Bu çalışma, Dr. Poelzing verilen Sağlık hibe sayısı R21-HL094828-01 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. Gürültü Fonksiyon ve Giriş Sinyali hazırlayın <ol><li> Istenilen frekans bileşenleri içeren bir gürültü işlev oluşturun. Bu frekans alanında istenilen frekans bileşenleri açıklayan ve daha sonra ters hızlı Fourier dönüşümü hesaplanması yapılabilir. Bu çalışmada, 1 - 15 kHz kullanılmıştır. Tüm Fourier dönüşümleri ve bu çalışmada açıklanan ters Fourier dönüşümleri Matlab&#39;ın FFT ve IFFT fonksiyonları kullanılarak hesaplandı. </li><li> Uygun gürültü fonksiyonunun genliği Ölçeği. Bu çalışmada gürültü fonksiyonu sıfır gürültü fonksiyonunun genlik zirve için 50 veya 100 mV olduğu gibi yaygınlaştırılmıştır. </li><li> Kullanılan kazanım yazılım için uygun yöntemler kullanılarak bir uyarıcı dosya oluşturun. Clampex 8 için ilk önce uygun bir başlık ile bir metin dosyası oluşturun. Başlığın altında, tek bir süpürme için ilk sütunda zaman artışlarla yerleştirin. Zaman artışlarla ölçümlerinde kullanılan örnekleme aralığı aynı zamansal aralık olmalıdır. Gerilim adım protokolü her süpürme için her zaman bir adım istenen tam gerilim yerleştirin. Bu gürültü fonksiyonu içermelidir. </li></ol> 2. Gerilim Kelepçe Ölçümleri gerçekleştirin <ol><li> , Daha önce oluşturulan uyaran dosya ile uyumlu satın yazılım içinde bir ölçüm protokolü oluşturun. Clampex, kullanıcı mevcut protokolü ile bir uyarıcı dosya ilişkilendirmek için izin veren bir menü var. </li><li> Ölçüm ekipmanı hücreli bir model (ya da biyolojik) takın. </li><li> Planlandığı gibi deney yapın. Kontrol amaçları için, herhangi bir gürültü fonksiyonları içermez periyodik ölçümler dahil ettiğinizden emin olun. </li></ol> 3. Mesaj Deney Analizi <ol><li> Bireysel bir kayıt için IV eğrisi hesaplayın. Kayıt gürültü fonksiyonu uygulanan kararlı hal ise, IV eğrisi zamansal gürültü fonksiyonu aralığının dışında kayıt kararlı bir duruma kısmını kullanarak oluşturulabilir. Kayıt kararlı durum değilse, gürültü işlevi IV eğrisi hesaplama engel olabilir, gürültü fonksiyonu olmadan ikinci bir kayıt yapılmalıdır. </li><li> Hızlı Fourier dönüşümü gürültü fonksiyonu eklenmiş kayıt kısmı gerilim bir kayıt her adım için hesaplar. Amxn m FFT frekansları sayısı matris, ve n her bir gerilim adım için Fourier dönüşümü birleştirin gerilim adımları sayıdır. Bu yapılandırmada, matris her satır, tek bir frekans genlik deneyde tüm gerilim adımları temsil eder. </li><li> Her frekans için (yani Yukarıdaki matris her satır) 3.1 oluşturulan IV eğrisi ile satır korelasyon korelasyon katsayısı kaydedin. </li><li> IV eğrisi ile son derece ilişkilidir frekansları görselleştirmek için korelasyon katsayısı vs frekans çizilir. DC bileşeni FFT ilk frekansı içinde yer olduğundan, bu frekans için korelasyon katsayısı her zaman&gt; 0.99 olmalıdır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Temsilcisi voltaj kelepçe ölçümleri olmadan (Şekil 1A) ve gerilim adım protokolü içine yerleştirilir (Şekil 1B) bir gürültü fonksiyonu ile bir model hücre için gösterilmiştir. IV eğrisi modeli hücre (Şekil 1C) hesaplandı. Her süpürme, Şekil 1 kayıtları, FFT gürültü fonksiyonu takılı olduğu zaman diliminde (Şekil 1A, 1B kırmızı kutuya bakın) üzerinden hesaplanmıştır. Şekil 2A ve 2B sırasıyla Şekil 1A ve 1B gösterilen kayıtları için hesaplanan FFTs göstermektedir. DC bileşeni (kırmızı vurgulanmıştır) görsel inceleme üzerine, IV eğrisinin şekli taklit etmek için görünür. Gürültü fonksiyonu olmadan, DC yukarıdaki tüm frekansları genlikleri sıfır (Şekil 2A) yakın olduğu görülmektedir. Gürültü fonksiyonu takıldığında, 1 ve 15 kHz frekansları arasında görsel fark genlikleri (Şekil 2B). Şekil 3 IV eğrisi karşı gerilim adımları aralığında ayrı frekans genlikleri ilişkilendirme sonucu gösterir. Şekil 3A-C, deney, kontrol koşulları (gürültü fonksiyonu) altında ve sırasıyla 50 ve 100 mV gürültü genlikleri ile yapıldı korelasyon katsayıları gösterir. Bildirim, tüm durumlarda DC bileşeni IV eğrisi ile ilişkilendirmek için neredeyse mükemmel bir şekilde görünür. Gerçekten de, tüm kayıtlar için, bu frekans için korelasyon katsayısı 0.99 (R = 0,9996 ± 1E-5, ortalama ± standart sapma) daha fazlaydı. Şekil 3A (kontrol koşulları) baktığınızda, amplitüdünün IV eğrisi ile ilişkilidir DC bileşeni dışında herhangi bir frekansları vardır. Özellikle, bu frekansları hiçbiri 0.5 daha yüksek korelasyon katsayıları var. Düşük genlik gürültü fonksiyonu (50 mV) takılması üzerine, bu aynı frekansları hala korelasyon katsayıları 0.5 &#39;den daha az oldu. Için korelasyon katsayılarıgürültü genlik 100 mV arttı se frekansları da 0.5 &#39;den büyük haline vermedi. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Model Hücre Kayıtlar: Gerilim kelepçe kayıtları olmadan (1A) ve gerilim adım protokolü (1B) bir gürültü fonksiyonu ile bir model hücre için gösterilmiştir. Her süpürme ilk ve son 20 ms için, potansiyel tutma potansiyeli (0 mV) tutuldu. Her gerilim adım 80 ms uzun ve gürültü fonksiyonu adım başladıktan sonra 40 ms yerleştirildi. 30 ms gürültü fonksiyonu bir süre vardı ve 1 ile 15 kHz arasındaki frekansları içeren. Gerilim, fro, 5 mV artışlarla -150 ile +50 mV adım oldu. Model hücre için bir IV eğrisi de (1C) gösterilir. Kayıtları okumak için daha kolay hale getirmek için, sadece her beşinci süpürme 1A ve 1B dahil edildi, ancak tüm tarama 1C dahil edildi. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Kayıtların FFT: FFT gürültü fonksiyonu (kırmızı kutu Rakamlar 1A, 1B ile sınırlı alan) eklenecek her süpürme 30 ms kısmı için hesaplanan oldu. Şekil 2A ve 2B FFTs sırasıyla gürültü fonksiyonu olmadan ve hesaplanan göstermektedir. Bir kez daha, netlik, her beşinci süpürme sadece FFT resimde dahil, ancak tüm tarama gelecek hesaplamaları kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 IV Frekans Korelasyonlar: bir kayıt IV eğrisi ve gerilim adımları aralığında bireysel frekansları genliği arasındaki korelasyon sonuçları gösterilir. Rakamlar 1A - 1C sırasıyla kontrol şartlar altında 0 - 20 kHz frekansları, ve 50 veya 100 mV gürültü fonksiyonlarının varlığı korelasyon katsayısı, göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 IV Eğrisi Yeniden Oluşturma: IV eğrisi modeli hücre (Şekil 1C olarak aynı) ve iki frekans büyüklüğü üst üste edildi. Ilk frekans DC bileşen (R = 0.995), ve düşük korelasyon (R = 0,3212) ile ikinci, rastgele seçilmiş bir frekans oldu. IV eğrisi yaklaşık olarak aynı genlik frekans genlikleri ölçekli edildi.

<ol>
	<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mu]l+Na++channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells:+Biochemical+and+biophysical+properties.">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li><li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na++Channel.">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li><li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells.">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li><li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil,+D600,+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells.">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li><li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+Na/Ca+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2++Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block.">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li><li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels.">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li><li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge.">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li><li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells.">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li><li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy.">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li><li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+K+-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane.">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li><li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating.">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li><li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel.">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li><li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Properties+of+hERG+1a/1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome.">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li><li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle.">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li><li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones.">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li><li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na(+)+and+Li(+)+binding+sites+within+the+KcsA+pore.">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li></ol>

Daha sonra ne kadar mevcut her bir kanal tipi atfedilen olmalıdır belirlenmesi amacı ile aynı anda birden fazla iyon kanalı türleri ölçme halen araştırmacıların teknik engeller vardır. Bu sınırlama nedeniyle, iyon kanalları genellikle voltaj, akım, ve aksiyon potansiyel kelepçe gibi teknikler kullanarak tek tek okudu. Bireysel kanal tipleri, heterolog ifade sistemleri sıklıkla kullanılır incelemek için 1 2 kardiyomiyositler gibi dokusundan izole edilen hücreler , çalışırken başka yollarla çeşitli iyon kanalları engellemek için kullanılması gerekir. Örneğin, sodyum kanalları yavaş bir depolarizan gerilim rampası inaktive olabilir, 3 içe giderilmesi potasyum kanalları ekstrasellüler BaCl2 ile bloke edilebilir, 4 ve kalsiyum kanalları verapamil kullanılarak bloke edilebilir. 5 Kısmen bu sınırlama üstesinden kullanılan bir yöntem, ölçüm uygun bir ajan ile seçici bir kanal tipi engelleme sonra tekrar, aynı anda iki kanal türleri arasında mevcut akı ölçmek. Iki ölçüm Çıkarma sonra bloke edildi kanal tipi mevcut atfedilebilir miktarını tahmin etmek için kullanılır. 6 Bununla birlikte, bu tekniğin iki önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, kimyasal maddeler, seçici olarak her bir iyon kanalı engelleyebilirsiniz belirlenmiştir ve yaygın olarak kullanılan bazı ilaçlar, diğer kanal tipleri ile non-spesifik etkileşimlere sahip değil 5,7 İkincisi, bu tekniğin bir kanal başka bir modüle olup olmadığını belirlenecek olamaz kanal. Örneğin, sağ ventrikül yüksek Kır 2.1 ifade iletim hızı deprese böyle NAV 1.5 ve Kır 2.1 heterojen ifade kobay ventriküller gösterildiği olmuştur ve bu iki kanal arasında sinerjik bir ilişki var olduğu ileri sürülmektedir. Halen 8 , bu doğrulanmış olamaz. Bu çalışmada, biz bu empedans spektroskopi, eş zamanlı olarak ölçülür birden fazla iyon kanalı türleri çalışmak için yararlı bir araç olabileceğini düşündürmektedir. Sunulan yöntem akımları aynı anda iki kanal ölçülen türlerinden ayırt etmek için kullanılan olmamıştı rağmen, empedans spektroskopi iyon kanalı fonksiyonu diğer yönlerini bir dizi çalışma olmuştur. Goodman ve Sanat akım pensi protokolleri bir hücre farklı frekanslara ayarlamak için modifiye ve transmembran potansiyel salınımlar içe giderilmesi K + kanal ve Ca 2 + kanal arasında bir etkileşim nedeniyle olabilir ki kaplumbağa işitsel saç hücreleri kullanarak gösterdi. 9 Han ve Frazier empedans geniş bir frekans aralığında (100 Hz - 5 MHz) üzerinden tek bir hücrenin ölçülebilir gösterdi ve K + veya Ca 2 + kanalları bloke edildi basit bir araç olabilir empedans artış gözlenmiştir yüksek kapasiteli ilaç ekranlarında kanal blok tespit 10 Hayashi ve Fishman içe giderilmesi K + kanal 11 Diğer gruplar farklı kanal türleri gerilim kelepçe protokol tek bir frekans yerleştirilir ve kinetik özelliklerini incelemek için karmaşık iletkenlik gösterdi bazı frekanslarda değil, diğerleri için beklenen yanıt gözlenen frekans tepkisi ile anlaştı. 12,13 Millonas ve Hanck bazı frekanslar beklenen yanıt Markov modeli birden fazla hız sabitleri varlığı vermedi nedenle önerilen bu gibi 12 Çalışmaları diğerleri gibi, hem iyonik akımlar empedans spektroskopi kullanarak, iyon kanalları ölçülen teorik frekans tepkisi ile aynı fikirde değilim durumlarda olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada yöntemin amacı bağımsız membran elektrik devresi dayandığı varsayımları geçerli genliği ile korele frekanslarını tespit etmek çünkü bu çalışmada bir endişe değil. Furtheremore geçerli genliği, onları içine takılan herhangi bir gürültü işlevleri olmayan kayıtları bölümlerini hesaplanır. Diğer çalışmaların sayısı da çok sayıda iyon kanalları mevcut modeller kendi hız sabitleri ile çok sayıda iletken ve tel olmayan devletlerin sergileyen 14,15,16 Thompson ve ark KcsA kanal seçiciliği filtresi Na için farklı bağlanma yerleri olduğunu gösterdi +, Li +, ve K +, ve seçicilik filtresi ile bir iyon hamle olarak başka bir bağlayıcı sitesi hareketli enerjik maliyetleri kanal tercihen, gözenek ile K + iyonları yürütmek kılan ne.. 17 Bu çalışmada biz bir dizi takılı bir gerilim adım protokol frekansları (gürültü fonksiyonu) ve genliği çok genel geçerli genliği ile korele frekanslar için baktı. Güçlü kanıtlar öne sunulan bu yana birden fazla hız sabitleri, ayırıcı yoluyla iyonların iletim bir rol oynayabilirt kanalları, bu oran sabitleri ile ilişkili frekansları giriş belirli frekanslarda rezonansa ya da son derece geçerli genliği, aksi halde olmazdı ile korele neden olabilir. Bu çalışmada gösterilmiştir tekniği, genellikle gerilim kelepçe devresi ve satın alma ekipmanları test etmek için kullanılan bir paralel RC devresi, bir model hücresi, yapılır. DC dışında herhangi bir frekanslar mevcut büyüklüğü ile ilişkili olacağını ve bu verileri gösterilir. Ayrıca gürültü fonksiyonunun yanı sıra, herhangi bir frekansları son derece geçerli genliği ile korele neden olmadığını göstermektedir. Bu iki bulgu, ölçüm cihazları ve gürültü fonksiyonu, herhangi bir frekanslar geçerli genliği ile ilişkilendirmek için neden kendileri olmadığını gösteriyor, çünkü kritik öneme sahiptir. Gelecekteki çalışmalar iyon kanalları içeren membranlar kullanarak ölçümler yaparken, kullanılan kanal bağlı olarak, seçicilik filtresi ya da muhtemelen gözenek hız sabitleri karşılık frekansları kanal frekans cevabı etkisi ve frekanslar, yüksek hangi etkilemez, bu bekleniyor geçerli genliği ya da düşük korelasyon. Bu yöntem iyon kanalları çalışmak için yeni bir teknik olduğu için, gelecek çalışmaları takip yönde bir dizi vardır. İlk olarak, teknik belirli izole kanallarının frekans tepkisi karakterize etmek için kullanılmalıdır. Ek iş, aynı zamanda mevcut genlikleri frekans genlikleri kalibre etmek için yapılması gerekiyor. Birden fazla kanal ayrı ayrı karakterize sonra, birden fazla kanal türleri aynı anda ölçülmelidir. Bu teknik, aynı zamanda aksiyon potansiyeli kelepçe, kelepçe akımı, ve alan stimülasyonu çalışmaları kullanmak için adapte olabilir. Bu yeni bir teknik olmasına rağmen, daha önce mümkün değildi elektrofizyolojik ölçümler yapmak ve iyon kanalları fizyolojik rolü içine değerli yeni anlayışlar sağlamak için güçlü bir yol ne olabilir gösterir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>n/a</td>
<td>Natick, MA</td>
</tr>
<tr>
<td>Clampex 8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Clampex 8</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Integrating Patch Clamp Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>CV202</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

GİRİŞ: Halen, aynı anda birden fazla iyon kanalı türleri ölçmek ve her kanal tipi atfedilebilecek parçaya ölçülen akım ayrıştırmak için kurulan yöntemleri vardır. Bu çalışmada, yüksek gerilim kelepçe deneyler sırasında ölçülen kararlı durum geçerli genliği ile korele belirli frekanslarda empedans spektroskopi tanımlamak için kullanılır nasıl olabilir göstermektedir. Bu yöntem, belirli frekanslarda gerilim adım protokolü içeren bir gürültü fonksiyonu ekleyerek içerir. Sunulan çalışmada, bir model hücre yüksek korelasyon hiçbir iyon kanalları mevcut gürültü fonksiyonu kendisi herhangi bir yüksek korelasyon tanıtmak olmadığını gerilim kelepçe devresi tarafından tanıtıldı ve olduğunu göstermek için kullanılır. Bu doğrulama tekniği iyon kanalları içeren preparatlar uygulanabilir önce gereklidir. Sunulan protokolün amacı, bir gürültü fonksiyonu tek bir iyon kanal tipi frekans tepkisini karakterize nasıl göstermek için. Belirli frekansları tek bir kanal tipi tespit edildikten sonra, onlar, kararlı hal akımı gerilim (IV) eğrisi üretmek için kullanılabilir. Daha sonra yüksek bir kanal türü ile ilişkilidir ve minimal diğer kanal türleri ile korele Frekanslar, eş zamanlı olarak ölçülür birden fazla kanal türleri geçerli katkısını tahmin etmek de kullanılıyor olabilir. YÖNTEM: Gerilim kelepçe ölçümleri, standart bir gerilim adım protokolü (-150 ile +50 mV, 5mV adım) kullanarak bir model hücre yapıldı. 1-15 kHz frekansları (sıfır tepe genlikleri: 50 veya 100mV) eşit büyüklükleri içeren Gürültü fonksiyonları gerilim her adım içine yerleştirildi. Çıkış sinyali Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) gerçek bir bileşeni olan ve her adımı potansiyelini için gürültü olmadan hesaplanmıştır. Her frekansın bir fonksiyonu olarak gerilim adım büyüklüğü ilgili gerilimler geçerli genliği ile orantılı idi. SONUÇ VE ÖNERİLER: gürültü olmaması (kontrol), DC bileşeni dışındaki tüm frekansları büyüklükleri korelasyon zayıf (| R | &lt;0.5) IV eğrisi ile, tüm ölçümlerde korelasyon katsayısı 0,999 &#39;den büyük bir DC bileşeni oysa. Bireysel frekansları ve IV eğrisi arasındaki korelasyon kaliteli bir gürültü fonksiyonu gerilim adım protokolü eklendiğinde bir değişiklik olmadı. Aynı şekilde, gürültü fonksiyonunun genliği artan bir ilişki artırmak vermedi. Kontrol ölçümleri tek başına gerilim kelepçe devre 0 Hz üstünde frekansları son derece kararlı durum IV eğrisi ile ilişkilendirmek için neden olmadığını göstermektedir. Aynı şekilde, gürültü fonksiyon varlığı ölçümleri, gürültü fonksiyonu, hiçbir iyon kanalları zaman herhangi bir 0 Hz üstünde frekansları kararlı durum IV eğrisi ile ilişkilendirmek için neden olmadığını göstermektedir. Bu doğrulama yöntemi artık genlikleri özellikle bu kanal tipi ile korelasyon tespit frekansları amacı ile tek bir iyon kanal tipi içeren preparatlar uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components at JoVE.com

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

Aynı anda birden fazla iyon kanalları aracılığıyla mevcut akı ölçüm teknik engeller ve transmembran akım daha sonra seçici hangi bölümünü her kanal tipi nedeniyle. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu yöntem belirli frekans bileşenleri kullanarak tek tek kanal türleri IV eğrisi oluşturmak için bir yol sunar.

Frekans Bileşenleri kullanarak bir İyon Kanal IV Eğrisi, Rekapitülasyon

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Görüntüleme.  University of Utah. Aynı anda birden fazla iyon kanalları aracılığıyla mevcut akı ölçüm teknik engeller ve transmembran akım daha sonra seçici hangi bölümünü her kanal tipi nedeniyle. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu yöntem belirli frekans bileşenleri kullanarak tek tek kanal türleri IV eğrisi oluşturmak için bir yol sunar.

Video: Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...