BBSRC gelen finansman nazikçe kabul edilmektedir (hibe sayısı BB H011293 / 1).

Genel bakış Bölüm 1 pH duyarlı nanosensors ve SEM ile floresan spektrometrisi ve boyutu kullanılarak pH nanosensor yanıtın karakterizasyonu hazırlanmasını tarif etmektedir. Bölüm 2 electrospun polimer iskeleler ve SEM kullanılarak morfoloji ve büyüklüğü karakterizasyonu hazırlanmasını tarif etmektedir. Bölüm 2 de pH duyarlı nanosensors dahil edilmesi ile electrospun iskeleleri kendinden raporlama iskelelerinin hazırlanmasını tarif etmektedir. Elde edilen öz raporlama iskeleleri electrospun liflerin herhangi bir morfolojik değişiklikler oluşup oluşmadığını belirlemek için SEM ile karakterize edilir. Dahil nanosensors kaynaklanan kendi kendine raporlama iskeleler floresan konfokal mikroskobu ile tespit edilir. Bölüm 3 electrospun iskele ve self-raporlama iskele üzerinde hücrelerin kültür açıklar. Iskeleleri ilk preparat sterilize ediliriskeleleri sterilizasyon ve hücrelerin kültür self-raporlama iskelelerinin floresan yeteneğini etkileyip etkilemediğini belirlemek için değerlendirilir hücre kültürü aşağıdaki için iyon. Bu protokol, aynı zamanda electrospun iskeleler üzerine kültürlenir hücrelere nanosensors teslimat açıklanmaktadır. Lysotracker boya nanosensors hücresel asidik bölmelere alınmamış olmasını sağlamak için kullanılır. 1.. Hazırlama ve pH Duyarlı Sol-jel nanosensors analizi PH Duyarlı Sol-jel nanosensors 1.1 Hazırlanması Not: Bu preparasyon, bir çeker ocak içinde yapılmalıdır. <ol><li> (And-6)-carboxyfluorescein, süksinimidil ester dimetilformamid (FAM-SE) (1.5 mg) (DMF) (1 mi), yuvarlak balon içinde ve 6-karboksitetrametilrodamin dipli - 5 çözülmesiyle pH nanosensors içinde kullanılmak için florofor hazırlanması Başka bir turu succinimidyl ester DMF (TAMRA-SE) (1.5 mg) (1 mi) tabanlı bir balon.Her şişeye 3-aminopropiltrietoksisilan (APTES) (1.5 mL) ekleyin ve karanlıkta 24 saat boyunca bir kuru azot atmosferi (21 ° C) altında karıştırılmıştır, yani folyo ile örnekleri sarın. </li><li> Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde etanol (6 mi) ve amonyum hidroksit (ağırlıkça% 30, 4 mi) yukarıdaki boyaların (250 | il) her iki ilave edin ve 1 saat (21 ° C) karıştırılır. </li><li> Yavaş yavaş ilave bir 2 saat daha karıştırmaya devam edilir, karışıma tetraethylorthosilicate (TEOS) (0.5 ml) ekleyin. Karışım bulutlu dönecek. Nanosensors döner buharlaştırma ile toplanabilir. Nanosensors ileride kullanılmak üzere 4 ° C&#39;de o cam bir şişe içinde muhafaza edilebilir. DİKKAT: ve bunların kuru formda nanosensors ayrıca ele bir çeker ocak içinde, bir ya da denge Weighsafe örneğin kapalı olmalıdır tartılmaları durumunda gerçekleştirilmelidir. </li></ol> PH 1.2 Nanosensor cevap <ol><li> MIXI ile pH 5,5-8,0 arasında değişen Sørensen fosfat tampon çözeltiler hazırlamaksodyum fosfat monobazik (0.2 M) ve sodyum fosfat dibazik (0.2 M) stok çözeltileri ng özel oranları. Bir pH metre kullanılarak nihai pH değeri kontrol edilir. , Sodyum hidroksit (NaOH) (4 M) veya hidroklorik asit (HCI) (2 M) kullanılarak pH herhangi bir küçük ayarlamaları yapın. </li><li> Çözelti bulanık hale gelene kadar daha sonra ilk olarak bir ultrasonicator olarak damar daldırarak 3 dakika boyunca bir girdap nanosensor çözeltiyi içeren kaba tutarak pH tampon (5 mg / ml) &#39;de pH Nanosensors Askıya (yaklaşık 5 dakika). Çözelti içinde tamamen Nanosensors askıya için bu adımları tekrarlayın. </li><li> Optik bir küvet içinde, ilk solüsyonu koyun ve 5 için 488 nm eksitasyon dalga boyları kullanımı - (and-6)-karboksiflüoresein (FAM) ve 6-karboksitetrametilrodamin (TAMRA) için 568 nm. FAM ve TAMRA flöresanlı bir spektrometre kullanılarak 558-580 nm için 500-530 nm&#39;de emisyon dalga boylarını toplayın. </li><li> PH, farklı pH değerinde gözlenen böylece optik küvet içinde çözüm değiştirin ve c devamemisyon spektrumunu ollecting. </li><li> Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için her bir pH değeri ile üretilen emisyon maksimumunun oranını hesaplar. </li></ol> Nanosensors 1.3 SEM <ol><li> Bir karbon kaplı elektron mikroskobu kütüğü üzerine nanosensors bir numunesi yerleştirin ve bir argon atmosferi altında 5 dakika boyunca altın ile kat püskürtmeyle çökeltilmesi. </li><li> Elektron mikroskobu (SEM) tarayarak gözlemlemek. Elektron şarj (Şekil 1) en aza indirmek için çalışma mesafesi, gerilim ve büyütmeyi ayarlayabilirsiniz görüntüleme sırasında. </li></ol> 2. PLGA iskelelerinin hazırlanması ve analizi 2.1 Elektrospinning PLGA iskeleleri <ol><li> Bir çeker ocak içinde poli piridinyum format ile diklorometan (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) (DCM) (% 20 (a / a)) (PF) (% 1 (ağ / ağ)) çözülür. 18 G künt dolgu iğnesi ve bir şırınga pompası güvenli uygun bir 10 ml şırınganın içine çözüm yerleştirin. </li><li> 20 cm uzakta bir 20 iğne ucu Uzaklıkcm x 15 cm alüminyum toplama plakası. </li><li> Alüminyum toplama plakasına şırınga ve yerin ucu için yüksek voltajlı güç kaynağının elektrodu takın. DİKKAT: Bakım gibi yüksek gerilim yani her Elektroeğirme ekipmanın herhangi bir işlem yapmadan önce elektrik beslemesini kapatın kullanılır alınmalıdır. </li><li> 2 saat boyunca 12 kV, 3.5 m / s arasında sürekli bir akış oranı kullanılarak bir çözüm sunar. Bu koşullar kullanılarak elektroeğirme yaklaşık 60 mikron bir iskele derinlik verecektir. </li><li> Tortu, çözücünün buharlaşmasına izin vermek için 24 saat boyunca, bir çeker ocak içinde iskele bırakın. </li></ol> 2.2 Elektrospinning pH Duyarlı PLGA iskeleleri <ol><li> Bölüm 2.1 &#39;de, ancak, polimer çözeltisi (5 mg / ml) için Nanosensors eklenmesi modifikasyonu ile tarif edildiği gibi, pH duyarlı Nanosensors içeren iskeleleri hazırlayın. Ultrasonikasyon yardımı ile PLGA çözelti içinde Nanosensors Askıya (yaklaşık 5 dak) önce<html> Bir 10 ml şırınga içine yerleştiriyor. </li></ol> 2.3 PLGA İskele SEM ve pH Duyarlı İskele <ol><li> Bir karbon kaplı elektron mikroskobu kütüğü üzerine PLGA iskele veya iskelenin pH duyarlı bir örnek koyun ve nanosensors SEM (Şekil 1) için tarif edildiği gibi devam edin. </li></ol> PH Duyarlı İskele 2.4 Kalibrasyon <ol><li> 35 mm kültür plaka içine pH duyarlı iskele bir örnek yerleştirin ve uygun tampon solüsyonuna batırmayın. </li><li> Konfokal mikroskop nanosensors içinde TAMRA heyecanlandırmak için FAM ve 568 nm Kripton lazer heyecanlandırmak için bir 488 nm argon lazer kullanır. FAM ve TAMRA için 558-580 nm için 500-530 nm pH duyarlı iskeleleri için floresan emisyon gözlemleyin. (Şekil 2). Uyarma dalga boyları toplanmasını önlemek için sıralı tarama kullanın. </li></ol> 3. PLGA iskelelerinin ve pH Duyarlı PLGA iskelelerinin üzerine Hücre Kültürü ntent &quot;&gt; Not: Aşağıdaki, bir hücre kültürü kabininde yapılmalıdır. Hücre Kültür PLGA iskelelerinin 3.1 Hazırlık <ol><li> 2 cm 2 adet içine PLGA veya pH duyarlı PLGA iskeleleri kesti. </li><li> 15 dakika boyunca her bir yan 8 cm&#39;lik bir mesafede ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakılarak sterilize iskele. </li><li> 12 oyuklu bir kültür plakasına iskeleleri aktarın ve üstüne bir çelik halka yerleştirin. (% 5 v / v) içine fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ve çelik halkanın dışında, bir gece boyunca inkübe Penisilin / Streptomisin bir solüsyonu (37 ° C,% 5 CO2). 2 cm dış çap, 1 cm iç çapa, 1 cm derinlik: çelik halka Nottingham Üniversitesi üretilmiş ve aşağıdaki boyutlara sahiptir edin. </li><li> Sterilize çözüm çıkarın ve PBS ile yıkayın. </li><li> (500 ul) ve dış (500 ul) çelik halkanın, bir kuluçka makinesi içinde yer (37 ° C,% 5 CO2 içine hücre kültürü ortamı ekleme </sub&gt;) bir hücre süspansiyonu hazırlama iken. </li><li> Bir hücre süspansiyonu hazırlamak ve Tripan Mavisi dışlama deneyi kullanılarak bir hücre sayımı gerçekleştirin. </li><li> 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir hücre sayısı elde etmek için bir hücre süspansiyonu oluşturmak. </li><li> Çelik halkanın iç ve dış ortamları çıkarın. </li><li> Çelik halka (1 m) dış tarafında, önceden ısıtılmış, hücre kültür ortamı ile değiştirin. </li><li> Çelik halkanın içine hücre süspansiyonu 300 ul ekleyin - kaya plaka geriye ve ileriye doğru hafifçe hücrelerini dağıtmak için. </li><li> Bir inkübatör içine hücre kültürü plakasını (37 ° C,% 5 CO 2) - her 2-3 gün medyayı ferahlatıcı - hücre eki ancak sürece deney gerektirdiği için kültürü devam 24 saat içinde yer almış olmalıdır. </li></ol> PLGA İskele üzerine kültür hücreleri 3.2 Nanosensor Teslim <ol><li> Bölüm 3.1 &#39;de açıklandığı gibi PLGA iskele üzerine tohum hücreleri. Bu çalışmada boş PLGA iskele (değil konteyneri içingörüntülerken, belirli lama nanosensors) dolayı floresan emisyonu üst üste için kullanılmıştır. </li><li> (37 ° C,% 5 CO2) 72 saat için, hücreler önce teslim nanosensor iskele boyunca büyümeye ve geçiş sağlamak için bir inkübatör içine hücre tohumlanır iskele yerleştirin. </li><li> Teslim nanosensor önce 1 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO2) inkübe, hücrelerin PBS ile yıkayın ve standart kültür ortamından antibiyotik ve serumsuz ortam bir ortam. Not: 3T3 hücreleri standart kültür ortamı fetal dana serumu (10% (v / v)), L-glutamin çözeltisi (2 mM), penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle ortamı ihtiva eder: (1% (v / v)) . </li><li> Kuluçka süresi boyunca kısa bir çözelti oluşturmak için A Optimem (50 ul) ile Nanosensors (5 mg) ile sonike nanosensor-lipozom kompleksinin hazırlanması </li><li> Optimem (45 ul) ile Lipofectamine 2000 (5 ul) eklenerek çözelti B oluşturma, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Çözeltisi ekleyinBir çözelti B, nanosensor-lipozom kompleksi oluşturmak için C çözeltisi, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Hücrelere çözeltisi C (100 ul) ilave edilir ve 3 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edilir. </li><li> Inkübatör, aspirat ortamından hücre tohumlandı iskeleleri çıkarın ve konfokal mikroskopi ile canlı hücre görülmesine olanak sağlamak üzere PBS (1 mi) ilave edilmeden önce iki kez PBS ile yıkayın. Not: Farklı pH kalibrasyon yapılmaktadır çünkü hücre kültür ortamında bulunan fenol kırmızı göstergesi de otoflüoresanı neden yoktu ki PBS bu protokolü kullanılmıştır. Ancak fenol kırmızısız medya hücre kültürlerinin uzun dönemli analizi için kullanılabilir. </li><li> Farklı pH tampon içine hücre tohumlanır iskele daldırın ve hücreler ile bağlantılı nanosensors tepkisini denetleyecektir. </li><li> Konfokal mikroskopi (Figu kullanarak floresan gözlemleyerek FAM ve TAMRA gelen floresan yoğunluklarının oranının saptanmasıyla PHI Monitörre 3). </li></ol> Memeli Hücreleri içinde 3.3 Nanosensor Yer <ol><li> Gibi, bölüm 3.2 &#39;de anlatıldığı yalnızca FAM boya (TAMRA floresan emisyonu Lysotracker kırmızı aynı spektral bölgede olduğu için bu) ihtiva eden nanosensors hücreleri inkübe edin. Bölüm 1.1 &#39;de, ancak hazırlanması ve TAMRA ekleme ihmal ile tarif edildiği gibi, bu Nanosensors hazırlayın. </li><li> Nanosensor teslim döneminin ardından 50 nM Lysotracker Kırmızı stok solüsyonu sulandırmak. </li><li> PLGA iskeleler üzerine kültürlü hücrelere seyreltilmiş solüsyon (2 ul) bir kısım ekleyin. </li><li> 1 saat (37 ° C,% 5 CO2) için Lysotracker Kırmızı hücreler inkübe edin. </li><li> Kuluçka döneminden sonra ortamını çıkarın ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntüleme için hazırlık olarak (pH 7.4) (2 mi) PBS ortamı değiştirmeden önce PBS (pH 7.4) ile iki kez hücreleri yıkayın. Not: Fenol kırmızı boş ortam yerine PBS ile kullanılabilir. </li><li> Nükleer leke Dra eklemePBS Q5, böylece son konsantrasyonu 5 uM ve 3 dakika boyunca (37 ° C,% 5 CO2) için hücreler ile inkübe olduğunu. Bu Draq5 ile kuluçka döneminden sonra ortam değiştirme gerekli değildir. </li><li> 650, sadece nanosensors Draq5 kromofora heyecanlandırmak ve 500-530 nm, 580-600 nm floresan gözlemlemek için Lysotracker Kırmızı ve 633 nm helyum / neon lazer heyecanlandırmak için bir 568 nm Kripton lazer FAM heyecanlandırmak için bir 488 nm argon lazer kullanmak -750 (Şekil 3), sırasıyla nm. Uyarma dalga boyları toplanmasını önlemek için sıralı tarama kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold.">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li><li>Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precoating+of+elastomeric+tissue-engineering+scaffolds+increased+cellularity,+enhanced+extracellular+matrix+protein+production,+and+differentially+regulated+the+phenotypes+of+circulating+endothelial+progenitor+cells.">Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).</li><li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering.">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).</li><li>Li, D., Xia, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+nanofibers:+Reinventing+the+wheel?.">Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?.</a> Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).</li><li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro+spinning:+Applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).</li><li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications:+A+review.">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review.</a> Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).</li><li>Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+3D+in+vitro+cell+aggregation+using+an+optical+imaging+system.">In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).</li><li>Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Response+to+Interstitial+Flow:+A+State-of-the-Art+Review.">Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).</li><li>Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+tools+for+tissue+engineering.">Enabling tools for tissue engineering.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).</li><li>You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+degradation+behaviour+of+non-porous+ultra-fine+poly(glycolic+acid)/poly(L-lactic+acid)+fibres+and+porous+ultra-fine+poly(glycolic+acid)+fibres.">In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres.</a> Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).</li><li>Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+degradation+behaviors+of+electrospun+PGA,+PLGA+and+P(LLA-CL)+nanofibers+cultured+with/without+cell+culture.">Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture.</a> Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).</li><li>Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+glucose+monitoring+and+control+in+a+rotating+wall+perfused+bioreactor.">Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).</li><li>Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+PLGA+fibre+sheets+incorporating+fluorescent+nanosensors:+self-reporting+scaffolds+for+application+in+tissue+engineering.">Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering.</a> Analytical Methods. 5 (1), (2013).</li><li>Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+membranes+for+highly+sensitive+optical+sensors.">Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors.</a> Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).</li><li>Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+fluorescent+monitoring+of+the+degradation+of+polymeric+scaffolds+for+tissue+engineering.">On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering.</a> Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).</li><li>Blackwood, K. A., McKean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).</li><li>Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fiber+diameter+and+orientation+on+fibroblast+morphology+and+proliferation+on+electrospun+poly(D,L-lactic-co-glycolic+acid)+meshes.">Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes.</a> Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).</li><li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+structure:+A+novel+scaffold+for+tissue+engineering.">Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).</li><li>Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+scaffold+degradation+rate+on+three-dimensional+cell+growth+and+angiogenesis.">The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis.</a> Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Doku mühendisliği, özel bir doku ya da organ işlevi, onarım, değiştirme korumak veya geliştirmek için in vitro modellerde olduğu gibi, in vivo doku ve doku replasman tedavisi olarak hem de kullanılabileceğini biyolojik yerine geçen oluşturmak hedeflemektedir. Uzun yıllar değiştirmek veya dokuların onarımı yardım ancak bu genellikle nedeniyle sonunda reddi ya da daha fazla revizyon neden olan ana dokusu ve / ya da enfeksiyon ile zayıf entegrasyon başarısız için senteti...

Doku mühendisliğinde önemli bir strateji morfolojisi yerine gidiyor doku benzer ve aynı zamanda hücre büyümesi ve fonksiyonu 1,2 destekleyebilen iskeleleri imal etmek için biyouyumlu malzemelerin kullanılmasıdır. Iskele hücre bağlanması ve çoğalması henüz 3D hücresel yapının deliklerinden boyunca hücre göçü veriyor vererek mekanik destek sağlar. Skafold, aynı zamanda hücre besinlerin kütle taşınması için izin vermek ve metabolik atık 3 çıkarılmasını önleyen olmamalıdır. Elektro-hücre büyümesi 4-6 destekleme kapasitesine sahip polimerik iskelesinin imalatı için umut verici bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Genellikle gözenekli ve 3D hücresel yapı 7&#39;nin boşlukları boyunca hücre-hücre etkileşim hem de hücre göçünü sağlar olarak üretilen dokuma olmayan lifler electrospun hücre büyümesi için uygundur. Bu t sırasında hücre canlılığı izlemek için önemlidirO kültür dönemi ve o hücre canlılığı sağlamak için 3D yapının tamamı boyunca korunur. Analit konsantrasyonunda geçişlerini 3D yapısı içinde bulunabilir Örneğin, bu oksijen ve pH gibi kültür koşulları, dikkatli kontrolü gerektirir. Biyoreaktörler veya perfüzyon sistemleri interstisyel akış vivo koşullarda ve bir sonuç artış besin transferi ve metabolik atık temizleme 8 olarak taklit etmek için kullanılabilir. Bu tür sistemleri sürekli microenvironmental koşulları sağlamak olup olmadığı sorusu gerçek zamanlı hücresel mikroçevreyi değerlendirerek ele alınabilir. Gerçek zamanlı olarak takip edilebilir anahtar mikro çevre ölçümler şunlardır: sıcaklık, hücre ortamının kimyasal bileşimi, çözünmüş oksijen ve karbon dioksit konsantrasyonu, pH, ve nem. Bu ölçütlerin, sıcaklık en kolay yerinde sondaları kullanılarak izlenebilir. Yaygın kalan listelenen ölçümleri izlenmesi için yöntemlerBu nedenle hızlı uzun vadeli örnekleme için bir alikot çıkarılması ve hücre kültürü rahatsız ve kirlenme riskini artırır. Sürekli, gerçek zamanlı yöntemler aranmaktadır. Şu an izleme yöntemleri genellikle fiziksel bir pH monitörü veya oksijen sondası gibi hücresel yapıyı soruşturma araçların güvenmek. Ancak, bu müdahaleci yöntemler hücresel yapı hasar ve devam eden deneme rahatsız edebilir. 3D yapı içindeki analit konsantrasyonlarının Noninvasive izlenmesi gibi besin tüketme 9 gibi çeşitli çevresel yönleri gerçek zamanlı izleme olanak verebilir. Bu yapı içinde daha derin bölgelere besin kaynağının değerlendirilmesine olanak ve metabolik atıkların etkin 10,11 kaldırılıyor olup olmadığını belirleyecek. Invazivliğinin sorunu gidermek için girişimde sistemleri genellikle pH, oksijen izlemek ve 12 glikoz kültür geminin hem aracılığıyla ve dış sensörler kültür ortamı geçer bir perfüzyon odasının kullanımını içerir.Yeniden örnekleme için doğrudan bir alikotunun kaldırılmasını gerektirmeyen ve bu gibi in situ izlenmesi sağlayacak bir kültür kabı içine entegre edilebilir sensörleri gelişmekte olan artan bir ilgi. Yerinde ve öz-raporlama iskeleleri 13 üretmek için electrospun iskelelerinin içine analit duyarlı Nanosensors dahil etmişlerdir microenvironmental koşulları noninvaziv izlenmesi için böyle eksiklikleri gidermek için. Algılama cihazı elektroeğirme önce veya iskele oluşumu 14,15 için polimer içine dahil edilen bir analit duyarlı boyanın kullanımı ile oluşturulan gerçek polimer iskele ya da olduğu yerde floresan etkinliğini izleme ile olduğu gibi hareket algılama cihazları iskeleleri, daha önce hazırlanmış . Ancak, bu algılama cihazları diğer analitlerin olası parazit neden olduğu hatalı optik çıkış vermek için potansiyele sahiptir. Bir rasyometrik algılama cihazı su kullanımıAçıklanan protokol hazırlanan bileşikler gibi ch bu olası yan etkilerinin ortadan kaldırılması ve söz konusu analite özel bir yanıt sağlamak için potansiyele sahiptir. Burada sunulan electrospun iskeleleri nedeniyle seçilen sentetik bir ko-polimer, poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) dan hazırlanmıştır Gıda ve İlaç bunun biyolojik olarak indirgenebilen biyolojik uyumlu ve özellikleri nedeniyle İdaresi (FDA) ve bir parça olan çeşitli hücre tipleri 16-18 büyümesini ve işlevini destekleyen kaydı. Hazırlanan rasyometrik analit duyarlı nanosensors pH duyarlı. Nanosensors bir boya FAM pH&#39;a duyarlı ve diğer biyolojik olarak uyumlu olan bir sol-jel matris, iki floresan boyalar dahil, TAMRA bu pH&#39;a duyarlı değil gibi bir iç standart olarak işlev görür. Önemli ölçüde üst üste olmayan Dahası FAM ve TAMRA hem de floresan ayrı ayrı analiz edilebilir. Floresan emi oranının belirlenmesiBelirli bir dalga boyunda her iki boya salgılanması diğer çevresel koşullardan bağımsız bir pH tepki verir. Self-raporlama iskeleleri geliştirilen 3D modeli bozmadan yerinde ve gerçek-zamanlı olarak pH tekrar değerlendirilmesine izin verebilir. Bunların iskeleleri hücre eki ve çoğalmasını destekleme yeteneğine sahip olan ve söz konusu analit için duyarlı kalmasını olduğunu göstermiştir. Mühendislik yapıları yan ürünlerin asidik kinetik ilgili yeterli kalır ve gibi pH duyarlı iskeleleri kullanarak büyük ölçüde bu tür çalışmalar, 19 kolaylaştırabilir. Bundan başka, doku mühendisliği uygulamaları için kendiliğinden raporlama iskelelerinin kullanılması olanağı tamamen anlamak izleme ve in vitro olarak 3D modeli yapılarının doku büyümesini, invaziv olmayan ve gerçek zamanlı olarak optimize etmek için sunulur. PH duyarlı nanosensors da electrospun PLGA inşaat iskelelerinde üzerine kültüre fibroblast hücre içi ortama teslim edilmiştirds. Boyaların floresans emisyon oranı phi izlenmesi için kullanılan ve bir kendi kendine raporlama iskele ile birleşik pH nanosensors karşılaştırıldı. 3 boyutlu bir ortamda kültürlenen hücrelere nanosensors teslim derin yıkıcı olmayan bir şekilde bir yapı içindeki analit konsantrasyonunun izlenmesine olanak verebilir. Bu nedenle nanosensors nondestructively 3D boyunca hücre davranışlarını değerlendirmek için uygun bir görüntüleme aracı uzun vadeli analiz sağlayan yapıları olabilir. 3 boyutlu yapısı içindeki tek tek hücrelerin analit konsantrasyonunun tarama bunlar yeterli besin ve oksijen konsantrasyonları alma emin olabilir. İzleme proses parametreleri oksijen ve besin maddelerinin etkin kitle taşımacılığı için standart tekniklerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Hücre içi ortamı ve bir polimerik içine iskeleler nanosensors dahil edilmesine nanosensors teslimat 3D Kat içinde hücre canlılığının bir değerlendirme olarak iskele performansı sağlamak için birleştirilebilirdoku büyüme sürecinde Ructs. Bu, bu yapıların artan bilgi yol ve biyolojik ilgili doku vekalet imalat ilerleme olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

Uygun desteği üzerinde 3D ​​kültürlenmesi Hücreler daha iyi in vivo mikro taklit eden ve hücre-hücre etkileşimi geliştirmek için düşünülmektedir. Elde edilen 3D hücresel yapı, genellikle 2 boyutlu olarak incelenmiştir benzer deneyler daha moleküler olayları ve hücre-hücre etkileşimleri incelemek için daha uygun olabilir. Iskele boyunca yüksek hücre yaşayabilirliği ile etkin bir 3 boyutlu kültürleri oluşturmak için, oksijen ve dikkatli bir analit konsantrasyonunu gradyanlar gibi pH kontrol edilmesi ihtiyacı gibi kültür koşulları 3D yapısı boyunca mevcut olabilir. Burada poli memeli hücre kültürü için daha sonraki hazırlama ile birlikte (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) electrospun iskelesi olarak biyo-uyumlu bir pH duyarlı sol-jel Nanosensors ve birleşme hazırlama yöntemlerini tarif eder. PH duyarlı bir 3 boyutlu iskeleler, hücresel yapı içinde microenvironmental pH değerinin belirlenmesi için bir araç olarak kullanılabilir. Ayrıca, detay pH duyarlı nanose ve Teslimatbüyüme electrospun PLGA iskeleler ile desteklenmiştir memeli hücrelerinin hücre içi ortamı için nsors. PH duyarlı nanosensors sitoplazmik yer eden deney sırasında hücre içi pH (pHi) izlemek için kullanılabilir.

Hazırlanan pH duyarlı nanosensors boyut dağılımı görüntülü nanosensors nüfus ölçülür ve 240-470 nm&#39;de (Şekil 1A) aralığında nanometre boyutlara sahip olduğu bulunmuştur SEM, ile karakterize edilmiştir. Dar ve uygun küçük çaplı başarı nanopartiküller hazırlamak için Stöber yöntemine ile tutarlıdır. Asidik koşullar kullanılarak Müstahzar parçacık boyutu geniş bir dağılım oluşturur ise nanopartiküller Stöber yöntemi kullanılarak nanopartiküllerin sente...

Watch this Scientific Journal Video about Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture at JoVE.com

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Biyo-uyumlu pH duyarlı sol-jel nanosensors poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) electrospun iskeleleri katılabilecektir. Üretilen kendi-rapor iskeleleri iskelesi üzerinde hücrelerin kültürlenmesi iken microenvironmental durumların in situ izlenmesi için de kullanılabilir. 3D hücresel yapı deneyi bozmadan gerçek zamanlı olarak izlenebilir edildiğinden bu durum yararlıdır.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

self-reporting-scaffolds-for-3-dimensional-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Görüntüleme.  University of Nottingham.  Biyo-uyumlu pH duyarlı sol-jel nanosensors poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) electrospun iskeleleri katılabilecektir. Üretilen kendi-rapor iskeleleri iskelesi üzerinde hücrelerin kültürlenmesi iken microenvironmental durumların in situ izlenmesi için de kullanılabilir. 3D hücresel yapı deneyi bozmadan gerçek zamanlı olarak izlenebilir edildiğinden bu durum yararlıdır. 

Video: Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

Elastomerik PGS Arter Doku Mühendisliği Yapı iskeleleri

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Proteolitik Degradable 3 Boyutlu Sistem Yumurtalık Folikül Encapsulation ve Kültür Bir Yöntem

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Aktif Hücre Kültürü Şekil Bellek Polimerler

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...