JMD und MKB durch die IGERT Nanomedizin Science and Technology-Programm an der Northeastern University (Finanzierung von NCI und NSF gewähren DGE-0504331) gefördert. Diese Arbeit wurde auch von den National Institutes of Health National Institute of General Medical Sciences Stipendium R01 GM084366 finanziert. Wir danken auch Saumya Das und Anthony Rosenzweig von BIDMC in Boston für die Bereitstellung von Herzmuskelzellen und Kevin Bargeld für seinen Beitrag in der Tier-Protokoll Entwicklung.

1. Vorbereitung der Optode Vor der Optode werden Aliquots der Komponenten müssen so dass sie leicht gemessen und gespeichert werden. <ol><li> A 50 mg Natrium-Ionophor X (Naix) Fläschchen und eine 50 mg Natrium-Tetrakis [3,5-Bis (trifluormethyl) phenyl] borat (NaTFPB) wird jeweils bis in tetrahyrdofuran (THF) gebracht werden und aliquotiert in 1,5 ml Polystyrol Röhrchen. In einem Laborabzug lösen sich die 50 mg Naix in 1 ml THF in der Schifffahrt Fläschchen und mischen, um sicherzustellen, dass der Feststoff vollständig gelöst. Transfer 100 ul dieser Lösung in 10 separaten Zentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für NaTFPB. Lassen Sie das THF in einem Laborabzug über Nacht verdunsten, beschriften Sie die Röhrchen und legen Sie sie in einem 4-Grad-Kühlschrank für die Aufbewahrung. Dies schafft 5 mg Aliquots trocken Naix und NaTFPB. </li><li> Lösen Sie die Chromoionophor III (CHIII) in 1 ml THF und in ein 3 ml Glasflasche. Add another 1 ml THF zu der CHIII Versand Fläschchen, um restliche CHIII auflösen und addieren sie zum 3 ml Glasflasche. Es werden insgesamt 2 ml jetzt sein. Transfer 1 ml der CHIII in THF-Lösung mit zwei separaten 1,5 ml Glasfläschchen mit einem Teflon beschichteten Kappen. Bewahren Sie die CHIII Lösung in einem 4-Grad-Kühlschrank bei einer Endkonzentration von 5 mg / ml. </li></ol> Diese Aliquots und Lösungen werden benutzt, um die Optodenmaterials machen. <ol start="3"><li> Pipette 66 ul von Bis (2-ethylhexyl) sebacat (DOS) in ein 1,5 ml-Glas mit einem Teflon beschichtet Schraubverschluss - das ist die Optode Durchstechflasche. DOS ist eine zähflüssige Lösung so ist darauf zu achten, die richtige Menge der Lösung zu gewährleisten, um die Flasche übertragen wird. Das Volumen entspricht ca. 60 mg des DOS. </li><li> Abwiegen 30 mg hochmolekularer Poly (vinyl)-Chlorid (PVC) und übertragen diese auf die Optode Durchstechflasche. </li><li> Fügen Sie nun die aliquotiert funktionalen Komponenten, die Optode Fläschchen, um die gewünschte Optode erstellen. Die relativen Konzentrationen von CHIII, Naix und NaTFPB bestimmt die Reaktion des Sensors auf Natrium. Diese Konzentrationen können angepasst werden, um einen Sensor, der im Idealfall reagiert auf Konzentrationen intrazellulären, mit einem Kd-Wert von 10 mM oder extrazelluläre Konzentrationen, mit einer Kd von 150 mm aufweisen. Zusätzlich wird es wahrscheinlich Charge zu Charge Schwankungen der Chemikalien vom Hersteller und Kalibrierung der Sensoren ist notwendig, um festzustellen, ob die richtige Antwort für jede neue Charge von chemischen Komponenten auftritt. Hier beschreiben wir die Methode, einen Sensor mit Konzentrationen, die üblicherweise für die intrazelluläre Natrium-Messungen werden zu schaffen. </li><li> In einem Laborabzug, Transfer 100 ul der 5 mg / ml CHIII in THF-Lösung, die Optode Durchstechflasche. </li><li> Lösen Sie 5 mg Naix in 300 ul THF und Transfer 300 pl der Optode Fläschchen, diese korreliert mit 5 mg Naix. </li><li> Lösen Sie eine 5 mg Aliquot der NaTFPB in 500 ul THF und Transfer 20 ul der Lösung des Optode Fläschchen, diese korreliert mit 0,1 mg NaTFPB. </li><li> Add 80 ul THF die Optode Durchstechflasche. </li><li> Die Lösung in der Optode Durchstechflasche enthält 30 mg PVC, 60 mg DOS, 5 mg Naix, 0,2 mg NaTFPB, 0,5 mg CHIII in 500 ul von THF. Vorsichtig vortexen diese Phiole, bis alle PVC gelöst hat. Die Optode sollte eine rote Farbe. Der Gesamtbetrag der THF hinzugefügt, um die Durchstechflasche 500 ul unabhängig von dem Verhältnis der Komponenten verwendet werden. </li><li> Lassen Sie die restliche THF in der Naix und NaTFPB Aliquots über Nacht und re-label das Rohr mit der richtigen Menge von chemischen verdampfen. </li></ol> 2. Erstellen Nanosensoren <ol><li> Je 100 ul 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin-N - [Methoxy (Polyethylenglykol) -550] in Chloroform (PEG-Lipid) in ein 4-DRAM-Glasflasche. Lassen Sie das Chloroform in einem Laborabzug verdampfen. Dieser Prozess kann durch Trocknen der Lösung mit Stickstoffgas oder Stallluft beschleunigt werden. </li><li> 4 ml des gewünschten wässrigen Lösung in die Durchstechflasche mit PEG-Lipid. Legen Sie die Durchstechflasche auf einer Hebebühne unter dem Beschallung Spitze und heben Sie die Flasche, bis die Spitze ist ca. 7 mm tief in die Lösung und beschallen mit einer niedrigen Beschallung Strom für 30 Sekunden. Hier verwenden wir eine Branson digitalen sonifier auf 15% Amplitude mit einem ½-Zoll-Spitzendurchmesser Schritt Horn. Die wässrige Lösung kann eine Lösung sein. Zum Beispiel, um zu bestimmen, die Reaktion der Sensoren verwenden wir 10 mM HEPES pH 7,2 mit Trizma Basis. </li><li> Während die Lösung wird beschallt wird, mischen 50 ul der Optodenmaterials mit 50 ul Dichlormethan in einem 0,6 ml Reaktionsgefäß. Mix mit der Pipette, um sicherzustellen, gleichmäßige Durchmischung. </li><li> Passen Sie die sonifier Steuerung für 3 Minuten beschallt. Starten Sie die Beschallung und während Beschallung hinzufügen Optode Mischung Lösung für das Fläschchen durch Eintauchen der Pipettenspitze in die Lösung und Abgabe der 100 ul Lösung in einer schnellen, sogar Injektion. Die Lösung sollte blau, dependen auf die wässrige Lösung eingesetzt. </li><li> Lassen Sie die Beschallung für ca. 30 Sekunden, dann weiter unten die Buchse, so dass die Beschallung Spitze ca. 2 mm tief in Lösung ist. Dies sollte damit beginnen, die Lösung zu belüften und die Lösung wird undurchsichtig. Dieser Schritt hilft, um das restliche THF und Dichlormethan aus der Lösung zu entfernen. </li><li> Nach Beschallung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nanosensor Lösung in eine 5 ml Spritze. Bringen Sie eine 0,2 um Spritzenfilter und Abgeben der Nanosensor Lösung in einen Glaskolben mit Schraubverschluss Kappe. Die Lösung sollte klar und blau, wenn eine wässrige Lösung, die weniger als 10 mM Natrium enthält und einen pH-Wert weniger als 9 verwendet wird. Ansonsten sollte es keine Farb-oder rosa sein. </li></ol> 3. Bestimmen nanonsensor Antwort Diese Methode wird verwendet, um die Reaktion der Nanosensoren entwickelt, um intrazelluläre Natrium-Messung zu bestimmen. Unterschiedliche Konzentrationen wird empfohlen, für die extrazelluläre Natrium-Konzentration Nanosensoren eingesetzt werden. <ol><li> Machen Stammlösungen von 10 mM HEPES (0 Na) und 1 M Natriumchlorid (NaCl) in 10 mM HEPES (1 M Na) und pH-Wert jeder dieser Lösungen auf 7,2 mit Trizma Basis. Mix Stammlösungen von 0 Na und 1 M Na in 50 ml konische Röhrchen, um Lösungen mit zu erstellen: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM NaCl-Konzentrationen. </li><li> Verwenden Sie ein optisches Boden 96-Well-Platte, um die Reaktion zu bestimmen. 100 l von jeder Konzentration von Natrium zu 3 Brunnen in einer Spalte. Dies erzeugt ein Array von 3 x 10 Brunnen. </li><li> Zu jedem Well 100 ul der frisch zubereiteten Nanosensoren und Last in einem Mikroplatten Fluorometer. Wir verwenden eine Molecular Devices Spectramax M3. </li><li> Lesen Sie jede auch mit den folgenden Wellenlängen: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Speisung (nm) </td><td> Emission (nm) </td><td> Cut-Off (nm) </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table> Die Nanosensor Intensität bei jeder Wellenlänge ist abhängig von der Natrium-Konzentration. Die Verwendung der Wellenlänge hängt von den Anwendungen. Für intrazelluläre langsame Dynamik Messungen verwenden wir 488 nm/570 nm (Anregung / Emission) und 488 nm nm/670, die uns erlauben, Verhältnis der beiden Wellenlängen und Rauschen zu reduzieren. <ol start="5"><li> Traditionell wird Optode Daten zu einem Werte, die konvertiert werden: α = (I - I min) / (I max - I min), wo ich die Intensität an einem bestimmten Natrium-Konzentration, I min ist der niedrigste Intensität in der Antwort-Messungen und I max ist die höchste Intensität in der Antwort-Messungen. Convert entweder das Verhältnis der Intensität bei 570 nm durch die Intensität bei 670 nm oder die Intensität bei 680 nm zu α unterteilt. </li><li> Verwenden Sie Plotten Software, Excel oder Origin typischerweise in unserem Labor benutzt, um α gegen den log der Natriumkonzentration Grundstück, Einstellung der log von Null-Natrium-Konzentration auf -1. Fit eine sigmoide Kurve, um die Antwort. Aus der Kurve, berechnet die Natrium-Konzentration bei α = 0,5, die die Konzentration, bei der der Sensor optimal reagiert darstellt. </li><li> Passen Sie das Verhältnis von CHIII, Naix und NaTFPB in der Optode zu Nanosensoren mit optimaler Reaktion rund um die Natrium-Konzentration von Interesse zu erzeugen. </li></ol> 4. Intrazelluläre Bildgebung <ol><li> Für intrazelluläre Messungen werden die Nanosensoren in 5 mg / ml Glucose in Wasser und mikroinjiziert in die Zellen. </li><li> Wachsen oder Übertragung Zellen zu einem Glasboden Schüssel oder ein bildgebendes Kammer mit einem Deckglas unten. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen in klaren Medien oder Tyrode-Lösung. Montieren Sie den Imaging-Kammer oder einen Teller auf einem Epifluoreszenzmikroskop. Wir verwenden ein Zeiss LSM 7 konfokalen Mikroskop. </li><li> Pull Kapillare aus Glas mit einer Pipette Abzieher. Wir verwenden eine sutter flammenden braun p-97 mit 1 mm OD, 0,78 mm ID Glas, ein letzter Tipp Durchmesser rund 300-500 nm. </li><li> Backfill die Pipette mit Nanosensor Lösung mit einer Spritze und einem Hamilton Nadel oder ein Mikrospitze Lader und eine Pipette. </li><li> Montieren Sie die Pipette in eine Halterung, die an einem Mikromanipulator befestigt ist und mit einem Druck gesteuertes Einspritzsystem. Hier verwenden wir eine Burleigh EXFO PCS 6000 Mikromanipulator und ein Medical Systems Corporation Injektor. </li><li> Senken Sie die Pipette auf der Zelle und in das Zytoplasma, manchmal ist es notwendig, &quot;Tap&quot; den Manipulator Halter zu durchdringen die Membran. Injizieren Sie die Lösung Nanosensor und schnell zurückziehen Pipette. </li></ol> 5. In-vivo-Bildgebung Alle Verfahren wurden überarbeitet und durch Northeastern University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. <ol><li> Nanosensorsfür in vivo, extrazelluläre Bildgebung sind in Phosphat aus Kochsalzlösung und angepasst, um eine optimale Reaktion auf Natrium in einer Natrium-Konzentration von 135 mm haben. </li><li> Für die Injektion Set-up und die Abbildung der Fluoreszenz-Nanosensoren in Mäusen, verwenden wir die IVIS Lumina II und der damit verbundenen Narkose-Einheit. Desinfizieren Sie die Induktions-und Imaging-Kammern. Legen Sie CD1 Nacktmäusen (ca. 20g) in der Induktion Kammer und schützen Sie sie vor Isofluran. Der prozentuale Anteil von Isofluran und Sauerstoff verabreicht Durchfluss variiert je nach Art und Gewicht der Mäuse. Warten Sie, bis die Mäuse voll narkotisiert. </li><li> Nach der Mäuse betäubt sind, entfernen Sie die Mäuse aus der Induktion Kammer und Ort in der Imaging-Kammer. Halten Sie den Mäusen unter Narkose. Für jede Maus, desinfizieren Sie die gewünschte Injektion Bereichen. </li><li> Füllen Sie eine sterile 31G Insulinspritze mit 10 ul Nanosensoren achten Sie darauf, alle Luftblasen zu entfernen. </li><li> Mit einer Pinzette fassen Sie eine kleine Hautfalte an der Rückseite der Maus auf die gewünschte Einstichstelle. Fassen Sie die Haut, die Spritze in die Haut mit der Fase nach oben, und die Nadel parallel zur Haut. </li><li> Vor Injektion der Sensoren, ziehen wieder an der Spritze, damit die Nadel nicht in ein Blutgefäß eingeführt. Dann vorsichtig bewegen Sie die Nadel nach rechts und links, um eine Tasche in der Haut zu schaffen. Dies minimiert den Staudruck der die Sensoren ein Austreten aus der Injektionsstelle verursacht. Spritzen Sie die Sensoren und entfernen Sie vorsichtig die Spritze. </li><li> Durch leichten Druck auf die Injektionsstelle und wischen Sie jede Lösung, die aus der Injektionsstelle können zugespielt haben. Dies minimiert die Fluoreszenz von Sensoren, die nicht in die Haut injiziert werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,4 bis 5,7, bis die Anzahl der gewünschten Einspritz Bereichen erreicht ist. Sechs Injektionen gleichmäßig auf der linken und rechten Seite des Rückens verteilt werden empfohlen. Für jede einzelne Maus, ändern Nadeln, wenn die Nadel wird schwierig, in die Haut legen. Nadeln sollten nicht zwischen Mäusen geteilt werden. Dies wird die Übertragung von Krankheiten oder Kreuzkontamination zwischen Mäusen zu minimieren. </li><li> Für die Bildgebung der Natrium-Fluoreszenz-Sensoren, so erwerben wir sowohl Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder von den Mäusen mit Filter setzt, dass die meisten eng aufeinander abgestimmt die 640 nm/680 nm (Anregung / Emission) Spektrum der Nanosensoren und minimieren auch die Autofluoreszenz der Haut. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Ansprechkurven von fünf verschiedenen Nanosensor setzt auf Natrium. Jeder Satz stellt Nanosensoren aus verschiedenen Optode Formulierungen, die die gleiche Menge an CHIII, NaTFPB, PVC-und DOS, aber unterschiedliche Mengen an Naix hatte. Die Daten wurden auf α-Werte mit den 639/680 nm Intensitäten umgewandelt. Die Daten werden im Durchschnitt 3, Fehlerbalken weggelassen, mit einem ausgestattet sigmoide Kurve mit Origin. In dieser Kurve wurde die maximale Konzentration von Natrium verwendet 500 mM. Die Kd der Natrium-Nanosensoren für Natrium reichten von 10 mM (orange Diamanten) auf etwa 150 mM (schwarze Quadrate). <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Neonatalen Herzmuskelzellen injiziert. Die Zellen wurden auf Deckgläsern kultiviert, montiert auf einem Mikroskop und injiziert mit Natrium Nanosensoren. Dargestellt sind fluoreszierende (639 nm Anregung), Hellfeld, und Overlay. Beachten Sie, dass einige Sensor-Clustering, tritt aber die Zellen haben eine normale Morphologie, Sensoren haben in der gesamten Cytosol verbreitet und es gibt keine nukleare loading. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Subkutane Injektion von Mäusen mit Natrium Nanosensoren. Neun verschiedene Injektionen von Natrium Nanosensoren wurden in das subkutane Raum von Nacktmäusen gemacht. Beide Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder (640/680) überlagert werden.

<ol>
	<li>Adrogue, H. J., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyponatremia.">Hyponatremia.</a> N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).</li><li>Kim, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BACE1+regulates+voltage-gated+sodium+channels+and+neuronal+activity.">BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity.</a> Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).</li><li>Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+sodium+concentration+continuously+monitored+with+fluorescent+sensors.">in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors.</a> Integr Biol (Camb). , (2010).</li><li>Minta, A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+nano-optodes+incorporating+quantum+dots.">Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).</li><li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+ion-selective+nanosensors+for+intracellular+analysis+with+improved+lifetime+and+size.">Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size.</a> Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).</li><li>Schaffar, B., Wolfbeis, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium-selective+optrode.">A sodium-selective optrode.</a> Mikrochim Acta III. III, 109-109 (1989).</li><li>Seiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sodium-selective+optode+membranes+based+on+neutral+ionophores+and+assay+of+sodium+in+plasma.">Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma.</a> Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).</li><li>Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensor+for+sodium+based+on+ion-pair+extraction+and+fluorescence.">Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence.</a> Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).</li><li>Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrier-Based+Ion-Selective+Electrodes+and+Bulk+Optodes.+1.+General+Characteristics.">Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics.</a> Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).</li><li>Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sodium+dynamics+in+isolated+cardiomyocytes+using+fluorescent+nanosensors.">Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).</li><li>Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-Selective+Optodes+Measure+Extracellular+Potassium+Flux+in+Excitable+Cells.">Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).</li><li>Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , .</li><li>Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+optical+PEBBLE+nanosensors+for+real-time+magnesium+ion+concentrations+inside+viable+cells.">Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells.</a> Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging.">in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).</li></ol>

Die Bildung von Nanosensoren sollte nicht länger als 10 Minuten nach dem Optode Lösung gemacht worden ist und die PEG Lipid getrocknet. Optode kann nicht nur schnell gemacht, wenn nötig, aber bei 4 Grad Celsius gelagert, können sie über Monate stabil. Wir haben gezeigt, dass die nansensors, einmal gebildet, stabil in Lösung für mindestens eine Woche;. Aber darauf zu achten, um zu verhindern Ausbleichen in dieser Zeit durch die Blockierung der Nanosensoren von Licht 6 Während Natrium Nanosensoren hier gezeigt wurden, haben Optoden worden erstellt für die meisten biologisch relevanten Ionen wie Kalium und Chlorid. 10,12 Wir haben auch diese Technologie, um kleine Moleküle wie Glukose erweitert haben. 13 Neben der Erzeugung von Nanosensoren auf verschiedene Analyten zu überwachen, sind diese Nanosensoren zugänglich andere Änderungen, um sie sinnvoll in den meisten biologischen Experimente werden. Zum Beispiel, der Oberflächenbeschichtung, in diesem Fall Poly (Ethylenglykol), kann leicht geändert mit jedem amphiphilen Molekül, das wasserlöslich ist. Dies ermöglicht die Möglichkeit der Funktionalisierung dieser Nanopartikel für verschiedene Anwendungen oder Ziele. Die Größe der Nanopartikel können auch durch Änderung der Oberflächenbeschichtung, die Beschallung Intensität oder das verwendete Lösungsmittel eingestellt werden. Calcium fluoreszierenden Indikatoren wurden von unschätzbarem Wert bei der Bestimmung intrazellulären Calcium-Signalgebung, haben jedoch keine verfügbaren Natrium Farbstoffe die gleiche ideale Eigenschaften. Optode Nanopartikel sollen eine alternative Methode für die Bildgebung Ionen intrazellulär haben in der Entwicklung schon seit Jahren bieten. 14 Wir haben auf dieser vorheriger Forschungsarbeiten, um Nanosensoren spezifisch für intrazelluläre Natrium-Bildgebung, die hoffentlich wird ein Mittel zu verstehen, wie Natrium-Signalisierung zelluläre Funktion und wirkt erstellen Änderungen in der Signaltechnik, die für bestimmte Krankheiten führen. Die Verwendung von fluoreszierenden Nanosensoren in vivo bietet eine Echtzeit-minimal-invasive Alternative zur Überwachung Analyten im Vergleich zu anderen Methoden wie Blutabnahmen. 3 Natrium und Glukose Nanosensoren auf der Technologie basiert oben wurde gezeigt, dass Veränderungen in Natrium und Glukose Track, bzw. in vivo. 3,13 Allerdings existieren derzeit Einschränkungen dieser Methode als Monitoring-Tool. Zum Beispiel die Sensoren ein Fluorophor mit einem Spektrum hinreichend auf die Nah-Infrarot-Rot verschoben, um Hintergrund-Autofluoreszenz von der Haut zu minimieren. 15 Zweitens enthalten muss, wird die aktuelle Injektionstechnik nicht produzieren einheitliche Injektion des Nanosensoren, die durch solche verursacht werden können, Fehler als Variation in Injektion Tiefe. Trotz dieser Einschränkungen könnte die Entwicklung dieser fluoreszierenden Nanosensoren und ihre erfolgreiche Demonstration machen diese Sensoren eine unschätzbare Recherche-Tool und Verfahren zur Überwachung der Gesundheit der Patienten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Product Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> IVIS Lumina II Instrument Package </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD-1 Nacktmäusen </td><td> Charles River </td><td> Dehnungs-Code: 086 </td><td> Immundefizienten </td></tr><tr><td> Insulinspritzen </td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3 / 10 cc mL, 8mm, 31G </td></tr><tr><td> High Molecular Weight PVC </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Naix </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dünnwandige Kapillare aus Glas </td><td> Sutter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG Lipid </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Bietet eine Liste von Chemikalien und Ausrüstungen in diesem Verfahren verwendet. Alle gängigen Chemikalien, die nicht aufgelistet wurden von Sigma bezogen.

fluorescent nanoparticles for the measurement of ion concentration in biological systems

Streng reguliert Ionen-Homöostase im Körper ist notwendig für die Verhütung solcher schwächende Zustände wie Austrocknung. 1 In Kontrast, schnelle Ionenflüsse auf zellulärer Ebene für die Einleitung Aktionspotentiale in erregbaren Zellen erforderlich sind. 2 Natrium Regulierung spielt eine wichtige Rolle sowohl in der diesen Fällen, jedoch keine Methode derzeit für die kontinuierliche Überwachung Natrium-Werte in vivo 3 und intrazellulären Natrium-Sonden 4 nicht bereitstellen ähnlich detaillierte Ergebnisse als Calcium-Sonden. In dem Bemühen, diese beiden Hohlräume zu füllen, haben fluoreszierende Nanosensoren entwickelt, die Natrium-Konzentrationen in vitro und in vivo zu überwachen. 5,6 Diese Sensoren sind auf ionenselektive Optode Technologie und bestehen aus Weich-polymeren Teilchen in die Natrium-spezifische Erkennung Elemente, pH-sensitive Fluorophore und Zusatzstoffe eingebettet sind. 7-9 Mechanistisch extrahiert die Natrium-Anerkennung Element Natrium in den Sensor. 10 Diese Extraktion bewirkt, dass der pH-sensitive Fluorophor in einer Wasserstoff-Ionen-Freisetzung in Ladungsneutralität innerhalb des Sensors, die Ursachen zu erhalten eine Änderung in der Fluoreszenz. Die Natrium-Sensoren sind reversibel und selektiv für Natrium über Kalium auch bei hohen intrazellulären Konzentrationen. 6 Sie sind ungefähr 120 nm im Durchmesser und mit Polyethylenglykol beschichtet sind, um Biokompatibilität zu vermitteln. Mit Mikroinjektion Techniken können die Sensoren in das Zytoplasma der Zellen, wo sie gezeigt haben, die zeitliche und räumliche Dynamik Natrium schlagen Herzmuskelzellen Monitor geliefert werden. 11 Darüber hinaus haben sie auch Änderungen in Echtzeit in Natrium-Konzentrationen in vivo verfolgt, wenn sie injiziert subkutan in Mäusen 3 Im Folgenden stellen wir im Detail zu erklären und demonstrieren die Methodik für die Herstellung fluoreszierender Natrium Nanosensoren und kurz zeigen die biologische Anwendungen unserem Labor verwendet die Nanosensoren für:. die Mikroinjektion der Sensoren in die Zellen, und die subkutane Injektion der Sensoren in Mäuse .

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems at JoVE.com

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Fluoreszierende Nanopartikel in unserem Labor hergestellt werden, für die Bildgebung Ionenkonzentrationen und Ionenströme in biologischen Systemen wie Zellen während der Signalisierung und der interstitiellen Flüssigkeit während der physiologischen Homöostase eingesetzt.

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

fluorescent-nanoparticles-for-measurement-ion-concentration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.3K Aufrufe.  Northeastern University. Fluoreszierende Nanopartikel in unserem Labor hergestellt werden, für die Bildgebung Ionenkonzentrationen und Ionenströme in biologischen Systemen wie Zellen während der Signalisierung und der interstitiellen Flüssigkeit während der physiologischen Homöostase eingesetzt.

Serie: Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Magnet-Resonanz-Elastographie Methodik für die Beurteilung von Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Wachstum

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Forschung

Biotechnik

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Zusammenführen von Ionenkonzentration Polarisierung zwischen Juxtaposed Ionenaustauschermembranen zu blockieren die Ausbreitung der Polarisations Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash-NanoPrecipitation für die Kapselung der hydrophoben und hydrophilen Verbindungen in Polymeren Nanopartikel

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia Coli mittels Zeitraffermikroskopie

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Funktioneller transkranialer Doppler-Ultraschall zur Überwachung des zerebralen Blutflusses

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Schnelle, enzymatische Methoden zur Amplifikation minimaler, linearer Templates für das Protein-Prototyping mit zellfreien Systemen

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...