Biz video düzenleme yaptığı yardım için Jacob Solis teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma MJ Levene bir NSF KARİYER Ödülü DBI-0953902 tarafından finanse edildi.

1. Hayvan Perfüzyon 5 ve Whole Fare Beyin Takas <ol><li> Işlemin tüm uzunluğu boyunca kurutma aşaması için kullanılan süre uzunluğuna bağlı olarak değişebilir, fakat toplam tüm süreç iki gün içinde gerçekleştirilebilmektedir. </li><li> YFP fareler tartılır ve daha sonra derin bir ketamin / ksilazin (100 mg / kg: 10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyon ile anestetize. </li><li> Ameliyat öncesinde derin anestezi cerrahi bir düzlem onaylayın. Hayvan bir firma parmak veya kuyruk tutam tepki olmadığını görmek için her 5 dakikada kontrol edin. Hayvan tepki vermiyorsa, ketamin / xylazine bir ek doz (orijinal dozun 1/3) gereklidir. </li><li> Sonra derin anestezi, fare ameliyat için onun göğüs teşhir, bir yatar pozisyonda (dorsal recumbancy) olduğunu böylece laboratuar bandı kullanarak cerrahi yatağa her uzuv kalarak fare kısıtlamaktadır. Cerrahi yatak genellikle metal veya plastik örgü yapılmış ve bir lavaboya veya bir dudaklı-pan üstüne yerleştirilir, böylece kan ve fiksatifatık kolaylıkla toplanabilir. </li><li> Başlamak için, xyphoid süreç altında bir kesi yapmak. Makas ve cımbız kullanarak göğüs kafesinin tabanı boyunca kesin ve kesim yapıldığı gibi cilt geri çekin. Fare sternumun her iki tarafı boyunca iki kesim (kaburgaları) kalp maruz bırakmak bir hemostat kullanarak göğüs boşluğuna uzak tutulan bir doku flep oluşturmak için yapın. </li><li> Kalbin sol ventrikül içine 23 gr iğne takın ve kan kaçmasına izin vermek için sağ atrium kas duvarında küçük bir kesi yapmak. Bu prosedürün bir video için makale 2497 Jove bakın. 5 </li><li> Sağ atriyum kesilir hemen sonra, 4 ile perfüzyon başlamak ° C&#39;de kan artık kalbin sağ atriyum (30 süzülen gözleninceye kadar fosfat, PBS (pH 7.2) tamponlu salin - yaklaşık 5 arasında bir oranda 40 mL ml / dak.) </li><li> Bir kez tüm kan (sağ atrium çıkarken sıvı açıktır) drene edilmiş, soğutulmuş% 4 perfüzyon orta geçişPFA çözüm. Farenin vücut dokunma (- yaklaşık 5 ml / dk &#39;lık bir oranda 40 mL olarak yaklaşık 30) belirgin ve katı haline gelene kadar soğuk serpmek. (Konsantre% 16 PFA çözeltisi üreticisinin talimatlarına ve pH 7,2 ulaşılana kadar NaOH eklenir göre seyreltilir. Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin ve davlumbaz içine kimyasallar işlemek ve karıştırın.) </li><li> Perfüzyon sonra, cerrahi yatağından fare kaldırmak ve beynin eksizyonu başlamak için başını kesmek. </li><li> Forseps ve iris makas kullanarak, kafatasının arka başlayan ve ilerlemeye küçük bölümlerde kafatası çıkarın. Dikkatle küçük bölümlerde beyin uzak kemik çekmek için forseps kullanırken kafatası üzerinde makas ile 4 mm - küçük kesikler her 2 olun. Beynin tüm üst yüzey ortaya çıkıncaya kadar bunu yapın. </li><li> Tüketim bir cam şişenin içine 5 mm genişliğinde, düz spatula ve yer kullanarak kafatasından beyin. Sonrası fiksasyon için 4 az 6 saat süreyle% 4 PFA ° C daldırın. </li><li> Mesaj Sonrasıfiksasyon, cam flakon PFA dökülen ve PBS ile değiştirerek oda sıcaklığında PBS içinde iki kez beyin yıkamak. Dökülen ve ikinci bir yıkama için PBS ile değiştirmeden önce PBS çözüm Swirl beyin. </li><li> Derecelendirilmiş bir inkübasyon başına 2 saat etanol inkübasyonlar serisi (bir kez,% 50,% 70,% 95, ve iki kez% 100), ve daha sonra da ikinci% 100 etanol inkübasyonu ile 12 saat oda sıcaklığında beyin kurutmak için Sabit doku su çıkarmak. Her inkübasyon için, cam tüpten önceki etanol çözeltisi dökünüz ve beynin tamamen daldırılmış kadar sonraki çözümü ile değiştirin. </li><li> % 100 etanol içinde ikinci bir inkübasyondan sonra, çözelti dökmek ve eşit parça etanol ve benzil alkol ve benzil benzoat (1:2 lik hacim: hacim oranında) ihtiva eden temizleme çözeltisi ile değiştirin. İnkübasyondan sonra, süzün bu çözelti 2 saat sonra ve benzil alkol ve benzil benzoat (1:2 lik hacim: hacim oranında) arasında bir% 100 çözeltisi ile değiştirin. Refratakas çözüm ctive indeksi n = 1.54 olduğunu. </li><li> Bir kez Babb, beyin 4 içinde, fark şeffaf olacak - 5 saat. En iyi temizleme sonuçları elde etmek için, parlak ışık korumalı sırasında beyin, oda sıcaklığında 6 gün boyunca açık bırakılır. </li></ol> 2. Mikroskop Kurulumu <ol><li> Beyin görüntüleme için temizlenir ve hazır hale geldiğinde, bir Petri kabı altına yapıştırmayın bunu siyanoakrilat kullanarak. Yapıştırıcı devam etmeden önce kurumasını bekleyin. </li><li> Kuruduktan sonra, batığın Babb beyin ve görüntüleme için mikroskop objektif altında Petri kabı yerleştirin. </li><li> Biz 990 nm dalgaboyu için 710 nm arasında ayarlanabilen bir Mai Tai titanyum safir lazer birleştiren multiphoton mikroskop kullanmak. Biz YFP sinyallerini üretmek için kullanabileceğiniz dalgaboyu 886 nm. Lazer gücü 30 arasında değişir - 100 mW görüntüleme derinliğine bağlı. </li><li> Büyük sağlayan bir Nikon 5X objektif (NA, 0.5) kullanılarak yansıyan floresan sinyali yakalamakalan-of-view görüntüleme (2 x 2 mm). </li><li> Bir 535/50 bandpass kullanarak yansıyan floresan sinyal filtreleme ve GaAsP PMT (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey) kullanarak toplamak. </li><li> Yüksek çözünürlüklü, YFP görüntüleri oluşturmak için 2 ms başına satır tarama oranı ile 2048 x 2048 piksel çözünürlükte ScanImage yazılımını 6 kullanarak Süreci görüntüler. </li><li> Bir kez görüntüleme tamamlandığında, gelecekte görüntüleme için ışıktan korumalı forseps ve Babb mağaza kullanarak Petri çanak beyin çıkarın. Yapıştırılmış numuneler için, 30 dereceden daha fazla bir açıyla ve tutkal Petri kabı arasında bir jilet çalıştırarak doku kaldırmak. Biz hiçbir görünür bozulması ile 1 yıl için Babb örneklerin depolamış. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Burada gösterilen temsili görüntüler ve videolar optik takas mümkün kılan yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleme özelliği göstermektedir. Tüm beyin görüntüleme sağlarYFP-etiketli hipokampus ve korteks farklı katmanlardaki nöronlar doku yüzeyinin altında 2 mm kadar derin biçimde görülebilir. Şekil 1 için hipokampus anatomik özelliklere karşılık gelen bir koronal görüşün bir temsilcisi görüntü kaudal 2.92 mm gösterir bregma 7. Örnek görüntüleme derinliği 1.94 mm idi. Bu farkın bazı beyin kaudal sonunda serebellumun kaldırılması nedeniyle ve denge dehidratasyon sürecinden büzülme nedeniyle oldu. Yığın bir başka görüntü doku yüzeyi (Şekil 2) altında YFP 2 mm ifade neokorteks tabaka V / VI piramidal nöronlar göstermektedir. Tüm görüntüler Nikon 5X objektif ve büyütme ScanImage yazılım görüntü elde etmek için dijital zoom özelliğini kullanarak yapıldı kullanılarak elde edildi. Neokorteks üzerinde yakınlaştırma tarafından, neokorteks Katman V piramidal nöronların tek tek akson ve nöron hücre gövdeleri açıkly doku yüzeyinin altında 1.02 mm (Şekil 3) kadar ayırt. Şekil 3, ikinci görüntü yığını kullanarak, nöron bölge bir 3D yeniden ImageJ yazılım 8 (Şekil 4) kullanılarak yapılmıştır. MPM yüksek çözünürlük özelliği de bize tüm bireysel nöronların görüntüleri sunmaya olanak sağlar. Burada bireysel dendritik süreçleri açıkça görünür olduğu neokorteks (Şekil 5) Layer V piramidal nöron bir rekonstrüksiyon göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> Şekil 1, bir 1.2 mm Görüntü yığını Temsilcisi görüntü (0,8 - doku yüzeyinin altında 2 mm). Neokorteks ve hipokampus farklı katmanları gösteren tüm fare beyin. Hipokampus Özellikleri doku yüzeyinin altında 1.1 mm görebilir ve takip kullanılarak etiketlenir oylandıing kodu:. DG = dentat girus, DG = granüler tabaka GrDG, Lmol = lacunosum moleculare tabakası, Mol = moleküler tabaka DG, Ya = Oriens tabakası, PoDG = polimorf tabakası DG, Py = piramidal hücre tabakası, Rad = stratum radiatum 7 Resim 1.8 x 1.8 mm boyutunda, ölçek çubuğu = 200 mikron. Beynin rostral sonunda hedefi doğru yukarı bakacak kaudal ucu ile bir Petri kabı üzerine oturtulmuştur. Bu koronal düzlemde görüntüleme kolaylaştırdı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> Şekil 2. 1.2 mm Görüntü yığını Temsilcisi çerçevesi (0.8 - doku yüzeyinin altında 2 mm). Neokorteks vurgulayarak tüm fare beyin. Korteks tabakası V / VI YFP ifade Piramidal hücre ve süreçleri doku yüzeyinin altında görünür 2 mm. Etiketleme derecesi neokortekste seyrek etiketleme önceki çalışmalarla uyumludur. ANKASTRE 9 (sağ) b büyütülür<html> Soldaki oxed alanı. Görüntü boyutu 1.8 x 1.8 mm, ölçek çubuğu = 200 mikron (50 mikron inset). <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> Şekil 3. Örnek çerçeve beynin neokorteks katmanı V piramidal nöronların görüntü yığınından doku yüzeyinin altında 774 mikron alınır. Yığın 700 mikron gelen doku yüzeyinin altında 1.020 mikron gider. Bir 8X dijital zoom gibi ince süreçleri gibi detayları yakalamak için kullanıldı. Görüntü boyutu 225 x 225 mikron, ölçek çubuğu = 20 mikron. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> Şekil 4. Şekil 3&#39;te görseli yığının 3D rekonstrüksiyon Temsilcisi görüntü (225 x 225 x 320 mikron). Görüntü boyutu 225 x 225 mikron, ölçek çubuğu = 28 mikron. s &quot;&gt; <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> Şekil 5. 10X dijital zoom kullanarak neokorteks bir tabaka V piramidal nöron Yüksek çözünürlüklü yeniden görüntü. Nöron uzunluğu, ölçek çubuğu = 25 mikron 485 mikron ölçer. Her görüntü kiremit için görüş alanı 180 mikron x 180 mikron. Her kiremit farklı bir derinlik (z-seviyesinde) yer almaktadır. Kortikal apikal dendritler genel, ekspres YFP yanı sıra soma içinde yok. Burada gösterildiği gibi, güç soma doyma en aza düşürülmüştür, görüş alanında her ikisi de aynı olması için, bu ince işlem sönük görünmesine neden olmaktadır. Buradaki vurgu yerine ince ayrıntılarla daha görüş alanı görünümünde gösteren oldu. Ince ayrıntıları göstermek için, soma olmadan bölgeye odaklanmak, bir dijital zoom kullanın ve lazer gücünü artırmak.

<ol>
	<li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs.">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).</li><li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence,+second+harmonic+generation,+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs.">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy:+Morphology+and+apoptosis.">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li><li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography:+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing.">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li><li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging.">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li></ol>

Deney hayvanları üzerinde Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.

Standart organik boyalar organik çözücülerin bir yelpazesi ile uyumlu ve bu nedenle protokoller temizlemek için özel bir sorun teşkil etmez iken, floresan proteinleri çözücü sıklıkla değişiklikler az hoşgörülü. Mevcut çalışma 4 hedefi ciddi bir sınırlama üstesinden oldu XFPs floresan kayıp veya ölçüde düşer Bir önceki optik temizleme protokolleri. Burada sunulan görüntüler YFP gelen floresans korunmuş olduğunu göstermektedir. Burada anlatılan optik temizleme tekniği dok...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Sigma-Aldrich Inc </td><td> D8537 </td><td> 500 mi, pH 7.2 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15710 </td><td> 10 x 10 ml,% 16 paraformaldehit </td></tr><tr><td> Etilalkol </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB00515-00500 </td><td> 500 mi, 200 proof </td></tr><tr><td> Etilalkol </td><td> Pharmco Products, Inc </td><td> 111000190 </td><td> 1 gal., 190 kanıtı </td></tr><tr><td> Benzil alkol </td><td> Sigma-Aldrich Inc </td><td> 402834 </td><td> 500 ml,% 99 + </td></tr><tr><td> Benzil benzoat </td><td> Sigma-Aldrich Inc </td><td> B6630-IL </td><td> , 500 ml% 99 ≥ </td></tr><tr><td> 5X/0.5 NA objektif </td><td> Nikon </td><td> 5X AZ Planı Un </td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing yfp

Tüm fare organlarının içsel floresans ve ikinci harmonik üretimi (SHG) arasında Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün olmaktadır. 1,2 Ancak, GFP ve YFP olarak floresan proteinleri içeren organlar, metanol kullanan optik temizleme protokollerinin benzil alkol kullanarak dehidratasyon ve net: ışık 3 korumasız ise benzil benzoat (Babb) floresan sinyal korumak yok. Burada sunulan protokol nöronlarda eksprese YFP floresan sinyal koruyarak fare beyni üzerindeki tüm organ optik temizleme gerçekleştirmek için hangi yeni bir yoludur. Org floresan protein için hasarı azaltmak ve multiphoton görüntüleme için onların floresan sinyalini korumak için yararlı olan bir dizi dereceli etanol kullanılarak susuz olduğu bu tür optik açıklığa protokol değiştirilmesi. 4 etanol-tabanlı dehidrasyon ile optik açıklığın iyileştirilmiş bir yöntem ile Babb ile takasışıktan korumalı ise, biz doku yüzeyinin altında 2 mm&#39;den daha fazla bir fare beyin nöronları sarı floresan proteini (YFP) İfade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.

Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP at JoVE.com

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Tüm fare organların Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün değil, tüm protokolleri floresan proteinlerin floresan sinyal korumak. Etanol bazlı dehidratasyon ve benzil alkol ile optik temizleme yöntemi: benzil benzoat takas, biz bütün fare beyin YFP ifade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Görüntüleme.  Yale University. Tüm fare organların Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün değil, tüm protokolleri floresan proteinlerin floresan sinyal korumak. Etanol bazlı dehidratasyon ve benzil alkol ile optik temizleme yöntemi: benzil benzoat takas, biz bütün fare beyin YFP ifade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.

Video: Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Nörobilim

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Yalıtımlı LacZ ifade Sitometrisi kullanarak Fare İç Kulak Dokular Hücreler

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...