Agradecemos a Michael Reth, Hermann Schägger, e Margarita Camacho-Carvajal ao apoio científico. Este trabalho foi financiado pela Forsys do fuer Bundesministerium Bildung e Forschung (BMBF), pela BIOS do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), e apoiado em parte pela Iniciativa de Excelência dos Governos Federal e Estadual alemães (GSC-4, Spemann Graduate School ).

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	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells.">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li><li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li><li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste estudo, descrevemos a análise do PPM pelo BN-PAGE. Uma abordagem 2D é usada para separar primeiro PPM em condições nativas e, depois, subdividir-los em seus componentes individuais, uma segunda dimensão SDS-PAGE. As amostras são preparadas a partir de lisados ​​celulares. Para a solubilização do PPM muitos, um detergente apropriado é necessário, que preserva a estrutura dos complexos de proteína. Aqui, usamos 0,1% Triton X-100. No entanto, o detergente ideal e adequada a sua concentração tem que ser determinado empiricamente para cada MPC. Em caso de Triton X-100, por exemplo, foi relatado que as concentrações de detergente permitir a identificação de uma forma dimérica da F 1 F 0-ATPase complexos (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Maior Triton X-100 concentrações, no entanto, levam à dissociação do dímero e um aumento correspondente do monomérica F 1 F 0-ATPase complexo. Isto está de acordo com um dos nossos estudos anteriores, nós mostramos que foram o complexo receptor de células T multivalentes (TCR) é preservada quando extraído com baixas concentrações de Brij 96, enquanto que o uso de maior concentração ou de outro detergente chamado resultados digitonina em a extração de monomérica TCR (Schamel, Aréchaga et al. 2005). Detergentes comumente usados ​​que podem ser testados incluem digitonina (0,5 a 1%), Triton X-100 (0,1 a 0,5%), Brij 96 (0,1 a 0,5%), ou dodecylmaltoside (0,1 a 0,5%). Estes reagentes são os detergentes não-iônico, que tendem a ser melhor para a estabilidade MPC. Esteja ciente de que o contato com SDS e outros detergentes fortes devem ser evitados (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Diálise do lisados ​​é necessário para alcançar MPC separação em um BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004).; (Heiss, Junkes et al 2005).. Parece que o ajuste da concentração de sal ou a remoção de impurezas de baixo peso molecular é crucial em alta resolução. Vale ressaltar que também preparações de membrana e PPM, que têm sido immunopurified e, posteriormente, eluída da anticorpos, são adequados para BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). Em ambos os casos, as amostras não precisam ser dialisado para BN-PAGE separação, se lise de membranas ou de eluição é realizada em BN lise-buffer. Para a separação de proteínas por BN-PAGE, o corante Coomassie blue é necessário, que se liga a proteínas não específica e cobre-os com cargas negativas. Assim, Coomassie blue permite a mobilidade eletroforética de proteínas para o catodo de pH neutro (Schägger e von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al 1994).. Além disso, Coomassie blue previne a agregação de proteínas no gel de empilhamento durante a eletroforese. Para BN-PAGE, Coomassie G250 tem que ser usado em vez de azul Coomassie R250 ou blues Coomassie coloidal. Antes de executar um BN-gel, é necessário para garantir que a percentagem de gel se adapta ao tamanho esperado do MPC de interesse. Pré-moldado BN-géis com gradientes diferentes e buffers adequados estão disponíveis comercialmente a partir Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Sistema Gel). Mas BN-gel também pode ser preparado usando um misturador de gradiente, juntamente com uma bomba persistaltic. Para garantir um gradiente intactos, o líquido deve fluir constantemente durante o vazamento e bolhas devem ser evitadas. Recomendamos o carregamento de diferentes diluições de amostras no gel, pois a sobrecarga pode levar à precipitação de proteínas durante o processo de eletroforese. Além disso, BN-gel deve ser executado a 4 ° C para prevenir a degradação de proteínas e para manter o PPM intacta. Depois BN-PAGE visualização, de PPM pode ser alcançado por Coomassie coloração azul brilhante, coloração pela prata ou immunoblotting. Bandas de proteínas visualizados através da coloração Coomassie ou prata são adequados para posterior análise por espectrometria de massa (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Em caso de immunoblotting, as condições de transferência ideal para o PPM de juros têm de ser determinadas empiricamente. Estar ciente de que Coomassie azul também é transferida durante blotting de um BN-gel. Portanto, o gel vai ser incolor após a transferência bem-sucedida, ao passo que a membrana irá exercer uma cor azul. Além disso, é importante mencionar que não todos os anticorpos primários, que trabalha para detecção após SDS-PAGE, é aplicável a immunoblotting sobre BN-PAGE. Pode acontecer que os anticorpos não reconhecem o MPC de interesse porque o seu epítopo está escondido na conformação nativa das proteínas. Para ultrapassar este problema, é possível para desnaturar as proteínas dentro da BN-gel antes da transferência fervendo o gel em breve no 1x tampão de amostra SDS. No nosso exemplo, não submeta o BN-gel diretamente para a detecção de bandas de proteínas. Em vez disso, nós ainda dividiu o BN-PAGE-lisado separados por um segundo dimensiem SDS-PAGE. Na segunda dimensão SDS-gel, as proteínas monoméricas migrar dentro de uma diagonal hiperbólica devido ao gradiente de gel no primeiro e no gel linear na segunda dimensão (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Isto permite a fácil identificação de PPM, uma vez que estão localizados abaixo dessa diagonal hiperbólica. Subcomponentes de um MPC distintos são separados em uma linha vertical na segunda dimensão SDS-PAGE. Componentes que são constituintes do PPM dinstinct vários podem ser identificados em uma linha horizontal de acordo com o tamanho do MPC. No entanto, ele tem que se considerar que vários spots de proteínas que aparecem em uma linha vertical também poderia ser parte de complexos separados que migram na mesma posição em BN-PAGE. A prova final de que eles estão presentes no MPC mesmo pode ser obtido por um ensaio de alteração baseados em anticorpos gel. Neste ensaio, lisado celular é incubada com um anticorpo contra uma proteína representado por um dos pontos identificados antes da BN-PAGE. Isso resulta em uma mudança de todos os PPM que contêm essa proteína para uma maior massa molecular na primeira dimensão. Outras proteínas que são também uma parte destes PPM vai sofrer essa mudança complexos específicos e por isso são fáceis de identificar na segunda dimensão SDS-gel. Não só a composição do PPM podem ser analisados ​​por BN-PAGE, mas também a determinação de sua estequiometria é possível (e Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007).. Para este fim, um ensaio Namos (nativo baseadas em anticorpos, ensaio de mobilidade shift) pode ser realizada. Como no ensaio de mudança baseadas em anticorpos, gel, os lisados ​​celulares são incubados com anticorpos monoclonais subunidade anticorpos específicos. Isto leva à indução de immunoshifts eletroforética em gel-BN, que permitem a inferência da extensão da mudança na estequiometria do PPM Em conlusion, BN-PAGE é adequado para a identificação de PPM ea determinação de sua composição, tamanho, bem como abundância relativa. Realizada como um ensaio Namos, ela também oferece a possibilidade de determinar a estequiometria de uma MPC certos. Dada a sua aplicabilidade geral, esta técnica é uma ferramenta muito útil para a caracterização de PPM (Dekker, Müller et al 1996).; (Wittig e Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al 2009.); (Wittig e Schägger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

Complexos multiprotein (PPM) desempenham um papel crucial na sinalização celular, já que a maioria das proteínas podem ser encontradas em complexos funcionais ou de regulamentação com outras proteínas (Sali, Glaeser et al. 2003). Assim, o estudo das redes de interação proteína-proteína requer a caracterização detalhada do PPM para ganhar uma compreensão integrativa da função da proteína e regulação. Para a identificação e análise, PPM devem ser separados em condições nativas. Neste vídeo, descrevemos a análise do PPM por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). BN-PAGE é uma técnica que permite a separação de PPM em uma conformação nativa com uma resolução maior que o oferecido por filtração em gel ou ultracentrifugação de densidade de sacarose, e é, portanto, útil para determinar MPC tamanho, composição e abundância relativa (Schägger e von Jagow 1991) ; (Schägger, Cramer et al 1994).. Por este método, as proteínas são separadas de acordo com seu tamanho e forma hidrodinâmica em uma matriz de poliacrilamida. Aqui, demonstramos a análise do PPM do total lisados ​​celulares, apontando que a diálise lisado é o passo crucial para fazer BN-PAGE aplicável a estas amostras biológicas. Usando uma combinação de primeira dimensão BN e segunda dimensão SDS-PAGE, mostramos que PPM separados por BN-PAGE pode ser subdividida em seus componentes individuais por SDS-PAGE. Visualização dos componentes MPC sobre separação gel é realizada por immunoblotting padrão. Como um exemplo para MPC análise por BN-PAGE, que escolheu o 19S bem caracterizados eucarióticas, 20S, 26S e proteasomas.

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Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Neste vídeo, descrevemos a caracterização de complexos multiprotein (PPM) por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). Em uma primeira dimensão, dialisadas lisados ​​celulares são separados por BN-PAGE para identificar PPM individual. Em uma segunda dimensão SDS-PAGE, PPM de interesse são subdivididos para analisar os seus constituintes por immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

130.2K visualizações.  University of Freiburg. Neste vídeo, descrevemos a caracterização de complexos multiprotein (PPM) por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). Em uma primeira dimensão, dialisadas lisados ​​celulares são separados por BN-PAGE para identificar PPM individual. Em uma segunda dimensão SDS-PAGE, PPM de interesse são subdivididos para analisar os seus constituintes por immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados Celular