN-PAGE ile analiz aynı zamanda kendi stokiyometri belirlenmesi mümkündür (Schamel ve Reth 2000) olabilir; (Schamel 2001), (Swamy, Minguet ve ark 2007). Bu amaçla, bir NAMOS assay (yerli antikor bazlı hareketlilik kayma yöntemi) yapılabilir. Antikor bazlı jel kayma yöntemi olduğu gibi, hücresel lizatları altbirim-spesifik monoklonal antikorlar ile inkübe edilir. Bu MPCs stokiyometri vardiya ölçüde çıkarım izin BN-jel elektroforetik immunoshifts indüksiyonu yol açar Conlusion, BN-PAGE boyutu, kompozisyonu, gibi göreceli bolluk MPCs tanımlanması ve belirlenmesi için uygundur. NAMOS tahlil olarak yapılır, o da belirli bir MPC stokiyometri belirlemek için imkanı sunar. Genel uygulanabilirliği göz önüne alındığında, bu tekniğin MPCs karakterizasyonu (Dekker, Müller ve ark 1996) için çok yararlı bir araç, (2008 Wittig ve Schagger) (Wagner, Rehling ve ark 2009); (Wittig ve Schägger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

En proteinleri diğer proteinler ile fonksiyonel veya düzenleyici kompleksleri (Sali, Glaeser ve ark 2003) bulunabilir Multiprotein kompleksleri (MPCs), hücre sinyal çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, protein-protein etkileşim ağlarının çalışma, protein düzenleme fonksiyonu ve entegre bir anlayış kazanmak için MPCs detaylı karakterizasyonu gerektirir. Tanımlanması ve analizi için, MPCs yerli koşullar altında ayrılmalıdır. Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) MPCs analizi açıklanmaktadır. BN-PAGE jel filtrasyon veya sakkaroz yoğunluğu Ultrasantrifügasyon tarafından sunulan daha yüksek bir çözünürlüğe sahip bir doğal yapısındaki MPCs ayrılması sağlar ve MPC boyutu, kompozisyon ve göreceli bolluk (Schägger ve von Jagow 1991) belirlemek için bu nedenle yararlı bir tekniktir. (Schägger, Cramer ve ark 1994). Bu yöntemle, proteinler, hidrodinamik bir poliakrilamid matris boyutu ve şekli göre ayrılır. Burada, lizat diyaliz BN-PAGE bu biyolojik örnekler için geçerli hale getirmek için önemli bir adım olduğuna işaret ederek, toplam hücresel lizatları MPCs analiz göstermektedir. Birinci boyut, BN ve ikinci boyut SDS-PAGE bir kombinasyonunu kullanarak, BN-PAGE ile ayrılmış MPCs SDS-PAGE ile daha fazla bireysel bileşenlerinin içine alt edilebilir olduğunu göstermektedir. Jel ayrılması üzerine MPC bileşenleri Görselleştirme standart immunoblotting tarafından yapılır. PPK BN-PAGE ile analiz için bir örnek olarak, iyi karakterize ökaryotik 19S, 20S, ve 26S protozomları seçti.

Watch this Scientific Journal Video about Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates at JoVE.com

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

blue-native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-bn-page-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

130.2K Görüntüleme.  University of Freiburg. Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.