Ringraziamo Michael Reth, Hermann Schägger, e Margherita Camacho-Carvajal al sostegno scientifico. Questo lavoro è stato finanziato dalla FORSYS dal Bundesministerium für Bildung e Forschung (BMBF), dal BIOS dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), e sostenuta in parte dal Iniziativa eccellenza dei governi tedesco e Stato (GSC-4, Spemann Graduate School ).

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	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells.">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li><li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li><li>Schägger, H., Cramer, W. 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Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo studio, descriviamo l&#39;analisi di PPM da BN-PAGE. Un approccio 2D viene utilizzato al primo PPM separare in condizioni native, e poi ulteriormente suddividere nelle loro componenti singoli da una seconda dimensione SDS-PAGE. I campioni sono preparati con lisati cellulari. Per la solubilizzazione di PPM molti, un detergente appropriata è indispensabile, che conserva la struttura dei complessi proteici. Qui, usiamo 0,1% Triton X-100. Tuttavia, il detergente ottimale e la sua concentrazione adatta devono essere determinate empiricamente per ogni MPC. In caso di Triton X-100, per esempio, è stato riportato che le concentrazioni di detergenti a basso permettono l&#39;identificazione di una forma dimerica della F 1 F 0-ATPasi complesso (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Superiore Triton X-100 concentrazioni, tuttavia, portano alla dissociazione del dimero e ad un corrispondente aumento del monomerico F 1 F 0-ATPasi complesso. Ciò è in linea con uno dei nostri studi precedenti, sono stati dimostriamo che il polivalente cellule T complesso recettore (TCR) viene conservato quando estratto con basse concentrazioni di Brij 96, mentre l&#39;uso di una maggiore concentrazione o di un altro detergente chiamato digitonina risultati in l&#39;estrazione di monomerico TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). Detergenti comunemente usati che possono essere testati includono digitonina (da 0,5 a 1%), Triton X-100 (da 0,1 a 0,5%), Brij 96 (da 0,1 a 0,5%), o dodecylmaltoside (0,1 allo 0,5%). Questi reagenti sono detergenti non ionici, che tendono ad essere migliori per la stabilità MPC. Essere consapevoli del fatto che il contatto con SDS e altri detergenti aggressivi deve essere evitato (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Dialisi del lisati è necessario per realizzare la separazione MPC in una BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004.), (Heiss, Junkes et al 2005).. Sembra che la regolazione della concentrazione di sale o la rimozione delle impurità a basso peso molecolare è di fondamentale importanza per alta risoluzione. È interessante notare che anche le preparazioni di membrana e PPM, che sono stati immunopurified e poi eluito dalla anticorpi, sono adatti per BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). In entrambi i casi, i campioni non devono essere dializzati per BN-PAGE la separazione, se lisi membrana o eluizione viene effettuata in BN-lisi buffer. Per la separazione delle proteine ​​da BN-PAGE, il colorante Coomassie blu è necessario, che si lega alle proteine ​​unspecifically e li copre con cariche negative. In tal modo, Coomassie blu consente la mobilità elettroforetica delle proteine ​​verso il catodo a pH neutro (Schägger e von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al 1994).. Inoltre, Coomassie blu impedisce l&#39;aggregazione delle proteine ​​nel gel di impilamento durante l&#39;elettroforesi. Per BN-PAGE, Coomassie G250 deve essere usato al posto di Coomassie R250 blu o blu Coomassie colloidale. Prima di eseguire una BN-gel, è necessario garantire che la percentuale di gel si adatta alla dimensione prevista del MPC di interesse. Prefabbricati BN-gel con pendenze diverse e tamponi adatti sono disponibili in commercio da Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Ma BN-gel può anche essere preparata usando un gradiente mixer insieme con una pompa persistaltic. Per garantire un gradiente intatto, il liquido deve fluire costantemente durante il getto e le bolle dovrebbero essere evitati. Si consiglia il caricamento di diverse diluizioni del campione sul gel perché sovraccarico può portare alla precipitazione delle proteine ​​durante il processo di elettroforesi. Inoltre, BN-gel dovrebbe essere eseguito a 4 ° C per evitare la degradazione delle proteine ​​e di mantenere intatto il PPM. Dopo BN-PAGE, la visualizzazione di MPC può essere raggiunto con la colorazione Coomassie blu brillante, colorazione argento o immunoblotting. Bande proteiche visualizzate mediante colorazione Coomassie o argento sono adatti per ulteriori analisi mediante spettrometria di massa (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). In caso di immunoblotting, le condizioni di trasferimento ottimale per i PPM di interesse devono essere determinati empiricamente. Essere consapevoli del fatto che Coomassie blu è anche trasferito durante assorbente di una BN-gel. Pertanto, il gel sarà incolore dopo il trasferimento di successo, mentre la membrana in grado di esercitare un colore blu. Inoltre, è importante ricordare che non tutti gli anticorpi primari, che lavora per il rilevamento dopo SDS-PAGE, è applicabile a immunoblotting su BN-PAGE. Può succedere che gli anticorpi non riconoscono il MPC di interesse perché la loro epitopo è nascosto nella conformazione nativa delle proteine. Per superare questo problema, è possibile denaturare le proteine ​​all&#39;interno della BN-gel prima del trasferimento facendo bollire il gel a breve nella tampone 1x campione SDS. Nel nostro esempio, noi non sottoporre il BN-gel direttamente al rilevamento di bande proteiche. Invece, abbiamo ulteriormente diviso il BN-PAGE-lisato separati da un secondo dimensisu SDS-PAGE. Nella seconda dimensione SDS-gel, proteine ​​monomeriche migrare all&#39;interno di un diagonale iperbolica a causa del gradiente di gel nel primo e il gel lineare nella seconda dimensione (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Questo permette la facile identificazione dei PPM, dal momento che sono localizzati sotto questa diagonale iperbolica. Sottocomponenti di un distinto MPC sono separati in una linea verticale nella seconda dimensione SDS-PAGE. I componenti che rientrano nella composizione di PPM dinstinct diverse possono essere identificati su una linea orizzontale a seconda delle dimensioni del MPC. Tuttavia, è da considerare che gli spot di proteine ​​diverse che appare in una linea verticale potrebbe anche far parte di complessi separati che migrano nella stessa posizione in BN-PAGE. La prova finale che sono presenti nello stesso MPC può essere ottenuta con un anticorpo saggio basato su gel shift. In questo saggio, lisato cellulare viene incubato con un anticorpo contro una proteina rappresentata da uno dei luoghi individuati prima BN-PAGE. Ciò si traduce in uno spostamento di tutti i PPM che contengono questa proteina verso una massa molecolare maggiore nella prima dimensione. Altre proteine ​​che sono anche una parte di questi PPM subirà questo complesso specifico turno e sono quindi facili da identificare nella seconda dimensione SDS-gel. Non solo la composizione del MPC può essere analizzato BN-PAGE, ma anche la determinazione della loro stechiometria è possibile (e Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007).. A tal fine, un test Namos (nativo a base di anticorpi mobilità-shift test) può essere eseguita. Come nel anticorpi saggio basato su gel di turno, il lisati cellulari vengono incubati con subunità monoclonali specifici anticorpi. Questo porta a l&#39;induzione di immunoshifts elettroforetici nel BN-gel, che consentono l&#39;inferenza dalla misura dello spostamento sulla stechiometria di PPM In conlusion, BN-PAGE è adatto per l&#39;identificazione di PPM e la determinazione della loro dimensione, composizione, così come l&#39;abbondanza relativa. Eseguito come un test Namos, offre anche la possibilità di determinare la stechiometria di un certo MPC. Data la sua applicabilità generale, questa tecnica è uno strumento molto utile per la caratterizzazione di PPM (Dekker, Müller et al 1996.) (Wittig e Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al 2009.) (Wittig e Schägger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

Complessi multiproteici (PPM) svolgono un ruolo cruciale nella segnalazione cellulare, poiché la maggior parte delle proteine ​​si trovano in complessi funzionali o di regolamentazione con altre proteine ​​(Sali, Glaeser et al. 2003). Così, lo studio della proteina-proteina reti di interazione richiede la caratterizzazione dettagliata dei PPM di acquisire una comprensione integrativa della funzione della proteina e della regolamentazione. Per l&#39;identificazione e l&#39;analisi, MPC deve essere separata in condizioni native. In questo video, si descrive l&#39;analisi di PPM di blu elettroforesi nativa su gel di poliacrilamide (BN-PAGE). BN-PAGE è una tecnica che permette la separazione di PPM in una conformazione nativa con una risoluzione superiore a quella offerta da gel filtrazione o la densità ultracentrifugazione saccarosio, ed è quindi utile per determinare la dimensione del MPC, la composizione e l&#39;abbondanza relativa (Schägger e von Jagow 1991) ; (Schägger, Cramer et al 1994).. Con questo metodo, le proteine ​​sono separate in base alle loro dimensioni e la forma idrodinamica in una matrice di poliacrilamide. Qui, dimostriamo l&#39;analisi di PPM del totale lisati cellulari, sottolineando che la dialisi lisato è il passo fondamentale per rendere BN-PAGE applicabili a questi campioni biologici. Usando una combinazione di prima dimensione BN-e seconda dimensione SDS-PAGE, dimostriamo che PPM separati da BN-PAGE può essere ulteriormente suddivisa in loro singoli costituenti mediante SDS-PAGE. Visualizzazione dei componenti MPC su gel di separazione viene effettuata mediante immunoblotting standard. Come esempio di analisi da MPC BN-PAGE, abbiamo scelto la 19S ben caratterizzati eucariotiche, 20S, 26S e proteasomi.

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Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In questo video, si descrive la caratterizzazione di complessi multiproteici (PPM) di blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (BN-PAGE). In una prima dimensione, dializzati lisati cellulari sono separati da BN-PAGE per identificare i singoli PPM. In una seconda dimensione SDS-PAGE, PPM di interesse sono ulteriormente suddivisi per analizzare i loro elettori mediante immunoblotting.

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

130.2K Views.  University of Freiburg. In questo video, si descrive la caratterizzazione di complessi multiproteici (PPM) di blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (BN-PAGE). In una prima dimensione, dializzati lisati cellulari sono separati da BN-PAGE per identificare i singoli PPM. In una seconda dimensione SDS-PAGE, PPM di interesse sono ulteriormente suddivisi per analizzare i loro elettori mediante immunoblotting.