JMD e MKB são financiados através da Ciência e Nanomedicina IGERT programa Tecnologia na Northeastern University (financiamento do NCI e conceder NSF DGE-0504331). Este trabalho também foi financiado pelo National Institutes of Health National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM084366. Agradecemos também Saumya Das e Anthony Rosenzweig de BIDMC em Boston para a prestação de miócitos cardíacos e Cash Kevin por sua contribuição no desenvolvimento do protocolo animal.

1. Preparação de optode Antes de fazer a optode, alíquotas dos componentes são necessidade para que eles possam ser facilmente medidos e armazenados. <ol><li> A 50 mg de sódio do ionóforo X (naix) e um frasco de sódio 50 mg tetraquis [3,5-bis (trifluorometil) fenil] borato (NaTFPB) cada um deles será criado em tetrahyrdofuran (THF) e alíquotas de 1,5 ml em tubos de centrifugação de poliestireno. Em uma Cobertura de vapores químicos, dissolver o de 50 mg de naix em 1 ml de THF no frasco de transporte e mistura para assegurar que o sólido tenha dissolvido completamente. Transferência de 100 ml desta solução para 10 tubos de centrífuga separados. Repita o procedimento para NaTFPB. Permitir que o THF para evaporar em uma Cobertura de vapores químicos durante a noite, os tubos de centrifugação rótulo e colocá-los no frigorífico grau 4 para o armazenamento. Isso cria cinco alíquotas mg de naix seco e NaTFPB. </li><li> Dissolver o III Chromoionophore (CHIII) em 1 ml de THF e transferir para um frasco de vidro de 3 ml. Adicionar outro 1 ml de THF para o frasco de transporte CHIII para dissolver qualquer CHIII residual e adicionar esta para o frasco de vidro de 3 ml. Haverá um total de 2 ml agora. Transferir 1 ml da solução CHIII em THF a dois frascos separados 1,5 ml de vidro com tampas de Teflon um revestido. Conservar a solução CHIII no frigorífico grau 4, na concentração final de 5 mg / ml. </li></ol> Essas alíquotas e soluções serão usadas para fazer o material optode. <ol start="3"><li> Pipeta mL 66 de bis (2-etil-hexil) sebacato (DOS) em um frasco de vidro de 1,5 ml com tampa de rosca em Teflon - este é o frasco optode. DOS é uma solução viscosa para cuidados devem ser tomados para garantir a quantidade adequada de solução é transferido para o frasco. O volume corresponde a ~ 60 mg de DOS. </li><li> Pesar 30 mg de alto peso molecular poli cloreto (PVC) (PVC) e transferir isso para o frasco optode. </li><li> Agora adicione os componentes funcionais alíquotas para o frasco optode para criar o optode desejado. As concentrações relativas de CHIII, naix e NaTFPB irá determinar a resposta do sensor de sódio. Estas concentrações podem ser ajustados para ter um sensor que, idealmente, responde a concentrações intracelulares, com um Kd de 10 mM ou concentrações extracelular, com um Kd de 150 mM. Além disso, haverá provavelmente de lote para lote variabilidade dos produtos químicos do fornecedor e de calibração dos sensores é necessário determinar se a resposta correta está ocorrendo para cada novo lote de componentes químicos. Aqui nós descrevemos o método para criar um sensor com concentrações que são normalmente utilizados para medições de sódio intracelular. </li><li> Em uma Cobertura de vapores químicos, a transferência de 100 l do 5 mg / ml CHIII em THF solução para o frasco optode. </li><li> Dissolver 5 mg de naix em 300 ml de THF e transferir 300 ml para o frasco optode, este se correlaciona com 5 mg de naix. </li><li> Dissolver uma alíquota de 5 mg do NaTFPB em 500 mL de THF e transferência de 20 l da solução para o frasco optode, este se correlaciona com 0,1 mg de NaTFPB. </li><li> Adicionar 80 mL de THF ao frasco optode. </li><li> A solução no frasco optode contém 30 mg de PVC, 60 mg de DOS, 5 mg de naix, 0,2 mg de NaTFPB, 0,5 mg de CHIII em 500 mL de THF. Suavemente vortex frasco este até que todos os PVC se dissolveu. O optode deve ser uma cor vermelha. A quantidade total de THF adicionada ao frasco deve ser de 500 mL, independentemente da relação de componentes utilizados. </li><li> Permitir que o THF restante no naix e alíquotas NaTFPB para evaporar durante a noite e re-rotular o tubo com a quantidade correta de produtos químicos. </li></ol> 2. Criando nanosensores <ol><li> Pipetar 100 mL de 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-glicero-3-Phosphoethanolamine-N - [Methoxy (polietilenoglicol) -550] em clorofórmio (PEG lipídios) em um frasco de vidro 4 dram. Permitir que o clorofórmio para evaporar em uma Cobertura de vapores químicos. Este processo pode ser acelerado por secagem a solução com azoto ou ar da casa. </li><li> Adicionar 4 ml da solução aquosa desejado para o frasco com PEG lipídios. Coloque o frasco em um jack de laboratório sob a ponta sonicando e elevar o frasco até que a ponta é cerca de 7 mm de profundidade na solução e sonicate a uma potência baixa sonicação por 30 segundos. Aqui usamos um Branson digitais sonifier definido para amplitude de 15% com um centímetro da ponta do chifre ½ passo diâmetro. A solução aquosa pode ser qualquer solução. Por exemplo, para determinar a resposta dos sensores usamos 10 mM HEPES pH 7,2 com base Trizma. </li><li> Enquanto a solução está sendo sonicado, misturar 50 ul do material optode com 50 ul de diclorometano em um tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Misturar com a pipeta para garantir uma mistura uniforme. </li><li> Ajuste o controle sonifier para sonicate por 3 minutos. Iniciar a sonicação e enquanto sonicando adicionar a solução de mistura optode ao frasco por imersão a ponta da pipeta na solução e dispensar as mL de solução 100 em uma rápida, a injeção mesmo. A solução deve ficar azul, depending na solução aquosa utilizada. </li><li> Permitir que a sonicação para continuar por aproximadamente 30 segundos depois abaixe a tomada de modo que a ponta sonicando é de cerca de 2 mm de profundidade em solução. Isso deve começar a arejar a solução ea solução vai se tornar opaco. Este passo ajuda a remover a THF residual e diclorometano da solução. </li><li> Uma vez sonicação é completa, puxar para cima a solução nanosensor para uma seringa de 5 ml. Anexar um filtro de seringa de 0,2 mm e dispensar a solução nanosensor em um frasco de vidro com tampa de tampa de rosca. A solução deve ser claro e azul se uma solução aquosa que contém menos de 10 mM de sódio e tem um pH inferior a cerca de 9 é usado. Caso contrário, ele não deve ter cor ou ser rosa. </li></ol> 3. Determinação da resposta nanonsensor Este método é usado para determinar a resposta de nanosensores projetado para medir de sódio intracelular. Concentrações diferentes são recomendados para ser usado para nanosensores concentração extracelular de sódio. <ol><li> Faça soluções estoque de 10 mM HEPES (0 Na) e cloreto de sódio 1M (NaCl) em 10 mM HEPES (1 M Na) e pH cada uma destas soluções para 7,2 usando base Trizma. Mix de soluções estoque de 0 e 1 M Na Na, em 50 ml tubos de centrífuga cônico para criar soluções com: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM concentrações de NaCl. </li><li> Use um fundo óptico placa de 96 poços para determinar a resposta. Adicione 100 ml de cada concentração de sódio a 3 poços em uma coluna. Isto irá produzir uma série de 3 x 10 poços. </li><li> A cada poço adicionar 100 ul de nanosensores preparados na hora e carregar em um fluorímetro de microplacas. Nós usamos um Molecular Devices Spectramax M3. </li><li> Leia todos os poços com os comprimentos de onda a seguir: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Excitação (nm) </td><td> Emissão (nm) </td><td> Cut-Off (nm) </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table> A intensidade nanosensor em cada comprimento de onda é dependente da concentração de sódio. O uso do comprimento de onda depende das aplicações. Intracelular para medições lenta dinâmica, usamos 488 nm/570 nm (excitação / emissão) e 488 nm nm/670 que nos permitem a relação dois comprimentos de onda e reduzir o ruído. <ol start="5"><li> Tradicionalmente, optode dados são convertidos para um valor que são: α = (I - I min) / (I max - I min), onde I é a intensidade em uma concentração de sódio dado, eu min é a menor intensidade nas medidas de resposta , e eu max é a maior intensidade nas medidas de resposta. Converter se essa relação de intensidade a 570 nm dividida pela intensidade a 670 nm ou a intensidade a 680 nm para α. </li><li> Use software de plotagem, Excel ou origem são normalmente utilizados em nosso laboratório, para traçar α versus o log da concentração de sódio, definindo o log da concentração de sódio de zero a -1. Ajustar uma curva sigmoidal para a resposta. A partir da curva, calcular a concentração de sódio a α = 0,5, que representa a concentração na qual o sensor ideal responde. </li><li> Ajustar a relação de CHIII, naix e NaTFPB na optode para criar nanosensores com ótima resposta em torno da concentração de sódio de interesse. </li></ol> 4. Imagem intracelular <ol><li> Para medições intracelular, o nanosensores são feitas em 5 de glicose mg / ml em água e microinjeção para as células. </li><li> Crescer ou transferência de células para um prato fundo de vidro ou uma câmara de imagem com um fundo lamela de vidro. </li><li> Incubar as células em meios de comunicação clara ou solução Tyrode é. Monte a câmara de imagem ou um prato em um microscópio de epifluorescência. Nós usamos uma Zeiss LSM 7 microscópio confocal. </li><li> Puxe capilar de vidro com um puxador de pipeta. Nós usamos um Sutter flamejante marrom p-97 com 1 mm de diâmetro externo, 0,78 mm de diâmetro de vidro, com um diâmetro em torno de 300-500 ponta final nm. </li><li> Reaterro da pipeta com a solução nanosensor usando uma seringa e uma agulha Hamilton, ou um carregador MICROTIP e uma pipeta. </li><li> Monte a pipeta em um suporte que é acoplado a um micromanipulador e conectados a um sistema de injeção de pressão controlada. Aqui usamos um Burleigh EXFO micromanipulador 6000 PCS e uma médica sistemas corporação injector. </li><li> Inferior a pipeta no topo da célula para o citoplasma e, às vezes é necessário &quot;tocar&quot; o titular do manipulador para perfurar a membrana. Injectar a solução nanosensor e rapidamente retirar a pipeta. </li></ol> 5. In vivo de imagens Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pela Northeastern University de Cuidados Animal e Uso Comissão. <ol><li> Nanosensorespara in vivo, imagens extracelular são feitas em tampão fosfato salina e ajustado para ter uma resposta óptima de sódio em uma concentração de sódio de 135 mM. </li><li> Para a injeção de configuração e imagem do nanosensores fluorescentes em camundongos, usamos o IVIS Lumina II e sua unidade de anestesia associada. Desinfectar a indução e câmaras de imagem. Lugar CD1 camundongos nude (aproximadamente 20g) na câmara de indução e expô-los a isoflurano. A porcentagem de vazão isoflurano e oxigênio administrado irá variar dependendo da espécie e peso de ratos. Aguarde os ratos para se tornar totalmente anestesiado. </li><li> Depois de os ratos são anestesiados, remover os ratos da câmara de indução e coloque dentro da câmara de imagem. Manter os ratos sob anestesia. Para cada rato, desinfectar as áreas de injeção desejada. </li><li> Encha uma seringa de insulina estéreis 31G com 10 mL de nanosensores certificando-se de remover todas as bolhas de ar. </li><li> Utilizando uma pinça, segure uma pequena prega de pele ao longo das costas do mouse no local da injeção desejada. Ao segurar a pele, insira a seringa na pele com o bisel voltado para cima e agulha, paralelamente à pele. </li><li> Antes de injetar os sensores, puxe o êmbolo da seringa para garantir a agulha não está inserido em um vaso sanguíneo. Então, gentilmente mover a agulha direita e esquerda para criar um bolso dentro da pele. Isso irá minimizar a pressão de volta que faz com que os sensores de vazamento para fora do local da injeção. Injetar os sensores e remova cuidadosamente a seringa. </li><li> Aplique uma suave pressão no local da injecção e limpe qualquer solução que pode ter vazado para fora do local da injeção. Isso irá minimizar a fluorescência dos sensores que não são injetadas na pele. </li><li> Repete as etapas 5,4 a 5.7 até que o número de áreas de injeção desejada seja atingida. Seis locais de injeção espaçados no lado esquerdo e direito das costas são recomendados. Para cada rato individual, a mudança de agulhas, se a agulha torna-se difícil inserir na pele. Agulhas não devem ser compartilhadas entre camundongos. Isso irá minimizar a transmissão da doença ou contaminação cruzada entre os ratos. </li><li> Para geração de imagens dos sensores de sódio fluorescente, que adquirir imagens tanto claro e fluorescente dos camundongos usando conjuntos de filtros que mais se igualava os 640 nm/680 nm (excitação / emissão) espectro da nanosensores e que também minimizar a autofluorescência da pele. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Curvas de resposta de cinco diferentes conjuntos nanosensor ao sódio. Cada conjunto representa nanosensores a partir de formulações optode diferentes que tinham a mesma quantidade de CHIII, NaTFPB, PVC e DOS, mas quantidades variáveis ​​de naix. Os dados foram convertidos para valores α usando a intensidades 639/680 nm. Os dados são uma média de 3 barras, o erro omitidos para maior clareza, com uma curva sigmoidal equipado com Origin. Nesta curva de resposta, a concentração máxima de sódio utilizado foi de 500 mM. Kd o da nanosensores de sódio de sódio variou de 10 mM (diamantes laranja) para cerca de 150 mM (quadrados pretos). <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Injected neonatal miócitos cardíacos. As células foram cultivadas em lamínula, montado em um microscópio e injetados com nanosensores de sódio. Mostrados são fluorescentes (excitação nm 639), brightfield e sobreposição. Observe que alguns clusters de sensor ocorre, mas as células têm morfologia normal, sensores têm difundido em todo o citosol e não há nenhuma carga nuclear. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Injeção subcutânea de camundongos com nanosensores de sódio. Nove injeções diferentes de nanosensores de sódio foram feitas para o espaço subcutâneo de ratos nude. Tanto o campo brilhante e imagens fluorescentes (640/680) são sobrepostas.

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A., Kopelman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+optical+PEBBLE+nanosensors+for+real-time+magnesium+ion+concentrations+inside+viable+cells.">Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells.</a> Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging.">in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A formação de nanosensores não deve demorar mais que 10 minutos uma vez a solução optode foi feito e os lipídios PEG secas. Optode não só podem ser feitas rapidamente, quando necessário, mas quando armazenado a 4 graus Celsius, que pode ser estável por meses. Nós mostramos que o nansensors, uma vez formadas, são estáveis ​​em solução de pelo menos uma semana;. Porém, cuidados devem ser tomados para evitar fotobranqueamento ao longo deste tempo, bloqueando a nanosensores da luz 6 Enquanto nanosensores de sódio foram demonstrados aqui, optodes foram criado para a maioria dos íons biologicamente relevantes, tais como potássio e cloreto. 10,12 Temos também estendeu essa tecnologia para pequenas moléculas como a glicose 13. Além de gerar nanosensores para monitorar diferentes analitos, estes nanosensores são passíveis de outras mudanças que irá torná-los úteis em experimentos mais biológico. Por exemplo, o revestimento de superfície, neste caso, poli (etileno glicol), pode facilmente ser mudado usando qualquer molécula anfifílicos que é solúvel em água. Isto permite a possibilidade de funcionalização essas nanopartículas para aplicações diferentes ou metas. O tamanho das nanopartículas também podem ser ajustados alterando o revestimento de superfície, a intensidade de sonicação ou o solvente utilizado. Indicadores de cálcio fluorescentes foram inestimáveis ​​na determinação de sinalização intracelular de cálcio, no entanto, não corantes sódio disponível sensíveis têm as mesmas características ideal. Optode nanopartículas pretende fornecer um método alternativo para íons de imagem intracelularmente tem estado em desenvolvimento há anos. 14 Temos construído sobre essa pesquisa anterior para criar nano-sensores específicos para geração de imagens de sódio intracelular que venha a fornecer um meio para entender como sinalização de sódio afeta a função celular e alterações na sinalização que levam a determinadas doenças. O uso de nanosensores fluorescente in vivo oferece um tempo real alternativa minimamente invasiva para analitos monitoramento sobre outros métodos, tais como sangue empates. 3 de sódio e glicose nanosensores baseado na tecnologia acima foram mostrados para acompanhar as mudanças em sódio e glicose, respectivamente, em vivo. 3,13 No entanto, atualmente existem limitações a este método como uma ferramenta de monitoramento. Por exemplo, os sensores devem conter um fluoróforo com um espectro suficientemente deslocado para o vermelho do infravermelho próximo, a fim de minimizar a autofluorescência de fundo da pele. 15 Em segundo lugar, a técnica de injeção de corrente não produz injeção uniforme da nanosensores que podem ser causados ​​por tais erros como variação na profundidade da injeção. Apesar destas limitações, o desenvolvimento destas nanosensores fluorescentes e sua demonstração bem sucedida poderia fazer esses sensores uma valiosa ferramenta de pesquisa e método para monitorar a saúde do paciente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do produto </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> IVIS Lumina Pacote Instrumento II </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD-1 Camundongos Nude </td><td> Charles River </td><td> Código tensão: 086 </td><td> Imunodeficientes </td></tr><tr><td> Seringas de insulina </td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 10/03 cc mL, 8mm, 31G </td></tr><tr><td> Alto peso molecular PVC </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Naix </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De vidro com paredes finas capilar </td><td> Sutter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lipídica PEG </td><td> Lipídeos Avanti Polar </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Fornece uma lista de produtos químicos e equipamentos utilizados neste procedimento. Todos os produtos químicos comuns não listados foram adquiridos da Sigma.

fluorescent nanoparticles for the measurement of ion concentration in biological systems

Homeostase de íons estreitamente regulada por todo o corpo é necessário para a prevenção de tais estados debilitantes como a desidratação. 1 Por outro lado, íons rápida no nível celular são necessários para iniciar os potenciais de ação em células excitáveis. Dois regulação de sódio desempenha um papel importante em ambos Nestes casos, no entanto, nenhum método existe atualmente para o monitoramento contínuo dos níveis de sódio in vivo 3 e 4 sondas de sódio intracelular não fornecem resultados semelhantes detalhada como sondas de cálcio. Em um esforço para preencher esses dois vazios, nanosensores fluorescentes foram desenvolvidos que podem monitorar as concentrações de sódio in vitro e in vivo. 5,6 Estes sensores são baseados em tecnologia de íon-seletivo optode e consistem de partículas poliméricas plastificadas em que o reconhecimento de sódio específicas elementos, pH-sensíveis fluoróforos, e aditivos são incorporados. 7-9 mecanicamente, o elemento de reconhecimento de sódio extratos de sódio para o sensor. 10 Essa extração faz com que o fluoróforo pH-sensíveis para liberar um íon hidrogênio para manter a neutralidade de carga dentro do sensor que faz com que uma mudança de fluorescência. Os sensores de sódio são reversíveis e seletivos para sódio mais potássio, mesmo em altas concentrações intracelulares. 6 Eles são cerca de 120 nm de diâmetro e são revestidos com polietileno glicol para dar biocompatibilidade. Usando técnicas de microinjeção, os sensores podem ser entregues no citoplasma das células onde foram mostrados para acompanhar a dinâmica temporal e espacial de sódio de bater miócitos cardíacos 11. Além disso, eles também têm rastreado em tempo real, alterações nas concentrações de sódio in vivo quando injetado por via subcutânea em camundongos 3 Aqui, vamos explicar em detalhe e demonstrar a metodologia para a fabricação de nano-sensores de sódio fluorescente e brevemente demonstrar a aplicações biológicas nosso laboratório utiliza o nanosensores para:. da microinjeção dos sensores em células, e da injeção subcutânea dos sensores em camundongos .

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Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Nanopartículas fluorescentes produzidas em nosso laboratório são usados ​​para concentrações de íons de imagem e fluxos de íons em sistemas biológicos como as células durante o fluido intersticial durante sinalização e homeostase fisiológica.

Nanopartículas fluorescentes para a medição da concentração de íons em Sistemas Biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

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Bioengineering

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Vídeo: Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodologia Elastografia por Ressonância Magnética para a Avaliação de engenharia de tecidos Crescimento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Bioengenharia

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) para intracelular Segmentação Aplicações

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Mesclando Ion polarização de concentração entre justapostos Troca Iônica Membranas para bloquear a propagação da Zona Polarização

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash NanoPrecipitation para o encapsulamento de compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Medição contínua do ruído biológico em Escherichia Coli Usando microscopia de lapso de tempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Ultrassom doppler transcranial funcional para monitoramento do fluxo sanguíneo cerebral

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivos de campo elétrico e magnético para estimulação de tecidos biológicos

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos mínimos e lineares para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...