Wir danken Michael Reth, Hermann Schägger und Margarita Camacho-Carvajal für die wissenschaftliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde von FORSYS vom Bundesministerium fuer Bildung und Forschung (BMBF) gefördert, durch BIOSS von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), und unterstützt zum Teil durch die Exzellenzinitiative der deutschen Bundesregierung und der Länder (GSC-4, Spemann Graduiertenschule ).

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	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells.">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li><li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li><li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li></ol>

In dieser Studie beschreiben wir die Analyse der PLM nach BN-PAGE. Ein 2D-Ansatz ist die erste eigenständige MPC unter nativen Bedingungen verwendet werden, und dann weiter zu unterteilen sie in ihre einzelnen Komponenten durch eine zweite Dimension SDS-PAGE. Die Proben werden aus Zelllysaten vorbereitet. Für die Solubilisierung von vielen Mittelmeer-Partnerländer, ist ein geeignetes Reinigungsmittel benötigt, die bewahrt die Struktur des Protein-Komplexen. Hier verwenden wir 0,1% Triton X-100. Allerdings haben die optimale Reinigungs-und ihrer geeigneten Konzentration empirisch für jeden MPC bestimmt werden. Im Falle von Triton X-100 zum Beispiel wurde berichtet, dass niedrige Detergenzkonzentrationen die Identifizierung einer dimeren Form des F 1 ermöglichen F 0-ATPase-Komplex (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Höhere Triton X-100-Konzentrationen, jedoch auf die Dissoziation des Dimers und zu einer entsprechenden Erhöhung der monomeren F 1 F 0-ATPase-Komplexes führen. Dies steht im Einklang mit einem unserer früheren Studien konnten wir zeigen, dass die multivalente T-Zell-Rezeptor-Komplex (TCR) erhalten bleibt, wenn sie mit geringen Konzentrationen von Brij 96 extrahiert, während die Verwendung von höheren Konzentrationen oder eines anderen Waschmittel genannt Digitonin Ergebnisse in die Gewinnung von monomerem TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). Häufig verwendete Reinigungsmittel, die getestet werden können, gehören Digitonin (0,5 bis 1%), Triton X-100 (0,1 bis 0,5%), Brij 96 (0,1 bis 0,5%), oder Dodecylmaltosid (0,1 bis 0,5%). Diese Reagenzien sind ionische Detergenzien, die am besten für MPC Stabilität neigen. Seien Sie sich bewusst, dass der Kontakt mit SDS und andere scharfe Reinigungsmittel sollten vermieden (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Dialyse der Lysate wird benötigt, um MPC Trennung in einem BN-Gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004). Erzielen; (Heiss, Junkes et al 2005).. Es scheint, dass die Einstellung der Salzkonzentration oder die Entfernung von Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht entscheidend für eine hohe Auflösung. Es ist bemerkenswert, dass auch Membran-Präparationen und MPC, die seit immunopurified haben und später aus dem Antikörper eluiert, geeignet für BN-PAGE werden (Swamy, Siegers et al. 2006). In beiden Fällen müssen die Proben nicht für BN-PAGE Trennung dialysiert werden, wenn Membran Lyse oder Elution erfolgt in BN-Lysepuffer durchgeführt. Für Protein Trennung durch BN-PAGE, wird der Farbstoff Coomassie-Blau benötigt, was bindet unspezifisch an Proteine ​​und bedeckt sie mit negativen Ladungen. Dadurch ermöglicht die Coomassie-Blau der elektrophoretischen Mobilität von Proteinen in Richtung der Kathode bei neutralem pH (Schägger und von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al 1994).. Darüber hinaus verhindert Coomassieblau Proteinaggregation in den Stapeln Gel während der Elektrophorese. Für BN-PAGE wurde Coomassie G250, um anstelle von Coomassie Blau R250 oder kolloidale Coomassie Blau verwendet werden. Bevor Sie eine BN-Gel, ist es notwendig, um sicherzustellen, dass der Anteil des Gels auf die erwartete Größe des MPC von Interesse passt. Vorgefertigte BN-Gele mit unterschiedlichen Steigungen und geeignete Puffer sind im Handel erhältlich von Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Aber BN-Gele können auch unter Verwendung eines Gradientenmischer zusammen mit einem persistaltic pumpen. Um zu gewährleisten, eine intakte Gradienten, sollte die Flüssigkeit fließen ständig während des Gießens und Blasen zu vermeiden. Wir empfehlen das Laden von verschiedenen Probenverdünnungen auf das Gel weil Überlastung kann zu Proteinfällung während der Elektrophorese-Verfahren führen. Darüber hinaus sollten BN-Gels bei 4 laufen ° C bis Proteinabbau zu verhindern und zu halten, den Mittelmeer-Partnerländern intakt. Nach BN-PAGE, Visualisierung der Mittelmeer-Partnerländer durch Coomassie Brilliant Blue-Färbung, Silberfärbung oder Immunoblotting erreicht werden. Proteinbanden sichtbar gemacht durch Coomassie-oder Silberfärbung sind für die weitere Analyse geeignet durch Massenspektrometrie (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Im Falle von Immunoblot, haben die optimale Übertragung Bedingungen für die Mittelmeer-Partnerländer von Interesse sind empirisch ermittelt werden. Seien Sie sich bewusst, dass Coomassie-Blau auch während Blotting einer BN-Gel übertragen. Daher wird das Gel nach dem erfolgreichen Transfer farblos, während die Membran eine blaue Farbe ausüben wird. Darüber hinaus ist es wichtig zu erwähnen, dass nicht jeder primärer Antikörper, die für den Nachweis nach SDS-PAGE arbeitet, für Immunoblot auf BN-PAGE ist. Es kann vorkommen, dass Antikörper erkennen nicht die MPC von Interesse, weil ihre Epitop in die native Konformation der Proteine ​​verborgen ist. Um dieses Problem zu überwinden, ist es möglich, die Proteine ​​innerhalb der BN-Gel vor der Übertragung durch Kochen denaturiert das Gel kurz in 1x SDS-Probenpuffer. In unserem Beispiel haben wir nicht unter dem BN-Gel direkt auf die Erfassung Proteinbanden. Stattdessen haben wir weiter unterteilt die BN-PAGE getrennt Lysat durch eine zweite dimensiauf SDS-PAGE. In der zweiten Dimension SDS-Gel, monomere Proteine ​​innerhalb einer hyperbolischen diagonal durch die Gradienten-Gel in der ersten und der linear-Gel in der zweiten Dimension (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004) zu migrieren. Dies ermöglicht die einfache Identifizierung der Mittelmeer-Partnerländer, da sie unterhalb dieser hyperbolischen Diagonale lokalisiert sind. Unterkomponenten einer deutlichen MPC sind in einer vertikalen Linie in der zweiten Dimension SDS-PAGE getrennt. Komponenten, die Bestandteile von mehreren dinstinct MPCs sind, können auf einer horizontalen Linie nach der Größe der MPC identifiziert werden. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass mehrere Proteinspots erscheinen in einer vertikalen Linie könnte auch ein Teil der getrennten Komplexen, die an der gleichen Position in BN-PAGE wandern werden. Der endgültige Beweis, dass sie in der gleichen MPC sind, können durch einen Antikörper-basierte Gel-Shift-Assay erhalten. In diesem Assay wird Zelllysat mit einem Antikörper gegen ein Protein, das von einem der identifizierten Spots vor der BN-PAGE vertreten inkubiert. Dies führt zu einer Verschiebung aller MPCs, dass dieses Protein enthalten, zu einem höheren Molekulargewicht in der ersten Dimension. Andere Proteine, die auch ein Teil dieser MPCs wird durchlaufen diese komplexe spezifische Schicht und sind deshalb leicht in die zweite Dimension SDS-Gel zu identifizieren. Nicht nur die Zusammensetzung der Mittelmeer-Partnerländer durch BN-PAGE analysiert werden, sondern auch die Bestimmung ihrer Stöchiometrie ist möglich (Schamel und Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007).. Zu diesem Zweck kann ein NAMOS Assay (native Antikörper-basierte Mobility-Shift-Assay) durchgeführt werden. Wie in der Antikörper-basierte Gel-Shift-Assay werden die zellulären Lysaten mit monoklonalen Untereinheit-spezifischen Antikörper inkubiert. Dies führt zur Induktion der elektrophoretischen immunoshifts in der BN-Gele, die den Schluss erlauben aus dem Ausmaß der Verschiebung von der Stöchiometrie der MPC In SCHLUSSKOMMENTAR ist BN-PAGE geeignet für die Identifizierung von MPL und die Bestimmung ihrer Größe, Zusammensetzung, sowie relative Häufigkeit. Aufgeführt als NAMOS Assay, es bietet auch die Möglichkeit, die Stöchiometrie einer bestimmten MPC bestimmen. Aufgrund seiner allgemeinen Anwendbarkeit, ist diese Technik ein sehr nützliches Werkzeug für die Charakterisierung von PLM (Dekker, Müller et al 1996.); (Wittig und Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al 2009.); (Wittig und Schägger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

Multiproteinkomplexen (MPL) spielen eine entscheidende Rolle für die Zellkommunikation, da die meisten Proteine ​​in funktioneller oder regulatorische Komplexe mit anderen Proteinen (Sali, Glaeser et al. 2003) gefunden werden kann. So erfordert die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktions-Netzwerke die detaillierte Charakterisierung der Mittelmeer-Partnerländer, um ein integratives Verständnis der Funktion von Proteinen und Regulierung zu gewinnen. Zur Identifizierung und Analyse muss MPCs unter nativen Bedingungen getrennt werden. In diesem Video, beschreiben wir die Analyse der Mittelmeer-Partnerländer durch blaue nativen Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-PAGE). BN-PAGE ist eine Technik, die Trennung von MPC ermöglicht in einer nativen Konformation mit einer höheren Auflösung als durch Gelfiltration oder Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation angeboten und ist daher sinnvoll, MPC Größe, Zusammensetzung und relative Häufigkeit (Schägger und von Jagow 1991) bestimmen ; (Schägger, Cramer et al 1994).. Mit dieser Methode werden Proteine ​​nach ihrer hydrodynamischen Größe und Form in einem Polyacrylamid-Matrix getrennt. Hier zeigen wir die Analyse der Mittelmeer-Partnerländer der gesamten zellulären Lysaten und wies darauf hin, dass Lysat Dialyse den entscheidenden Schritt zu machen BN-PAGE für diese biologischen Proben ist. Mit einer Kombination aus der ersten Dimension BN-und die zweite Dimension SDS-PAGE zeigen wir, dass PLM nach BN-PAGE getrennt weiter in ihre einzelnen Bestandteile werden durch SDS-PAGE unterteilt. Visualisierung der MPC-Komponenten auf Gel-Trennung wird durch Standard-Immunblot durchgeführt. Als Beispiel für MPC Analyse von BN-PAGE, wählten wir die gut charakterisierten eukaryotischen 19S, 20S und 26S Proteasomen.

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Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In diesem Video, beschreiben wir die Charakterisierung von Multiproteinkomplexen (MPL) durch blaue nativen Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-PAGE). In einer ersten Dimension sind dialysiert Zelllysaten durch BN-PAGE getrennt an die einzelnen MPL zu identifizieren. In einer zweiten Dimension SDS-PAGE, werden MPC von Interesse weiter unterteilt, um ihre Wähler durch Immunoblot analysieren.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

blue-native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-bn-page-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

130.2K Aufrufe.  University of Freiburg. In diesem Video, beschreiben wir die Charakterisierung von Multiproteinkomplexen (MPL) durch blaue nativen Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-PAGE). In einer ersten Dimension sind dialysiert Zelllysaten durch BN-PAGE getrennt an die einzelnen MPL zu identifizieren. In einer zweiten Dimension SDS-PAGE, werden MPC von Interesse weiter unterteilt, um ihre Wähler durch Immunoblot analysieren.