Name: expression and purification of virus-like particles for vaccination
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination at JoVE.com

Biz maksimum verimlilik ve verim için protokol optimize yardımcı olmuştur Ross laboratuar öncesinde üyelerini kabul etmek istiyoruz.

Grip H3N2 VLP Üretimi 1. Memeli İfade Sistemi <ol><li> Alt klon, daha önce tarif edildiği pTR600 ökaryotik ekspresyon vektörleri, viral yapı glikoproteinlerin hemaglutinin (HA), nöraminidaz (NA) ve insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV) Gag P55. 7 </li><li> Kimyasal yetkili Escherichia coli (örneğin, DH5α) DNA yükseltmek ve üreticinin talimatlarına göre bir plazmid saflaştırma kiti kullanılarak transfeksiyon dereceli plazmid izole. DNA miktarı verim ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlıdır. </li><li> Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de% 10 fetal bovin serumu (FBS) içeren büyüme ortamı içinde bir memeli hücre çizgisi, 293T, koruyun. </li><li> T-150 doku kültürü şişesi şişe aşağıdaki gün tam hücre yapışmasını ve% 85-95 hücre confluency elde şekilde şişeye başına 45-75 x 10 6 hücre içerecek şekilde hücreleri büyür. İstenilen conflu için mikroskop altında hücrelerin kontrol edinEnsi. Not: Yüksek hücre yoğunluğu, tipik olarak, ancak aşırı konfluent yan ürünleri, hücresel atık birikim neden olur ve hücre canlılığı azaltabilir ticari transfeksiyon reaktifleri kullanarak minimum sitotoksik optimal protein elde etmek için önerilmektedir. </li><li> NA: 1: HA 2 transfeksiyon günde 1 DNA bileşimi DNA hücreleri, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak lipozom ve DNA karışımı hazırlamak ve transfekte Gag T-150 şişesi başına 40 ug toplam DNA miktarı ile. Her şişe, 20-30 ml bir toplam hacme sahip olacak şekilde, antibiyotikler olmadan, serumsuz transfeksiyon ortamı DNA ve lipozom çözüm seyreltilir. Not: gen yapılarının oranı kullanım optimizasyon gerektirebilir. : 1 oranında Burada gösterilen olmasına rağmen, benzer bir transfeksiyon prosedürü 1 solunum sinsitiyal virüsü (RSV) F ve HIV gag ile işlenmiştir. DENV ve CHIKV tek ekspresyon plazmidleri, T-150 şişesi başına DNA 20 ug toplam uygun e için kullanılanXPression. DNA: transfeksiyon reaktif oranlar kullanıcı optimize edilmiş. Kullanım transfeksiyon yöntemi, temel transfeksiyon ortamı önerilen örneğin polikatyonik lipid transfeksiyon ve böylece ortam hormonlu takviye edilebilir bir azalma ve cenin sığır serumu yokluğunu tavsiye ve serum olmadan büyümesini desteklemek için eser elementler. </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de şişeler dönün. 200 ml&#39;lik bir hacme için, 9 T-150 şişelerde. Hücreler VLP&#39;ler hasat güne kadar transfeksiyon kültür ortamında tutulur. </li><li> 72-96 saat sonrası transfeksiyon antijeni bağlı veya mikroskobik muayene ile tahmin edilen hücre canlılığı,% 70-80 düşmüştür zaman sonra hücrelerden Hasat kültür süpernatanı. Başına 50 ml konik tüp içine süpernatan ve hücre kalıntıları topak haline 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g hücreleri aşağı doğru döndürün. Not: yiel olacak yapışık hücrelere taze, önceden ısıtılmış, serumsuz transfeksiyon ortamı ile 3 günlük yüzer değiştirilmesive benzer ya da biraz azaltılmış verim ile VLP&#39;lerinin da ikinci çok kullanıcı tarafından optimize edilmelidir. </li><li> ultrasantrifüj yoluyla çökelme öncesi 0.22 um zar içinden Havuz süpernatan ve filtre. </li><li> % 0.8 hindi ya da memeli kırmızı kan hücreleri kullanılarak standart himeglütinasyon denemesi 14 HA-ifade VLP&#39;lerinin hemaglütinasyon aktivitesini test veya antijen spesifik ELISA ile devam edin. Temsilcisi sonuçları için Şekil 2&#39;ye bakınız. </li></ol> Bakulovirüs / Böcek Hücre Sisteminin Kullanılması 2. CHIK VLP İfade <ol><li> ticari bir bakulovirüs sentezleme sistemi kullanılarak S-27 suşu Chikungunya virüsü kapsidini ve zarf proteinleri (Cı-E3-E2-6K-E1) ifade eden yeniden birleştirici baculovirüs oluşturur. </li><li> 28 ° C &#39;de 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile serumsuz Sf9 büyüme ortamında kültür Spodoptera frugiperda Sf9 hücreleri. Suspens için dönücü şişesi kültürleri başlatmak için 3-5 x 10 5 c / ml kullanınİyon hücre büyümesi. Passage rutin onlar 2-4 x 10 6 c / ml (her 3-4 gün) hücre yoğunlukları ulaştığınızda. </li><li> Bir çok noktalı bir karıştırıcı plaka sistemi 130 rpm&#39;de karıştırılarak döndürücü şişelere süspansiyon kültür Sf9 hücreleri. Doğru havalandırma için, dönen şişeden hiçbir yarısından fazlasını seste kültür hacimleri korumak. </li><li> CHIK VLP&#39;ler ekspresyonu için, 1 enfeksiyon çeşitliliğinde, rekombinan bakülovirüs ile 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta Sf9 hücreleri enfekte ve 28 ° C inkübatör geri dönün. Tipik haliyle, 250 mi Sf9 hücreleri ihtiva eden bir ya da iki döndürme şişeleri enfekte etmektedir. Not: Bu yöntemi kullanmak yok iken, Sf9 hücreleri bir çalkalama platformu kullanarak 28 ° C&#39;de çalkalama şişelerinde kültüre olabilir. </li><li> hücre canlılığı,% 70-80 düşmüştür zaman hasat kültürleri 72-96 st post-enfeksiyon sonrası veya üreticinin protokolüne göre mavi Tripan çıkışı ile belirlendiği gibi. Not: Hücreler enfekte ise çoğalmaya devam var3 gün sonrası enfeksiyon (dpi) rekombinant CHIK VLP bakülovirüs ile enfekte edilmiş Sf9 kültürlerinde ~% 80 canlılığı. Bakulovirüs enfekte hücreler görünüş olarak daha büyüktür. Morfoloji da dikdörtgen için yuvarlak değişebilir. bakulovirüs enfeksiyonun geç aşamalarında, hücreler lize başladı. </li><li> şirketinden süspansiyon kültüründen 50 ml konik tüp içine, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri aşağı spin Aktarım kültürleri. </li><li> süpernatantlar toplamak ve Ultrasantrifügasyon yoluyla sedimantasyon önce 0.22 mikron gözenek zarından filtre. </li></ol> VLP / SVPs 3. Çökelme / saflaştırma <ol><li> biyogüvenlik kaput içinde% 70 etanol ile 25 mm x 89 mm üstü açık ultrasantrifüjdeki tüpleri sterilize edin. Etanol kullanılmadan önce kurumadan emin olun. </li><li> Temiz bir tüpe süpernatant 32 ml yükleyin. 25 ml minimal hacim çöküşü ve yetersiz dolu ultrasantrifüjdeki tüplerin zarar görmesini önlemek için tavsiye edilir. </li><li> Dikkatle süpernatanlar zekâ altında yatanPBS h steril 3 ml% 20 gliserol (h / h). Emin tüpler dengeli olduğundan emin olun. </li><li> 4 ° C&#39;de 4 saat boyunca 135,000 x g&#39;de dönerler. </li><li> Süpernatant aspire, pelet sağlanması tüpten çıkarmak değildir. </li><li> Süspanse şiddetle yukarı ve aşağı pipetleme steril PBS ile tüplerin alt kısmında VLP&#39;lerini çöktürülür. PBS miktarı VLPler VLP toplam protein verimi ve alt uygulamalara bağlıdır tekrar süspansiyon gerekiyordu. Tipik olarak, en az 100 | il her VLP pelletini. </li><li> Mağaza örnekleri, uzun süreli depolama için kısa süreli depolama ve -80 ° C&#39;de saklama için 4 ° C. </li></ol> 4. Protein Miktarları ve Spesifik Antijen Verimini belirlenmesi <ol><li> Bu üreticinin protokolü doğrultusunda BCA deneyi olarak, ticari bir protein miktar yöntemi kullanılarak toplam protein içeriği belirlenir. </li><li> spesifik antijen içeriği değerlendirmek için standart antijen ve 2-5 seri dilüsyonları kaplama doğrudan enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) yerine1 &#39;dir; ELISA 96 gözlü düz tabanlı bir plakaya toplam protein örneğinin örn. <ol><li> plaka antijenlerinin varlığını araştırmak ve mikroplaka okuyucusu için tespit absorbans üretilmesi için geleneksel bir ELISA gelişimi alt tabakaların kullanımı, antijene spesifik antikorlar ile takip edin. VLP HA-eksprese eden bir örnek için HA ve ELISA deneyi için temsili sonuçlar için bkz Şekil 2; HA ve NA birçok kombinasyonları muhtemelen ama verimleri HA-NA uyumluluğu 15 üzerine farklı olabilir. Not: Antijen spesifik antikorlar, değişken bir ilişki içindedir ve antikor son uç seyreltme titrasyon VLP ölçümü uygulamadan önce tespit edilmesi önerilmektedir. Ticari antikorlar ELISA&#39;da kullanım için önerilen yoğunlaştırmadan veya seyreltmeden aralıkları, hem de önerilen protokoller vardır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+virus-like+particles:+a+review.">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).</li><li>Jain, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+stabilization+of+recombinant+protein+based+virus-like+particle+vaccines.">Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2014).</li><li>Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+pH+stability+-+how+influenza+A+virus+hemagglutinin+affects+host-specific+virus+infection.">Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engerix-B+package+insert.">Engerix-B package insert.</a> GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).</li><li>Giles, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+optimized+hemagglutinin+virus-like+particle+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+that+protect+nonhuman+primates+from+H5N1+infection.">A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection.</a> J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).</li><li>Giles, B. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+optimized+broadly+reactive+antigen+(COBRA)+based+H5N1+VLP+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+in+mice+and+ferrets.">A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets.</a> Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).</li><li>Green, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3d+enhancement+of+neutralizing+antibodies+to+measles+hemagglutinin.">C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin.</a> Vaccine. 20, 242-248 (2001).</li><li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-Clade+Protective+Immune+Responses+to+Influenza+Viruses+with+H5N1+HA+and+NA+Elicited+by+an+Influenza+Virus-Like+Particle.">Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle.</a> PLoS ONE. 3, e1501 (2008).</li><li>Yondola, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+Capability+of+the+Influenza+Virus+Neuraminidase+Can+Be+Modulated+by+Tetherin.">Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin.</a> J Virol. 85, 2480-2491 (2011).</li><li>Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles+for+antigen+delivery+at+mucosal+surfaces.">Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).</li><li>Murawski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus-like+particles+containing+respiratory+syncytial+virus+G+protein+induced+protection+in+BALB/c+mice,+with+no+evidence+of+immunopathology.">Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology.</a> J Virol. 84, 1110-1123 (2010).</li><li>Quan, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice.">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li><li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COBRA-Based+Dengue+Tetravalent+Vaccine+Elicits+Neutralizing+Antibodies+Against+All+Four+Dengue+Serotypes.">COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes.</a> J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+the+Laboratory+Diagnosis+and+Virological+Surveillance+of+Influenza.">Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza.</a> World Health Organization. , (2011).</li><li>Mitnaul, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balanced+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Activities+Are+Critical+for+Efficient+Replication+of+Influenza+A+Virus.">Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus.</a> J Virol. 74, 6015-6020 (2000).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Pijlman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enveloped+virus-like+particles+as+vaccines+against+pathogenic+arboviruses.">Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses.</a> Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).</li><li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy.">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li><li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A/goose/Guangdong/1/96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+:+Morbidity+and+mortality+weekly+report.">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz başarıyla SVPs ve çeşitli patojenler için birden fazla yapısal proteinlerden oluşan VLP&#39;lerini ifade ve arındırmak için yukarıda açıklanan teknikler kullandık. Genel olarak, bizim VLP&#39;lerini oluşturmak için memeli ifade sistemleri kullanırlar. Ancak, bizim elimizde, memeli hücre CHIK VLP verimleri düşük türetilmiş. Bir rekombinant bakülovirüs-böcek hücre sistemini kullanarak CHIK VLP verim daha güçlü oldu. Genel olarak, bakulovirüs, böcek hücre sistemleri, kontrol altında ve...

Virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler), insan aşılama için onaylanmış bir teknolojidir. Aslında, insan papilloma virüsü (HPV) ve hepatit beta da dahil olmak üzere daha çağdaş lisanslı aşıların, bazı (HepΒ) aşılar bu yaklaşımı kullanır. VLP&#39;ler kendini montaj yapabilen yapısal proteinlerden oluşur. monte parçacıklar viral morfolojileri taklit, ancak enfekte ya da viral genomları eksikliği nedeniyle çoğaltma yapamaz. VLP&#39;ler ifade Prokaryotik ve ökaryotik sistemlerde bir dizi saflaştırılır. -% 28, maya -% 20, bitki -% 9, böcek -% 28, ve memeli -% 15 1 bakteri: literatürün gözden farklı ekspresyon sistemleri aşağıdaki oranlarda istihdam edildiği saptandı. Dikkat çekici bir şekilde, L1 kapsid proteini göre aşılar mayalar (Gardasil) &#39;de ya da bir böcek hücre sistemine (Cervarix) 2 üretilir. HepΒ aşılar Recombivax ve Engerix-Β da mayada üretilir ve HepΒ yüzey antijeninin 3 oluşmaktadır4. Bu montaj için çok sayıda yapısal proteinlerin ko-ifadesini gerektiren VLP&#39;lerini üretilmesi için, memeli ve böcek hücre ifade sistemlerini kullanır. grip virüsü, solunum sinsityal virüs (RSV), dang virüsü (DENV) ve chikungunya virüsü (CHIKV): Çalışmalarımız insan patojenlere karşı tasarımı, üretim ve arıtma VLP-bazlı aşılar üzerinde duruluyor. Bizim yöntemleri birden fazla ekspresyon plazmidleri birden fazla yapısal proteinlerin birlikte ekspresyonu ya da tek bir sentezleme plasmidi (Şekil 1) sağlamak için yeterince esnektir. Daha önce, üretilen ve saflaştırılmış H5N1 VLP&#39;ler insan embriyonik böbrek 293T hücrelerinde 5,6 influenza hemaglutinini (HA), nöraminidaz (NA) ve matris (M + -1) kodlayan plasmidin birlikte ekspresyonundan toplandı. genler, memeli hücrelerinde ekspresyon için kodon-optimize edilmiş ve pTR600, transkripsivonel başlatmak için sitomegalovirüs hemen-erken promoteri artı intron A içeren bir ökaryotik ifade vektörüne klonlanmıştırÖkaryotik ekler ription ve transkripsiyon 7 sonlandırılması için sığır büyüme hormonu poliadenilasyon sinyali. HA, NA (Şekil 1A) ve alternatif bir viral matriks proteini, HIV gag p55, üç plazmid ko-ifadesini kullanan benzer bir yaklaşım, bu çalışmada, insan mevsimsel grip alt H3N2 VLP&#39;lerin üretimi için kullanılmıştır ve elde gösterilmiştir grip parçacıklar 8 olarak benzer büyüklükteki VLP&#39;ler. Influenza aşıları baskın anti-HA antikor ortaya rağmen, grip nöraminidaz eklenmesi transfekte edilmiş hücrelerin 9 ve ayrıca mevcut olmayan ilave imünojenik hedeflerden filizlenen VLP sağlamak için siyalidaz aktivitesi aracılık eder. RSV VLP&#39;lerini üretmek için, aynı zamanda, daha önce tarif edilen ve elektron mikroskopi 6,10 ile karakterize edilen, ayrıca HIV gag ile VLP&#39;lerin oluşumu esnekliğini göstermek için özel olarak RSV yüzeyi glikoproteinleri mevcut prototip aşı tasarım HIV gag ilgisiz bir çekirdek parçası seçilebilir. DiğerleriDaha önce RSV glikoproteinleri Newcastle hastalığı virüsü (NDV), 11 ve influenza matris 12 çeşitli viral bileşenler kullanılarak monte edilebilir sunulması VLP&#39;ler göstermiştir. Tam uzunlukta yüzeyi glikoproteini sekansları, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile işlevsel bir reseptör bağlanması ve antikor tanıma analizi için gerekli olabilir yerel konformasyonun korumak için bu çalışmada kullanılmıştır. partikülleri oluşturmak için tekli plazmid sentezleme sistemlerinin kullanımı için örnekler DENV ve CHIKV bulunmaktadır. DENV durumunda, bir prM / e yapısal gen sentezleme kasetini 13 içeren tek bir plazmidden 293T hücrelerinde hiçbir kapsid ile subviral parçacıklar (SVPs) üretebilir. vadeli SVP viral yapısal proteinlerin mecliste bir çekirdek veya kapsid proteini eksikliği belirtmek için kullanılır. CHIK VLP&#39;ler da CHIKV yapısal gen kaseti, kodlayan kapsid ve zarf proteinlerini içeren tek bir plazmid kullanılarak üretilebilir veya ibir rekombinan bakulovirüs böcek hücresi ekspresyon (- Cı Şekil 1B) için optimize aynı yapısal gen kasetinin kodlayan enfekte nsect hücreleri. Yukarıda ele alındığı yaklaşımları ifade sonuç daha sonra% 20 gliserol tampon ile ultra-santrifüj yoluyla saflaştırılabilir hücre kültür ortamına VLPler sürüm. Bu yazıda, ifade ve memeli ve böcek hücre sistemleri bu VLP&#39;lerini arındırmak için yöntemler sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 multipoint stirrer plate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Polyclear ultracentrifuge tubes</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size</td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate citrate buffer</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-phenylenediamine dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m vacuum filter top (500 ml)</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>339741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

expression and purification of virus-like particles for vaccination

Virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) ve subviral parçacıkları (SVPs) canlı patojenlerin kullanımı üzerinde artmış biyo-güvenlik ve kararlılık avantajlar sağlar viral aşı tasarımı için alternatif bir yaklaşım bulunmaktadır. Bulaşıcı olmayan ve kendi kendine montaj VLP&#39;ler canlı patojenlerin veya antijen teslimat için rekombinant viral vektörler için ihtiyaç kalmaz, immünojen olarak yapısal proteinleri sunmak için kullanılır. Bu yazıda, klinik öncesi hayvan testleri gelecekteki uygulamalar için VLP tasarım ve geliştirme farklı aşamalarında göstermektedir. Prosedür, aşağıdaki aşamaları içerir: bir antijen dozu için antijenin bir seçim, seçim hücre hattı, VLPler / SVPs saflaştırılmasında antijenin ekspresyonunu ve miktar tayini. Biz antijenlerinin ifadesi için hem memeli ve böcek hücre çizgilerinin kullanımını göstermektedir ve metodolojileri verimle farklılık gösterilmektedir. sunulan yöntem patojenlerin için geçerli olabilir ve immünojenik str antijenleri değiştirilmesi ile elde edilebilirilgi kullanıcının mikroorganizma uctural proteinleri. VLP&#39;ler ve SVPs antijen karakterizasyonu ve en iyi aşı adaylarının seçimi ile yardımcı olur.

VLP verimleri viral antijen yapısı tasarımı ile değişken idi. Bu protokol, ultra-santrifüj ile yüzer SVP ya da VLPler üretimi ve saflaştırılması için, böcek ve memeli hücreleri kullanımını göstermiştir. DENV prM / e yapısal gen sentezleme kasetleri dört alt tipi, Tablo 1 &#39;de (1-4 olarak çizilmiş) DENV SVPs sürümlerini oluşturmak ve 0.6 ml hacim toplam proteinin 1,1-2,6 mg arasında bir aralığı göstermek için kullanılmıştır. HA iç...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination at JoVE.com

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

expression-and-purification-of-virus-like-particles-for-vaccination

Research

JoVE Journal

Biology

21.8K Görüntüleme.  University of Georgia.  Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır. 

Video: Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Kanser Araştırmaları

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Biyomühendislik

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane vesicles (OMVs) are mainly secreted by gram-negative bacteria during average growth, with a nano-sized diameter and self-adjuvant activity, which may be ideal for vaccine delivery. OMVs have functioned as a multifaceted delivery system for proteins, nucleic acids, and small molecules. To take full advantage of the biological characteristics of OMVs, bioengineered Escherichia coli-derived&#160;OMVs were utilized as a carrier and SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) as an antigen to construct a &#34;Plug-and-Display&#34; vaccine platform. The SpyCatcher (SC) and SpyTag (ST) domains in Streptococcus pyogenes were applied to conjugate OMVs and RBD. The Cytolysin A (ClyA) gene was translated with the SC gene as a fusion protein after plasmid transfection, leaving a reactive site on the surface of the OMVs. After mixing RBD-ST in a conventional buffer system overnight, covalent binding was formed between the OMVs and RBD. Thus, a multivalent-displaying OMV vaccine was achieved. By replacing with diverse antigens, the OMVs vaccine platform can efficiently display a variety of heterogeneous antigens, thereby potentially rapidly preventing infectious disease epidemics. This protocol describes a precise method for constructing the OMV vaccine platform, including production, purification, bioconjugation, and characterization.

The present protocol describes the bioengineering of outer membrane vesicles to be a "Plug-and-Display" vaccine platform, including production, purification, bioconjugation, and characterization.

SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir "Tak ve Görüntüle" Nanopartikül Aşı Platformu

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate antigen-displaying VLPs. Surface antigen-specific antibodies are coupled to, and thus immobilized on a solid and insoluble matrix such as beads. Due to their high affinity to the target antigen, these antibodies can capture VLPs decorated with the cognate antigen anchored in the membrane envelope of the VLPs. This protocol describes the binding of antigen-specific antibodies to protein A- or G-conjugated magnetic beads. In our study, human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs formed by the group-specific antigen (Gag) viral core precursor protein p55 Gag and displaying the envelope glycoproteins (Env) of HIV are examined. The VLPs are captured utilizing broadly neutralizing antibodies (bNAbs) directed against neutralization-sensitive epitopes in Env. The VLP capture assay outlined here represents a sensitive and easy-to-perform method to demonstrate that (i) the VLPs are decorated with the respective target antigen, (ii) the surface antigen retained its structural integrity as demonstrated by the epitope-specific binding of bNAbs used in the assay and (iii) the structural integrity of the VLPs revealed by the detection of Gag proteins in a subsequent Western blot-analysis. Consequently, the utilization of bNAbs for immunoprecipitation facilitates a prediction of whether VLP vaccines will be able to elicit a neutralizing B cell response in vaccinated humans. We anticipate that this protocol will furnish other researchers with a valuable and straightforward experimental approach to examine potential VLP-based vaccines.

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle VLP-Based Vaccines Using a Capture Assay

Here, we present a protocol to detect neutralization epitopes on antigen-displaying virus-like particles (VLPs). Immunoprecipitation of the human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs is performed using envelope glycoproteins-specific monoclonal antibodies coupled to protein G-conjugated magnetic beads. Captured VLPs are subsequently subjected to SDS-PAGE and Western blot-analysis employing viral core protein Gag-specific antibodies.

Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate ...

Generating a Multivalent-Displaying Outer Membrane Vesicle Vaccine

Source: Feng, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64213">A &#34;Plug-And-Display&#34; Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates a method to generate multivalent-displaying outer membrane vesicle (OMV) vaccines. Mammalian cells are transfected to express and secrete viral antigens fused to a SpyTag and a polyhistidine tag. These antigens are then purified using a nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity column. The purified antigen is mixed with outer membrane vesicles expressing surface-bound SpyCatcher (SC) protein. Multiple antigens covalently attach to SpyCatchers via their SpyTags (ST), creating OMVs that display the antigen, serving as a multivalent vaccine.

Çok Değerlikli Gösteren Bir Dış Membran Vezikül Aşısı Oluşturulması

1. Plasmid construction

	Insert DNA encoding SpyCatcher sequence (Figure 1) into an ampicillin-resistant pThioHisA-Cytolysin A (ClyA) plasmid (see Table ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünoterapi

İmmünojenikler ve Aşı Geliştirme

A Technique for the Generation of Influenza Virus-Like Particles via a Mammalian System

Source: Arevalo, M. T., et al.&#160; <a href="https://app.jove.com/v/54041">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the generation of influenza virus-like particles (VLPs) in a mammalian system. Upon expressing three eukaryotic expression vectors &#8212; encoding different viral structural proteins &#8212; in suitable mammalian host cells, the expressed viral proteins self-assemble into VLPs on the host plasma membrane and release via budding from the cell surface.

Bir memeli sistemi aracılığıyla influenza virüsü benzeri parçacıkların üretilmesi için bir teknik

Source: Arevalo, M. T., et al.&#160; Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the ...