Travma Mekaniği Ordu-UNL Merkezi (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr Namas Chandra), UNL Layman Ödülü (26-1110-0033 -001 Yazarlar fon kaynaklarına teşekkür etmek istiyorum , PI: Lim).

1. Nöronal Hücre Kültürü <ol><li> Nöron hücreleri, astrositler, ve bunların eş-kültür dahil beyin hücreleri bir hücre modeli olarak kullanılabilir. Bir fizibilite gösterisi olarak, hücre hattı nöronal hücrelerin dürtüsel basınçlandırılması sunulmuştur. </li><li> SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde (ATCC, CRL-2266) 18 mm çapında cam lameller üzerine kültüre. Hücreler 3 yoğunluğunda ekilmiş olan × DMEM oluşan büyüme ortamı kullanılarak 10 3 hücre / cm 2% 10 fetal bovin serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye. Hücre kültürlerinde cam slaytlar 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör tutulur </li><li> SH-SY5Y nöronal hücrelerin hücre farklılaşması elde etmek için, hücreler daha fazla medya ile 7 gün için 10 uM retinoik asit (RA) ile desteklenmiş ortam ile muamele edilir iki günde bir değiştirildi. 7. gün, hücreleri basınçlı olmaya hazırız. </li></ol> 2. Basınçlandırma Ekipmanı: Kolsky Bar <ol><li> Kolsky bar, de1949 yılında Kolsky 1 ile veloped, çok yüksek bir yükleme hızında bir malzemenin mekanik özelliğini ölçmek için kullanılmıştır. Cihaz çubuklar arasındaki temas halinde yerleştirilen bir örnek ile iki çubuk oluşur. Olay çubuğunda oluşturduğunuz bir stres dalgası, dalga yansıyan ve iletilen dalga böler örnek yayar. Örnek olarak gerilme iletilen dalga ile orantılıdır. Bu çalışmada, set-up Kolsky iki çubuk arasına yerleştirilmek üzere bir hücre basınç odası içermektedir. </li><li> Iki alüminyum alaşımlı bar (her 6 m uzunluğunda) hizalanmış pirinç rulmanlar tarafından askıya alınır, ve in vitro hücre basınçlandırma odasında bir bar arasında sıkışmıştır. Yukarı çubuğun bir ucu üzerine kenetlenir bir £ 130 kitle olayı çubuktur. Bir sürtünme kelepçesini, istenen darbe süresi sağlayacak bir konumda yer alır. Kelepçe çekici ve kütle ve bir yükleme desteği arasındaki makas kriko sıkarak, olayın bar kelepçe-kütle bölümü pre-cistenilen seviyeye ompressed. Bir hidrolik sistem ile ani bir mola için kelepçe kilitleyen bir taraklı cıvata zorlamak hızla önceden saklanan sıkıştırma serbest bırakır ve böylece bir basınç darbesi üretir. Bu olay çubuğu yoluyla yayar, test odası piston sürücüler ve düşüncesizce odasının içindeki sıvı ve hücreler hermetikler. Sırayla odası basınçlandırma bulaşan barda aşağı yayılan bir basınç nabız başlatır. Barlarda basınç darbeleri ile ilişkili suşlar 45 volt için heyecanlı bileşik yüksek direnci strain gauge ile ölçülür. Ölçer sinyalleri bir yükleme tarihi olarak 1 MHz frekansında bir dijital osiloskop ile kaydedilir. </li><li> İn vitro hücre basınç odasının içinde bir piston-silindir oluşur. Silindir 2.6 cm iç çapa ve 3.8 cm dış çapa sahiptir, ve boşluğunun tabanında dağılmış küçük bir delik vardır. Delik hücre örneği yükleme sırasında bir hava ve aşırı sıvı havalandırma olarak hizmet vermektedir. Piston 7.5 cm uzunluğundave aynı çubuk malzemeden imal edilir. Piston düşük sürtünme mühür olarak hizmet tesisatçı (Teflon) bant, iki ila üç kat sarılır. Uç kapağı uzunluğunda 32 mm ve yükleme sırasında cam lameller (hücreler kültüre edildiği) sabitleyen iki küçük paslanmaz çelik vidalar vardır. </li></ol> 3. Nöronal Hücre Dürtüsel Basınçlandırma <ol><li> Tüm basınç odası parçaları otoklav kullanarak sterilize edilir ve UV ışık altında tutulur. Odasının montaj hücre kültürü başlık içinde gerçekleştirilir. Odasındaki havalandırma vidası gevşek boşluğunun dibinde havalandırma devreye girer. Önceden ısıtılmış (37 ° C), taze büyüme ortamı kabarcıkları yapmadan odasının içine pipetle konulur. Daha sonra, bir hücre-kültür cam slayt alınır, ve (dış kaplama hücreleri), pistonun kapak üzerinde yerleştirilmiştir. Küçük tutan vidaları yerine tutmak için slayt üzerine aşağı sıkılır. Bir hücre-kültürlü cam slayt ile piston takıldığında biraz into odasının boşluğu ve montaj yüksek noktada olmanın havalandırma ile hareket ettirildiğinde. Tahliye deliğinden çıkarılır ve piston ilk önce hava kabarcıkları, fazla sıvı dışarı zorlamak boşluğu içine itilir. Ya bir referans işareti veya jig her test için aynı kültür ortamı hacmi sağlamak için bir kılavuz olarak kullanılır. Bölme içinde ortam eksenel boyutu 6 mm kadardır. Havalandırma vidasını Sanitize ve sıkı hazne suyu yapmak için değiştirin. Kamara yaparsa, teflon sarma değiştirilmesi veya güçlendirilmesi gerekmektedir, bu statik yük altında sızıntı olmamalıdır. </li><li> Bu noktada, Kolsky bar sistemi sıfırlanır. Ağır kütle orijinal konumuna geri döndü ve yeni bir kilitleme vidası kullanılır (kırık) bir yerini alır. Yaklaşık 200 psi hidrolik yeni kilitleme cıvatasını takın. İstenilen değeri biraz daha yüksek bir basınca olayın bar ön yükleme bölümüne kadar sıkıştırmak için makas kriko kullanın ve sonra tam sürtünme meşgul onu gerikriko vida. Veri toplama artık silahlı. </li><li> Toplanan hücre basınç odasına sistem içine monte edilir. Bu küçük laboratuar makası girişi tarafından desteklenen bir V blok yerleştirilir ve iki bar ile hizalanır. Hafif bir yağ tabakası ve arasında herhangi bir hava boşlukları ortadan kaldırmak için birlikte butting yüzeyler ovmak yağlayın Her arabirim. </li><li> Testi artık devam etmeye hazır. Kelepçe kilitleme cıvatasını hızlı hidrolik kelepçe sürücüsü pompalayarak kırmak zorunda kalır. Sonuçlar kelepçe ayrı olacak ve veri toplama göstermelidir. Hücre basınç geçmiş iletilen çubuk ölçer ölçümü tespit edilir. Ikinci gönderilen çubuk yeterince uzun ise ölçümler bir negatif basınç göstermek durumlarda, bu sadece nokta için ilk rahatsızlık arasında olmalıdır. Bir kabarcık tutulur ise iletilen darbe süresi olay pulstan daha kısa olabilir. Büyüklük olay darbe bu ulaşmak mümkün olmayabilir, ama bu, bir yeterince lon olmalıdırboşaltma öncesinde g plato. Aksi takdirde, yalıtılmış bir bölmede veya montaj ve bir bar arasında bir hiza içinde büyük bir hava kabarcığı ya da oluşmuş olabilir. </li><li> Hücre basınçlandırma kamara sonra kaldırılır ve hücre kültürü kaputu içinde söktürür. Tahliye deliğinden çıkarılır ve piston odasının serbest çekilir. Hücre kültür cam slayt, pistonun uç alınır. </li></ol> 4. Basınçlı Hücre Davranışı Değerlendirme <ol><li> Basınçlandırma sonra, hücreler hemen kontrol edilebilir ya da daha fazla, daha sonra muayene için inkübe edildi. Uygun aseptik işlem süreçleri ile, uzun vadeli post-inkübasyon mümkündür. </li><li> Basınçlı hücreleri tüm moleküler ve hücre biyolojisi teknikleri ile incelenebilir. Özellikle nöronal hücre basınçlandırma için, tahliller akson uzantısı basınç indüklenen değişiklikler, mikrotübül sitoskeletal değişiklik, nöronal gen expre değerlendirirken, TBI koşullarda hücresel ve moleküler fizyolojisi araştırmakSsion, apoptoz, vb yapılabilir. Kontrolü hücre örneklerinin, aynı kültüre hücrelerin, aynı süre için basınçlandırma odasının içinde tutulur, ancak basınçlı değil (yani, oda kontrolü denir) kullanılır gibi. </li><li> Akson uzantısı değişiklikleri değerlendirmek için, basınçlı ve oda kontrolü hücreler hemen basınçlandırma ve post-inkübasyon 1 ve 24 saat sonra optik mikroskopta incelenir. Nöronal hücre görüntü örneği &#39;Örnek&#39; Sonuçları kesit (Şekil 2) &#39;de gösterilmektedir. Akson uzunluğu değişiklik aktin immünofloresan boyama ve görüntü analizi ile belirlenebilir. Hücreler% 0.05 v / v Tween-20 ile yıkama tamponu ile yıkanır bir% 4 w / v formaldehit çözeltisi ile çözülmüştür, ve bir% 0.1 h / h Triton X-100 çözeltisi ile permeabilize edilir. % 1 w / v sığır serum albümin ile bloke etme çözeltisi sonra, hücreler tetramethylrhodamine izotiyosiyanat (TRITC)-konjuge phalloidin ile inkübe edilir. Hücrelerin immünofloresan görüntüleri bir floresan ile alınırmikroskop ve basınçlı ve kontrol hücreleri için neurites uzunlukları ImageJ yazılım (NIH) kullanılarak ölçülür. </li><li> Neurites akson ya da dendrit olarak tespit edilebilir. Akson ya da dendrit meydana gelen morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için, deney yukarıda açıklanan her yapı tespit antikorlar kullanılarak tekrar edilebilir, yani dendrit için akson ve mikrotübül ilişkili protein (map2) antikor nörofilament (NF) antikor. </li><li> Mikrotübüller nöronların önemli sitoskeletal bileşenlerinden biridir ve mikrotübüller hasar nöronal hasarın bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. 2 Mikrotubul β-tubulin antikoru kullanılarak immunofluorescently canlandırılabilir. Hücreler, post-basınçlandırma 0 ve 24 saat sonra sabit β-tubulin antikoru ile boyandı ve floresan mikroskobu ile gözlenmiştir. </li><li> Nöronal ve apoptotik gen ekspresyonu dürtüsel basınçlandırma etkisini değerlendirmek için, toplam RNA basınçlı ve kontrol hücreleri elde edilir. GenE ifadesi bizim yayınlanan protokolleri benzer kantitatif RT-PCR veya gerçek zamanlı RT-PCR, yaparak muayene edilebilir. 3 </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Basınç profilinin bir örneği, basınç odasının içindeki hücreler için uygulanabilir. Kolsky çubuğu cihazı başarıyla yaklaşık 0,7 ms süre ile 2 MPa seviyesine, tek-pulse tipi impulsif basınçlandırma üretir. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Dürtüsel basınçlandırma için nöronal hücre yanıtı bir örnek. SH-SY5Y hücreleri odasına kontrol hücrelere göre 2 MPa gösterisi ayrı nörit / akson dağılımına dürtüsel basınçlandırma maruz. 6. Zorluklar ve Çözümler <ol><li> Oda sızdırmazlık üstesinden gelmek için en büyük engellerden biridir. Bu foo-ringler çapında diskler oyma ve artan sürtünme bir sorun var ki und. Sürtünme etkileri ortadan kaldırmak, hem de oluk açma, Teflon tesisatçının bant ile piston bantlama basit bir yöntem önlemek için kullanılır. Bu problemleri çözer ve istenilen basınç seviyesi ve süresi üretir. </li><li> Basınçlı nöronal hücre davranışı, ikincil TBI mekanizması veya uzun vadeli etkileri değerlendirilirken, özellikle uzun bir post-inkübasyon süresinden sonra muayene edilmelidir. Hücre içeren odası, Kolsky bara geçmeden basınçlandırma ve hücre kültürü kaputu geri hareket ederken potansiyel koşulları steril maruz kalmaktadır. Odası parçaları ve / demontaj hücre kültürü kaputu içindeki hücre kültür slayt ve kamara, montajında ​​düzgün çalışması öncesi sterilizasyon ile uzun vadeli post-inkübasyon birkaç haftaya kadar mümkündür. </li><li> Verilerin tekrarlanabilirliği hücresel mekanik uyarım deneylerinde önemli bir parametredir. Bizim cihaz, reproducibilit içinnöronal hücre yanıtı y dürtüsel basınçlandırma istenen tercihi nasıl belirlenir, basınç seviyesi ve süresi hem de art arda elde edilir. Her basınçlandırma için elde edilen basınç profili kaydetmek yana, istenmeyen basınç profilden hücre yanıtı verileri el ile daha sonra bırakılabilir. </li><li> Haznesi montaj, transfer ve Kolsky bar, basınçlandırma, transfer-sırt ve kamara sökme monte dahil tüm basınçlandırma adımları, en az 10 dakika sürer. Sonraki hücreye kültürlü slayt önceki basınçlandırma hemen sonra basınçlı olabilir. Bu nedenle, basınç deneyler, yeterli sayıda etkin bir şekilde yapılabilir. Bizim set-up 18 mm çaplı cam lameller kullanır. Bir basınç deney alt tabaka boyutuna bağlı olarak immünoblot batı için yeterli protein (ve aynı zamanda kısmen basınçlı bazı hücreler ölü çünkü) sağlamaz. Yaklaşık üç tekrarlanan basınçlandırma deneyler immunobl için gerekli protein miktarını sağlamakOtting. Yine, tekrarlanabilirlik basınç profili ile her zaman kontrol edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading.">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity,+microtubule+disassembly,+and+axon+degeneration.">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li><li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics.">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury.">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li><li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosive+blast+neurotrauma.">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li><li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+percussion+barotrauma+chamber:+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury.">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li><li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li><li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment.">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li><li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials.">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

In vitro deneysel teknikler çoğu TBI koşullarda beyin hücre hasarı incelemek için teşebbüs edilmiştir. Bunlar bu kısa süreli basınç TBI için hakim fiziksel faktör olduğu kabul edilmiştir / astrosit germe, akış kaynaklı kayma gerilmesi nöron, ağırlık düşürme, stylus laserasyonu, lazer transeksiyonu, litotripsi, vb 4,5 bulunmaktadır. Özellikle 6,7 , TBI patlamanın shockwave milisaniye bir düzenin bir puls süresine sahiptir. 4 Bu varsayım ve gözlem dayanarak, geçici basınçlandırma yeteneğine barometre haznesi gelişmiş ve TBH koşullarda beyin hücre davranışlarını değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Örneğin, sıvı perküsyon barotravma oda 0.5 MPa için yaklaşık 20-30 ms uzun süre ile kadar bir tepe basıncı ile ilgili bir basınç darbesi TBI&#39;dan altında insan glial hücre davranışını incelemek için kullanılmıştır. 6. Son zamanlarda, VandeVord ve ark. 7 kullanılan metal astrosit hücre incelemek topu çarpıcı barometre haznesiTBI altında davranış ama metal bilye çoklu basınç darbesi çarpıcı. Bu çalışmada, tek-pulse tipi dürtüsel basınçlandırma üreten bir roman hücre basınçlandırma cihaz geliştirdik. Cihaz bizim 8 ve diğer adlı çalışmalarda bir malzeme test cihazı olarak kullanılmaktadır Kolsky bar set-up, üzerinde geliştirilmiştir. Çok yüksek yükleme hızında 1,9 Kolsky barın malzeme test yeteneği edebilmek için modifiye edilmiştir Basınç odası (Şekil 1) içinde kültür hücreleri tek-pulse tipi basınç uygulayın. Biz başarıyla dürtüsel basınç büyüklüğünü ve süresini kontrol edebilecek. Temsili bir hücre tepki olarak, basınçsız odasının kontrol hücrelerine kıyasla 2 MPa basınç SH-SY5Y nöronal hücrelerde anlamlı akson ve akson kaybı görüntülemek göstermiştir. Sonuç olarak, biz özel tasarlanmış Kolsky kullanarak bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma cihazları geliştirilmiştirbar cihaz ve TBH koşullarında nöronal hücre yanıtını araştıran yılında potansiyel kullanımını gösterdi. Biz de bu tekniğin her hücre tipine çeşitli seviye ve süresini de dürtüsel baskılara maruz kalabileceği çok yönlü olduğunu unutmayın. Bu nedenle, cihazı hücrelerinin yaralanmasına için değil, aynı zamanda da pozitif olarak işlev ve kaderini tayin olarak hücre uyarıcı için değil, sadece, itici basınç ile indüklenen hücre mechanotransduction davranışını incelemek için kullanılabilir.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) insan nöroblastom hücrelerinde </li><li> 18 mm çapındaki cam lameller </li><li> Hücre kültürü ortamı: DMEM,% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin </li><li> Indükleyici nöron için Retinoik asit (10 uM) </li><li> Kolsky bar dürtüsel basınçlandırma cihazı </li><li> Piston-silindir hücreli basınç odası </li><li> Piston üzerindeki hücre kültürlerinde lamel sabitlemek için paslanmaz çelik vidalar </li><li> Hücre odası ve Kolsky bar arasında arayüzler için Gres </li><li> Basınçlandırma (sabitleştirici, antikor, floresan boya, PCR malzemeleri, vb) hücre yanıtı değerlendirmek için genel moleküler biyoloji malzemeleri </li></ul>

impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study

Bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma deneme patlama bağlı travmatik beyin hasarı (TBI) araştırmak için bir Kolsky çubuğu aygıtı kullanılarak geliştirilmiştir. Biz patlama TBI-ilgili dürtüsel basınçlandırma in vitro nöronal hücrelerin nasıl uygulanacağını Bu video makalede göstermektedir. Bu kaydedilen hücre basınç odası içinde tam basınç geçmişi olan, özel bir Kolsky çubuk aygıtı tarafından oluşturulan iyi kontrol edilen bir basınç darbesi kullanılarak elde edilir. Basınçlı nöronal hücrelerin basınçlandırma hemen sonra muayene veya ayrı akson kaybı görece indükler Biz yaklaşık 2 MPa Atmalı basınçlandırma gözlenen aksonal / akson uzantısı, nöronal gen ekspresyonu, apoptozis, vb dürtüsel basınçlandırma uzun dönemli etkilerini incelemek için daha inkübe edilir basınçsız hücreleri için. Bizim tekniği iyi kontrollü pr beyin hücrelerinin dürtüsel basınçlandırma aracılığıyla TBI patlamanın hücresel / moleküler mekanizmalarını araştırmak için yeni bir yöntem sağlarbüyüklüğü ve süresi essure.

Watch this Scientific Journal Video about Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study at JoVE.com

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma deneme patlama-indüklenen travmatik beyin hasarının hücresel / moleküler mekanizmalarının araştırılması için bir Kolsky çubuğu aygıtı kullanılarak geliştirilmiştir.

Travmatik Beyin Hasarı Eğitim için Nöronal Hücre Dürtüsel Basınçlandırma

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Görüntüleme.  University of Nebraska-Lincoln. Bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma deneme patlama-indüklenen travmatik beyin hasarının hücresel / moleküler mekanizmalarının araştırılması için bir Kolsky çubuğu aygıtı kullanılarak geliştirilmiştir.

Video: Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Biyomühendislik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

Omurilik Yaralanmalı Kişiler Eğitim bir mekanik dış iskelet kullanma Ambulate için

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

Etkileşimli, hastanın özel modelleri kullanarak derin beyin stimülasyonu tedavisi için nöronal Fiber yolları hedefleme

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...