JDRF, NIH (R01-DK081469), Commonwealth of Pennsylvania (Rejeneratif Tıp hibe 4100043362 Merkezi) Mükemmellik, Dimes, Mart (Basil O&#39;Connor Başlangıç ​​Akademik Araştırma Ödülü), ve Pennsylvania DERC pilot bir üniversite tarafından desteklenen ve fizibilite hibe (DK19525).

1. CldU ve IDU Etiketleme Dokular <ol><li> Suda çözülür timidin analogları (CldU veya IDU). Her kimyasal 1 mg / ml tartılır ve distile su cam şişelerde ayrı ekleyin. Biz genellikle bir defada her 1 litre hazırlar. </li><li> Bir heyecan plakası veya karıştırıcı diğer formu kimyasalların çözülür. CldU 10 dakika içinde eriyecektir. oda sıcaklığında ajitasyon. IDU 37 ajitasyon bir saat ° C ile sallama daha fazlasını gerektirir. Su kaynakları IDU çözünürlüğü etkileyebilir. IDU gecede sallayarak sonra askıya alınmadan devam ederse, daha temiz bir su kaynağı deneyin. Çözümler 4 ° C karanlıkta &#39;de saklanır. </li><li> Yönetici istenilen etiketleme dönemi için farelere ilk timidin içeren solüsyonu (ya CldU veya IDU). Fareler etiket döneminde etiketsiz suya erişim için izin vermeyin. Belirlenen etiketleme dönemi tamamlandığında, (timidin içeren analogları birkaç saat serum yarı-ömürleri vardır), en az 24 saat süreyle etiketsiz su ile yıkanmaya başlar. Yönetici istenilen etiketleme dönemi için farelere ikinci timidin içeren solüsyonu (ya CldU veya IDU). Yedek su şişeleri düzenli olarak su kaybını önlemek için! </li><li> Alternatif olarak, fare CdlU ve sonra IDU sıralı intraperitoneal etiketli olabilir. 10 mg / ml konsantrasyonda CldU veya IDU hazırlayın. IDU süspansiyon içine gitmek için kuvvetli sallayarak takip konsantre sodyum hidroksit çözeltisi damla akıllıca ek gerekebilir. Aşırı sodyum hidroksit ilave etmeyin. Sodyum hidroksit IDU 10 ml çözümü için tek bir damla 37 ajitasyon bir saat takip ° C ile sallama ekleyin. Eğer çözelti içinde değil, sodyum hidroksit ilavesi tekrarlayın. Intraperitoneal uzaya g vücut ağırlığı başına 100 mcg enjekte edilir. </li><li> Kontrol slaytlar, bu protokol için esastır. Sonuç olarak, biz araştırmacılar duyarlılık ve özgüllük sağlamak için çeşitli varyasyonlar timidin analoğu etiketleme yürütmek şiddetle öneririz. Bu 1 içermelidir. Sadece CldU ile etiketlenmiş Fare, 2. Sadece IDU ile etiketlenmiş Fare, 3. Sırayla CldU ve sonra IDU ile etiketlenmiş edildi Fare, 4. IDU ve sonra CldU sırayla ilk tersten etiketli Fare, sadece su ile etiketli sahte 5 Fareler. CldU ve IDU etiket öğrenme, araştırmacılar her zaman ilgi doku kontrolü slaytlar tüm 5 yukarıdaki setleri ile tüm protokol yapmalıdır. </li></ol> 2. Doku Harvest Fiksasyon ve Slayt Hazırlama <ol><li> Uygun anestezi kullanarak, öldürücü doz aşımı gerçekleştirmek ve sonra fare exsanguination yoluyla kurban. Taze doku çıkarın ve 24 saat için% 4 4 paraformalehyde ° C ile düzeltmek. 01:04 4 formalin tampon ve mağaza ° C gömmek için doku aktarın. </li><li> Alternatif olarak, öldürücü doz aşımı gerçekleştirmek ve daha sonra vücutta kan temizlenir kadar tuzlu su çözeltisi ile kalp sol ventrikül ile fare serpmek, hemen ardından% 4 paraformaldehid 30-50 cc serpmek. 01:04 Formalin Tampon ilgi ve mağaza dokuların gömmek için 4 ° C&#39;de çıkarın. </li><li> Doku dehidrasyon ve parafine gömme sonra, 5 mikron doku bölümleri ve ücret Slaytlarınıza yeri kesti. 65 ° C&#39;de 16 saat boyunca (aşağıda antijen alımı adımları ile gerekli) slayt doku yapışmasını sağlamak için slaytlar pişirin. </li></ol> 3. Dehidratasyon, Permeabilization ve Antigen Alma <ol><li> 5 dakika boyunca iki ksilen hamam slaytlara çeker aşırı parafin çıkarın. her biri. </li><li> 100, 95, 90, 80 70 ve% 50 etanol su ile seyreltilmiş slaytlar çeker doku rehidrate. Slaytlar 3 dakika bekletin. Her konsantrasyon,% 100 ile başlayan ve son daldırma için% 50 doğru gidiyor. </li><li> 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın. 1x PBS. </li><li> 5 dakika (taze, her zaman yaptı)% 0.2 Triton-X çözümü slaytlar çeker hücreleri Permeabilize. </li><li> Mikrodalga doku antijen alımı için slaytlar hazırlayın. Çözüm evaporatif kaybı hesaba slaytlar üstünden 5 cm kapsar, böylece yeterli bir hacim 0.01m pH 6.0 sodyum sitrat tamponu ile bir cam behere slaytlar yerleştirin. </li><li> Mikrodalga çözüm kaynar kadar slaytlar (3-10 dk tam güçte). Çözümü, yavaş yavaş kaynayan kadar gücü azaltmak (% 10-80) ve ek bir 20 dakika devam edin. Yavaş kaynatın çözüm kalmasını sağlamak için periyodik olarak mikrodalga kontrol edin. </li><li> Yeri beher tezgah üstüne slaytları içeren ve oda sıcaklığında (yaklaşık 2 saat), yavaşça soğumasını bekleyin. </li><li> Slaytları bir termometre kullanarak oda sıcaklığında olduğundan emin olun. </li><li> 40 dakika süreyle 1.5N HCL daldırın kayar. oda sıcaklığında. </li><li> Yıkama 1X PBS, 5 dakika içinde iki kez slaytlar. Yıkama başına. </li></ol> 4. İlköğretim ve Ortaöğretim Antikorlar <ol><li> Slaytlar tüm protokolü üzerinden çok nemli kalması önemlidir. Kuru doku daha fazla otomatik olacak-Floresan, ortaya çıkan görüntüleri kullanılmaz hale gelebilirler. Bir zamanda, süreci bir slayt ölüyor engellemek için. </li><li> (Yani, mum) kalem engelleyen bir sıvı ile Circle slaytlar her bölüm. Slaytlar 1x PBS kap içine yerleştirin. </li><li> Islak kağıt havlu koyarak, nemli bir kuluçka odasının hava geçirmeyen plastik bir kabın alt düz attı. </li><li> 1x PBS içinde seyreltilmesi% 10 eşek serum engelleme çözüm olun. Tamamen çözümü ile her bir bölümünü karşılamak için çok önemlidir. 1 x 1,5 santimetre doku bölümleri için, çözüm Bölüm başına 50 mikro-litre bir ses çıkışı yeterli. </li><li> Slaytlar engelleme çözüm ekleyin. 1x PBS slayt çıkarın ve kuru kağıt havluları bir yığın slayt kenarına hafifçe dokunarak aşırı sıvı ortadan kaldırmak. Kuluçka odasında slayt yerleştirin ve her bölüm için 50 mikro-litre% 10 blok çözüm ekleyin. Tüm slaytları oda sıcaklığında 1 saat süreyle yakın konteyner ve inkübe tamamlandığında. </li><li> IDU tespit birincil antikor seyreltme hazırlayın. 1x PBS içinde% 5 eşek serum 1:250 konsantrasyonda fare anti-BrdU sulandırınız. Slayt engellemek çözüm dokunun ve kuluçka odasına geri yerleştirin. Her bölüm için yukarıdaki primer antikor ve 4 gece inkübe ° C </li><li> Yüksek darlığı yıkama (CldU fare anti-BrdU antiserumlar bağlama en aza indiren) hazırlayın. Makyaj taze düşük tuz TBST tampon (pH 8.0 36mm Tris, 50mm NaCl, 0.5% arasında 20). Slayt çifti başına 40 ml tampon gerekecektir. Her biri 50 ml konik tüpüne 40 mL tampon ekleyin. Slaytlar eklemeden önce, ön ısıtma çözümü - 37 ° C </li><li> Bir seferde iki, kuluçka odasının slaytlar kaldırmak back-to-back (doku örnekleri birbirlerinden uzak bakacak şekilde) koyun ve fazla primer antikor dokunun. Düşük tuz TBST ve kapak ile dolu tüpler slaytlar yerleştirin. Tüpler 20 dakika çalkalayın. 37 sıcaklık bakteri kültürü inkübatör sallayarak ° C ve 225 rpm hız. </li><li> Slaytları taze 1X PBS içinde iki kez yıkayın. 5 dk. Yıkama başına. </li><li> Eğer istenirse, CldU ve doku antijeni tespiti için bir sonraki birincil antikor çözüm hazırlayın. 1x PBS içinde% 5 eşek serum 1:250 konsantrasyonda sıçan anti-BrdU sulandırınız. Birincil antikor çözüm çalışma konsantrasyonu doku antijeni karşı birincil antiserumlar sulandırınız. </li><li> Slaytlar fazla 1x PBS dokunun ve kuluçka odasında koyun. Her bölüm için birincil antikor ve 4 gece inkübe ° C </li><li> Slaytları taze 1X PBS içinde iki kez yıkayın. 5 dk. Yıkama başına. </li><li> Ikincil antikor çözüm hazırlayın. Cy2 eşek anti-sıçan 1:250 ve Cy5 eşek anti-fare% 5 eşek serum içeren bir 1X PBS çözüm 1:500 sulandırınız. Cy3 ikincil doku antijeni antiserumlar birincil türleri tespit ettiniz. Ayrıca, ikincil antikor çözüm 1:150 DAPI ml / 0.4mg stok solüsyonu sulandırmak. </li><li> Inkübasyon odasında aşırı 1X PBS kapalı slaytlar ve yer dokunun. Her bölüm için ikincil antikor çözüm ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Slaytları taze 1X PBS içinde iki kez yıkayın. 5 dk. Yıkama başına. </li><li> Slaytların aşırı 1X PBS dokunun ve Altın anti-solmaya montaj medya (dyanine boyalar Vectashield KULLANMAYIN!) Prolong cam kapak yapışır. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için kapak bordroları basın. 4 ° C saklayınız </li></ol> 5. Görüntüleme ve Analiz <ol><li> Resim, yüksek enerjili bir ışık kaynağı, plan-apochromatic hedefleri ve yüksek verimli bir mikroskop kamera (örneğin Hamamatsu Orca ER) ile donatılmış bir floresan mikroskop ile ilgi doku. AMCA (DAPI), Cy2 (CldU) Cy3 (Doku antijen) ve Cy5 (IDU) kanalları görüntüleri yakalayın. Birleştirme tek bir çok katmanlı görüntü dosyası oluşturmak için görüntüleri. </li><li> Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda, DAPI lekeli çekirdeklerin homojen parlak olacaktır. Doku antijen (örneğin insülin), ilgi hücreleri açığa çıkarmalıdır. DAPI veya doku antijeni ile boyanarak kaldırmak kapağı kayma ve ikincil antiserumlar uygulama tekrarlamak gecede 1X PBS zayıf veya tutarsız batırmayın slayt. </li><li> Cy3 doku antijeni odaklanın. CldU ve kanallar arasında geçiş Cy2 ve Cy5 kanal IDU boyama, kontrol edin. Belirteçleri, aşırı IDU ve CldU co-pozitifliği arasındaki potansiyel çapraz reaktivite açısından bakın. Sadece CldU veya IDU içeren dokular için bakın. CldU veya IDU pozitif çekirdek eksikliği etiketleme veya boyama ile bir teknik soruna işaret ediyor olabilir. Bu durumda, yüksek replikatif doku (örneğin lenf nodu) bakın. </li><li> Görüntü analiz. DAPI ve doku antijeni içeren katmanlar görüntüleyin. Baskın elinde bir beyaz tahta marker ve non-dominant el bir hücre sayacı kullanarak, her bir çekirdeği, kuru bir silme işaretleyici (aka beyaz tahta işaretleyici) ile karşıt bir işareti ile işaretleyiniz. DAPI pozitif hücrelerin ilgi doku içinde güvenin. Toplam hücre sayımı kaydedin. Işaretlerini kaldırmak için kuru bir silgi kullanın. Görüntü katmanılar içeren DAPI, doku antijeni ve CldU. CldU pozitif hücrelerin ilgi doku içinde güvenin. Record CldU hücre sayımı ama işaretlerini silmek yok. Değişim, doku antijen, CldU ve IDU içeren katmanlar görselleştirmek için görüntüler. Kont CldU IDU çift pozitif hücreler. Kayıt değeri, bütün işaretlerini silmek ve DAPI, doku antijeni ve IDU içeren katmanlar gösterilecek. Ilgi doku içinde IDU pozitif hücrelerin toplam sayısı güvenin. Tutanak IDU hücre sayımı. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Biz sırayla hemen kurban takibeden iki hafta için bir hafta ve daha sonra IDU CldU ile 6 haftalık dişi fareler etiketli. Pancreata CldU, IDU ve İnsülin (bir doku antijeni) yanı sıra DAPI algılamak için boyandı. Adacıklar düzgün insülin ile boyandı. CldU lekeli çekirdekleri ayrı IDU lekeli çekirdekleri (Şekil 2). Adanın dışında birçok çekirdekleri CldU IDU co-pozitif (Şekil 2, sağ alt, beyaz oklar). CldU ve IDU (Şekil 2, sağ alt, kırmızı ok), tek bir insülin pozitif hücre nükleer boyanma vardı. Fareler. Philadelphia Çocuk Hastanesi IACUC komitesi yönergelere göre fare ile tüm deneyler yapıldı. Philadelphia Çocuk Hastanesi, laboratuar hayvanları tesiste ev sahipliği Taconic (Germantown New York), PMI Beslenme International (Richmond. Indiana) beslenen Fare Diyet 5015 Kadın B6.129 F1 wild-tip farelerden satın alındı. Strateji Etiketleme. IDU (bu şemada kırmızı işaretli) CldU ile ilk hücre bölünmesi olayı (Bu planın yeşil işaretli) ve ikinci bir hücre bölünmesi etiketleme, CldU ve IDU (yeşil / kırmızı) ile birlikte etiketli hücreleri sıralı hücre bölünmesi sonuçları . Farelerde içinde pankreas hücre yenilenmesini timidin etiketleme Temsilcisi sonuçlar. Langerhans Adacık merkezinde bir fare pankreas Immunofluorescent görüntü. Fare hemen kurban öncesi 2 hafta içme suyu için 1 hafta sonra IDU CldU ile doluydu. Pankreas örnek protokolünde açıklandığı gibi işlendi. 40x objektif görüntüler, farklı katmanları için uygun sayım görüntülenir. Birleştirilmiş görüntüler DAPI (beyaz) CldU (yeşil), IDU (kırmızı), İnsülin (sarı) içerir. (Üst, sol) DAPI ve insülin. (Üst, sağ) CldU ve İnsülin. (Alt, sol) IDU ve İnsülin. (Sağ alt) CldU, IDU ve İnsülin. Ölçek çubuğu: 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Etiketleme stratejisi. IDU (bu şemada kırmızı işaretli) CldU ile ilk hücre bölünmesi olayı (Bu planın yeşil işaretli) ve ikinci bir hücre bölünmesi etiketleme, CldU ve IDU (yeşil / kırmızı) ile birlikte etiketli hücreleri sıralı hücre bölünmesi sonuçları . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 farelerde içinde pankreas hücre yenilenmesini timidin etiketleme Temsilcisi sonuçları. Langerhans Adacık merkezinde bir fare pankreas Immunofluorescent görüntü. Fare hemen kurban öncesi 2 hafta içme suyu için 1 hafta sonra IDU CldU ile doluydu. Pankreas örnek protokolünde açıklandığı gibi işlendi. 40x objektif görüntüler, farklı katmanları için uygun sayım görüntülenir. Birleştirilmiş görüntüler DAPI (beyaz) CldU (yeşil), IDU (kırmızı), İnsülin (sarı) içerir. (Üst, sol) DAPI ve insülin. (Üst, sağ) CldU ve İnsülin. (Alt, sol) IDU ve İnsülin. (Sağ alt) CldU, IDU ve İnsülin. Ölçek çubuğu: 100μm.

<ol>
	<li>Teta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+regeneration+of+adult+Beta+cells+does+not+involve+specialized+progenitors.">Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors.</a> Dev Cell. 12 (5), 817-817 (2007).</li><li>Kiel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+do+not+asymmetrically+segregate+chromosomes+or+retain+BrdU.">Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU.</a> Nature. 449 (7159), 238-238 (2007).</li><li>Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin1/ErbB4+signaling+induces+cardiomyocyte+proliferation+and+repair+of+heart+injury.">Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury.</a> Cell. 138, 257-257 (2009).</li><li>Rankin, M. M., Kushner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Beta+Cell+Proliferation+Is+Severely+Restricted+with+Advanced+Age.">Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age.</a> Diabetes. , (2009).</li><li>He, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D2+Protein+Stability+Is+Regulated+in+Pancreatic+Beta+Cells.">Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells.</a> Mol Endocrinol. , (2009).</li><li>Kushner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+growth:+an+unusual+paradigm+of+organogenesis+that+is+cyclin+D2/Cdk4+dependent.">Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent.</a> Cell Cycle. 5 (3), 234-234 (2006).</li><li>Teta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+slow+turnover+of+beta-cells+in+aged+adult+mice.">Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice.</a> Diabetes. 54 (9), 2557-2557 (2005).</li><li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1118 (2008).</li><li>Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dexamethasone+and+5-bromodeoxyuridine+on+protein+synthesis+and+secretion+during+in+vitro+pancreatic+development.">Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development.</a> Dev Biol. 98 (2), 295-295 (1983).</li><li>Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-bromodeoxyuridine+may+alter+the+differentiative+program+of+the+embryonic+pancreas.">5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas.</a> J Cell Biol. 71 (2), 341-341 (1976).</li><li>Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+5-bromodeoxyuridine+inhibition+of+exocrine+pancreas+differentiation.">On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation.</a> J Cell Biol. 249 (6), 1953-1953 (1974).</li><li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+pancreatic+islet+cell+proliferation+by+heavy+water+labeling.">Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (5), E1459-E1459 (2007).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2415 (2008).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+and+bioorthogonal+reactions:+unprecedented+selectivity+in+the+labeling+of+biological+molecules.">Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules.</a> Biochemistry. 48 (28), 6571-6571 (2009).</li><li>Buck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44 (7), 927-927 (2008).</li><li>Huising, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRFR1+is+expressed+on+pancreatic+beta+cells,+promotes+beta+cell+proliferation,+and+potentiates+insulin+secretion+in+a+glucose-dependent+manner.">CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 912-912 (2008).</li><li>Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell Metab. 8 (6), 532-532 (2008).</li><li>Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ordered+architecture+of+murine+ear+epidermis+is+maintained+by+progenitor+cells+with+random+fate.">The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate.</a> Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).</li></ol>

Bütün deneyler fare ile Philadelphia Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) kurallarına göre hayvan tesis yapıldı.

Hücre yenilenmesini etiketleme timidin tabanlı bir yaklaşım Bizim yaklaşımımız, biyomedikal araştırma birçok potansiyel uygulamalar vardır. Bugüne kadar, pankreas üzerinde yoğunlaşan, ama biz de hücreli deri ciro, gut, karaciğer, böbrek üstü bezi, böbrek, testis, yumurtalık, tiroid, lenf nodu, hematopoez, ve beyin 1 incelemek için bu strateji uyguladık. Çünkü, hücre yenilenmesini doku doku değişir etiketleme stratejileri ilgi organ en çekici bilgi almak için özelleştirilmiş olmalıdır. Morrison ve arkadaşları 1 gün her hematopoez 2 etiket CldU ve IDU kullandı. Kuhn ve arkadaşları, hücre yenileyici miyokardın 3 bölümü tespit etmek için her biri için 4 gün CldU ve IDU kullanın . Buna karşılık, pankreas adacık içerisinde bazal hücreli cirosu, bir doku hayvan yaşları 1,4-6 gibi minimal hücre ciro ile etiketlemek için toplam 9 ay CldU ve IDU kullandık. Çalışmalar doku homeostaz içinde hücre yenilenmesini tanımlamak için etiketleme stratejisinin en belirgin potansiyel uygulama. Ama bizim teknik birçok diğer potansiyel uygulamalar vardır. Örneğin, biz de son zamanlarda artan çoğaltma odak alanları CldU veya Idu 5 artan kuruluş tarafından kolayca tespit edilebilir onkojenik transformasyon, dokuları içinde tanımlamak için bu tekniği uygulanır . Morrison ve arkadaşları CldU ve IDU 1 gün her hematopoietik kök hücre etiket istinat davranış 2 test etmek için kullanılır. Ayrıca sıralı timidin analoğu etiketleme transit yükseltme hücreleri dokulara 1 büyüme ya da yenilenmesi için katkıda olmadığını belirlemek için başvuruda bulunmuş . Bu uygulama sıralı yönetiminde timidin analogları doku homeostazında alan hücrelerin kökeni ve hayatta kalma eğitimi için yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir. Timidin analogları dikkatli alınmadan kullanılamaz. Sentetik timidin analogları bölünen hücreleri için potansiyel toksisiteleri ve bunların kullanımı, teorik olarak büyüyen hayvanlarda hücre yenilenmesini olumsuz olarak etkilemektedir. Timidin analogları, kanser hastaları için ajanlar radyasyona olarak kullanılan, hücre yenilenmesini yavaşlatır. Bu nedenle biz kendi ilgi doku potansiyel toksisiteleri için dikkatli araştırmak için müfettişler çağırıyorum. Örneğin, Trumpp ve arkadaşları sistemik BrdU hematopoietik kök hücre, hücre döngüsü 7 girmek için zorlayabilir bulabilirsiniz . Örneğin, Rutter ve arkadaşları, yüksek doz timidin analogları, pankreas 8 geliştirmek için toksik olduğu görülmektedir. Daha yakın zamanlarda KineMed az Hellerstein ve arkadaşları, Inc BrdU yönetiminin özel bir ağır su etiketleme tekniği 9 kullanarak 16-25 oranında intra-adacık çoğalması yavaşlar bulundu. Hellerstein ve arkadaşları tarafından kullanılan tüm adacık hazırlıkları toplam adacık hazırlıkları kadar 50% &#39;sini diğer birçok endokrin ve non-endokrin hücre tipleri, içeriyordu. Ancak, biz, genç yetişkin farelerde BrdU uzun süreli infüzyon Ki67 ifadesi 4 olarak ölçülen beta hücre proliferasyonu etkilemek değildir bulabilirsiniz. Benzer şekilde, IDU CldU ve uzun vadeli yönetim beta hücre kitlesinin genişlemesi 1 bozduğu gibi görünmüyor. Ayrıca, beta hücre çoğalması oranları, zaman ve sadece birkaç saat için (eşdeğer süreler oranları normalize edilir) etiketli farelerde uzun süre BrdU etiketli fareler arasındaki eşdeğer. Birlikte, bu sonuçlar, fareler timidin analogları uzun vadeli düşük doz uygulanması ile güvenli bir şekilde tolere edebilir. Yine de, pankreatik beta hücre büyümesi timidin analogları tarafından potansiyel toksisitesi ekarte edemez. Sonuç olarak, biz timidin analogları ile fareler etiketleme kontrollerini yapmak ve diğer araştırmacılar da bunu teşvik etmek için devam ediyor. Sıralı timidin analoğu etiketleme tekniği, tuzaklar ve teknik zorluklar olmadan değildir. Sonuç olarak, kontrol slaytlar özellikle önemlidir. Biz 1 ile çeşitli dokular oluşur kontrolü slaytlar üretilen) sadece CldU ile etiketlenmiş Fareler;. 2) Fareler sadece IDU ile etiketlenmiş; 3) sırayla CldU ve sonra IDU ile etiketlenmiş Fareler; 4) IDU ve sonra CldU sırayla ilk tersten etiketli Fare, sadece su ile etiketli sahte 5) Fare. CldU ve IDU etiket öğrenme, araştırmacılar her zaman ilgi doku slaytlar tüm 5 yukarıdaki setleri ile tüm protokol yapmalıdır. CldU ve IDU arasında hafif çapraz reaksiyon iki timidin analogları ile etiketleme bir talihsiz ama kaçınılmaz dezavantajı. CldU ve IDU tekniği, aslında farklı türler (fare ve sıçan) BrdU karşı elde edilmiştir antiserumlar arasında yakınlık farklılıklara dayalı. Protokolü, hantal ise, bu tür çapraz reaksiyon en aza indirmek için tasarlanmıştır. Sonuç olarak, protokol adım atlama (ler) düşünen araştırmacılar arasından dikkatli çağırıyorum. Özellikle, biz varfare ve sıçan arasındaki çapraz reaktif ikincil antiserumlar bir sorunla karşılaşmadım. Bu, tamamen fare ve sıçan arasındaki çapraz emilirler Jackson antiserumların kullanımı ile minimize edilebilir. Biz bazen timidin dahil yeterince algılamak için başarısız olur. Bu gibi durumlarda, reaktif veya adım olduğu belirlemek için pozitif kontrol slaytları kullanmak önem taşımaktadır. Güçlükleri antiserumlar, kuru slaytlar, ya da yetersiz nükleer permeabilization kötü alikotları nedeniyle genellikle. Biz, başarılı bir şekilde gelişmekte olan embriyolar ile IDU etiket başarısız oldu. Böylece, tüm dokulara IDU geçirir. Çift timidin analoğu etiketlenmesi için CldU ve IDU Alternatifler ufukta. Edu (5 etinil-2 dezoksiuridin), bakır katalize tıklayın kimya algılama 10,11 için bir substrat olabilir . Edu algılama yöntemleri, DNA ipliklerini ayrılması ve böylece akış sitometri 12 analiz son derece mükellef değilsiniz . Edu çapraz reaktif BrdU 10 ile uyumlu değil. Edu, pankreatik beta hücreleri 13, intestinal L hücrelerinden 14 ve Epidermis 15 de dahil olmak üzere çeşitli fare dokuların hücre yenilenmesini ölçmek için kullanılır olmuştur . Edu, şu an (500mg ortalama $ 1000 ABD) oldukça pahalıdır. Yine de, Edu algılama BrdU algılama 10&#39;dan çok daha hassas görünüyor. Bu nedenle, CldU ve IDU yerine Edu ve BrdU birleştirmek için ekonomik olabilir. Bu yöntem aynı zamanda üç farklı tur ı üç kat Edu, CldU ve IDU etiketli farelerde hücre bölünmesi algılama izin verebilir. Özet olarak, sıralı timidin analoğu etiketleme tekniği, hücre yenilenmesini tespit için yeni bir yaklaşımdır. Biz, bizim yaklaşımımız, hücre bölünmesi daha doğru bir şekilde ölçmek için diğer bilim adamları umut ve yeni paradigmalar doku homeostazında açacağı beklenmektedir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

Hücre bölünmesinin hassas ölçüm yavaş bölünen hücreleri analiz edildiğinde, giderek daha karmaşık hale deneysel biyolojide temel bir sorundur. Hücre bölünmesi tespit etmek için kurulan yöntemler, hücre kültürü, bu tür carboxyfluorescein di-aetate succinimidyl ester (KAKE), Ki67 veya PCNA mitojenik antijenleri immün algılama gibi hayati boyaların seyreltme ve timidin analogları sürekli mikroskobu ile doğrudan görselleştirme içerir. Timidin analogları tritiated timidin, bromo-dezoksiuridin (BrdU), kloro-dezoksiuridin (CldU) ve iodo-dezoksiuridin (IDU) için immuno-algılama ve etinil-dezoksiuridin kimyasal algılama radyo algılama dahil olmak üzere çeşitli yöntemler ile tespit edilebilir (EDU). Biz yetişkin farelerin dokulara farklı timidin analogları sıralı dahil edilmesi (CldU ve IDU) tespit etmek için bir strateji elde var. Bizim metodumuz, araştırmacılar doğru hücre bölünme birbirini izleyen iki mermi ölçmek için sağlar. Optimize immün protokolleri olarak bizim yaklaşımımız, uzun süre farelere yönetmek için güvenli içme suyu ile idare çok düşük doz timidin analogları algılayabilir. Sonuç olarak, bizim teknik, çok uzun ömürlü dokularda hücre yenilenmesini tespit etmek için kullanılabilir. Optimal immunofluoresent boyama sonuçları, pankreas, cilt, bağırsak, karaciğer, böbrek üstü bezi, testis, yumurtalık, tiroid, lenf nodu, ve beyin de dahil olmak üzere birçok doku tipleri, elde edilebilir. Ayrıca dokular içinde onkojenik dönüşümü tanımlamak için bu tekniği uyguladık. Biz daha transit yükseltme hücrelerin, dokuların büyüme ya da yenilenmesi için katkıda olmadığını belirlemek için bu tekniği uyguladık. Bu anlamda, timidin analogları sıralı yönetim doku homeostazında alan hücrelerin kökeni ve hayatta kalma eğitimi için yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue at JoVE.com

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Biz yetişkin farelerin dokulara hücre bölünme birbirini izleyen iki mermi ölçmek için timidin analogları sıralı dahil (CldU ve IDU) tespit etmek için bir strateji elde var. Bu strateji, uzun ömürlü dokuların hücre ciro, onkojenik transformasyon, ya da transit yükseltme hücreleri tespit etmek için yararlıdır.

İlköğretim Doku İki timidin analogları Immunofluorescent Algılama (CldU ve IDU)

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.4K Görüntüleme.  University of Pennsylvania-School of Medicine. Biz yetişkin farelerin dokulara hücre bölünme birbirini izleyen iki mermi ölçmek için timidin analogları sıralı dahil (CldU ve IDU) tespit etmek için bir strateji elde var. Bu strateji, uzun ömürlü dokuların hücre ciro, onkojenik transformasyon, ya da transit yükseltme hücreleri tespit etmek için yararlıdır.

Video: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Biyoloji

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-Omics Analizleri ve Birincil Hücre Kültürü için Yarasaların Doku Toplama

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Deniz Hıyar Bağırsak Hücrelerinin Birincil Kültüründe Apoptosis İndüksiyon uyupve tayini

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

İnsan Beyin Dokusundan Proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzleme Tabanlı Tespiti Kullanılarak Nicel Proteomik İş Akışı

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Hemipteran Bağırsaklarda Bitki Virüsü ve Böcek Vektör Proteinlerinin İmmünofloresan Etiketlenmesi

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...