JMD e MKB sono finanziati attraverso la scienza e la nanomedicina IGERT programma Technology presso la Northeastern University (finanziamenti da NSC e NSF concedere DGE-0504331). Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health National Institute of General Medical Sciences di Grant R01 GM084366. Ringraziamo anche Saumya Das e Anthony Rosenzweig di BIDMC a Boston per la fornitura di miociti cardiaci e Cash Kevin per il suo contributo nello sviluppo del protocollo animale.

1. Preparazione del optode Prima di effettuare il optode, aliquote delle componenti sono necessità in modo che possano essere facilmente misurato e memorizzato. <ol><li> A 50 mg di sodio ionoforo X (NaIX) e una fiala da 50 mg di sodio tetrakis [3,5-bis (trifluorometil) fenil] borato (NaTFPB) sarà ogni essere educato in tetrahyrdofuran (THF) e aliquotati in provette da 1,5 ml in polistirolo centrifuga. In una cappa, sciogliere i 50 mg di NaIX in 1 ml di THF nel flaconcino di spedizione e mescolare per garantire che il solido si è completamente sciolto. Trasferire 100 ml di questa soluzione in 10 provette separate. Ripetere l&#39;operazione per NaTFPB. Lasciare che il THF a evaporare in una cappa durante la notte, etichettare le provette da centrifuga e metterli in frigorifero 4 gradi per la conservazione. Questo crea 5 mg di aliquote secche NaIX e NaTFPB. </li><li> Sciogliere il III Chromoionophore (CHIII) in 1 ml di THF e trasferimento in un flaconcino da 3 ml di vetro. Aggiungere un altro 1 ml di THF al flaconcino di spedizione CHIII per sciogliere ogni residua CHIII e aggiungere questo al flaconcino da 3 ml di vetro. Ci sarà un totale di 2 ml ora. Trasferire 1 ml di soluzione CHIII in THF a due fiale 1,5 ml separare vetro con un tappi teflon. Conservare la soluzione CHIII in frigorifero a 4 gradi la concentrazione finale di 5 mg / ml. </li></ol> Queste aliquote e le soluzioni saranno utilizzati per rendere il materiale optode. <ol start="3"><li> Pipettare 66 ml di bis (2-etilesile) sebacato (DOS) in una fiala 1,5 ml di vetro con tappo a vite rivestiti in teflon - questa è la fiala optode. DOS è una soluzione viscosa così la cura deve essere adottate per garantire la giusta quantità di soluzione è trasferito al flaconcino. Il volume corrisponde a ~ 60 mg di DOS. </li><li> Pesare 30 mg di alto peso molecolare poli (vinile) cloruro (PVC) e trasferire questa nella fiala optode. </li><li> Ora aggiungere i componenti aliquotati funzionali al flaconcino optode per creare il optode desiderato. La concentrazione relativa di CHIII, NaIX e NaTFPB determinerà la risposta del sensore di sodio. Queste concentrazioni possono essere regolati per avere un sensore che risponde idealmente alle concentrazioni intracellulari, con Kd di 10 mm, o concentrazioni extracellulari, con un Kd di 150 mm. Inoltre, ci sarà probabilmente lotto a lotto variabilità delle sostanze chimiche da parte del fornitore e la calibrazione dei sensori è necessario determinare se la risposta corretta è che si verificano per ogni nuovo lotto di componenti chimici. Qui si descrive il metodo per creare un sensore con concentrazioni che sono tipicamente utilizzati per le misure di sodio intracellulare. </li><li> In una cappa, trasferire 100 ul dei 5 mg / ml CHIII in soluzione THF al flaconcino optode. </li><li> Sciogliere 5 mg di NaIX in 300 ml di THF e trasferire 300 ul al flaconcino optode, questo è correlato a 5 mg di NaIX. </li><li> Sciogliere a 5 mg aliquota del NaTFPB in 500 ml di THF e trasferire 20 microlitri della soluzione nel flacone optode, questo è correlato a 0,1 mg di NaTFPB. </li><li> Aggiungere 80 ml di THF al flaconcino optode. </li><li> La soluzione nel flacone optode contiene 30 mg di PVC, 60 mg di DOS, 5 mg di NaIX, 0,2 mg di NaTFPB, 0,5 mg di CHIII in 500 ml di THF. Delicatamente vortice questo flaconcino fino a quando tutto il PVC è dissolta. Il optode dovrebbe essere un colore rosso. La quantità totale di THF aggiunto al flaconcino deve essere 500 microlitri indipendentemente dal rapporto dei componenti utilizzati. </li><li> Lasciare che il THF rimanenti nel NaIX e aliquote NaTFPB evaporare durante la notte e ri-etichettare il tubo con la giusta quantità di sostanze chimiche. </li></ol> 2. La creazione di nanosensori <ol><li> Pipettare 100 l di 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-glicero-3-Phosphoethanolamine-N - [metossi (polietilenglicole) -550] in cloroformio (PEG-lipidi) in un flaconcino da 4 bicchierino di vetro. Lasciare che il cloroformio evaporare in una cappa. Questo processo può essere accelerato con l&#39;essiccazione la soluzione con azoto gas o aria casa. </li><li> Aggiungere 4 ml di soluzione acquosa desiderato nella fiala con PEG-lipidico. Posizionare il flaconcino su una presa di laboratorio sotto la punta sonicating ed aumentare il flaconcino fino a quando la punta è di circa 7 mm di profondità nella soluzione e sonicare a ultrasuoni a bassa potenza per 30 secondi. Qui usiamo un Branson digitale sonifier impostato al 15% di ampiezza con un corno ½ pollici passo diametro della punta. La soluzione acquosa può essere qualsiasi soluzione. Ad esempio, per determinare la risposta dei sensori che usiamo HEPES 10 mM pH 7,2 con base trizma. </li><li> Mentre la soluzione viene sonicato, mescolare 50 ml di materiale optode con 50 ml di diclorometano in un tubo 0,6 ml microcentrifuga. Mescolare con la pipetta per assicurare una miscelazione uniforme. </li><li> Regolare il controllo sonifier a ultrasuoni per 3 minuti. Avviare la sonicazione e mentre sonicating aggiungere la soluzione optode miscela al flaconcino immergendo la punta della pipetta nella soluzione e la distribuzione dei 100 ml di soluzione in una rapida, anche l&#39;iniezione. La soluzione dovrebbe diventare blu, depeending della soluzione acquosa utilizzata. </li><li> Lasciare che la sonicazione proseguire per circa 30 secondi, quindi abbassare la presa in modo che la punta sonicating è di circa 2 mm di profondità in soluzione. Questo dovrebbe iniziare a aerare la soluzione e la soluzione diventa opaco. Questo passaggio consente di rimuovere il residuo e THF diclorometano dalla soluzione. </li><li> Una volta sonicazione è completa, tirare su la soluzione nanosensori in una siringa da 5 ml. Collegare un filtro da 0,2 micron siringa e dispensare la soluzione nanosensori in un flaconcino di vetro con tappo a vite in alto. La soluzione deve essere chiaro e blu se una soluzione acquosa che contiene meno di 10 mM di sodio ed ha un pH inferiore a circa 9 viene utilizzato. Altrimenti, si dovrebbe avere alcun colore o rosa. </li></ol> 3. Determinazione risposta nanonsensor Questo metodo è utilizzato per determinare la risposta di nanosensori progettato per misurare sodio intracellulare. Diverse concentrazioni sono consigliati da utilizzare per nanosensori extracellulare concentrazione di sodio. <ol><li> Fai soluzioni stock di 10 HEPES mM (0 Na) e cloruro di sodio 1M (NaCl) in 10 mM HEPES (1 M Na) ed il pH ognuna di queste soluzioni a 7,2 con base trizma. Mescolare le soluzioni stock di 0 e 1 M Na Na in 50 ml provette per centrifuga coniche per creare soluzioni con: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 le concentrazioni mM NaCl. </li><li> Utilizzare un fondo ottico 96 pozzetti per determinare la risposta. Aggiungere 100 ml di ogni concentrazione di sodio di 3 pozzi in una colonna. Questo produrrà una serie di 3 x 10 pozzi. </li><li> Per ogni pozzetto aggiungere 100 ml di nanosensori preparati al momento e caricare in un fluorimetro per micropiastre. Usiamo un Molecular Devices Spectramax M3. </li><li> Leggi ogni bene con le lunghezze d&#39;onda seguenti: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Eccitazione (nm) </td><td> Emissione (nm) </td><td> Cut-Off (nm) </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table> L&#39;intensità nanosensori ad ogni lunghezza d&#39;onda dipende dalla concentrazione di sodio. L&#39;uso della lunghezza d&#39;onda dipende dalle applicazioni. Per le misurazioni intracellulari lenta dinamica, usiamo nm/570 488 nm (eccitazione / emissione) e 488 nm nm/670 che ci permettono di rapporto tra le due lunghezze d&#39;onda e ridurre il rumore. <ol start="5"><li> Tradizionalmente, optode dati viene convertito in un valore che sono: α = (I - I min) / (I max - I min), dove I è l&#39;intensità ad una concentrazione di sodio dato, I min è la più bassa intensità nelle misure di risposta , e io max è la massima intensità nelle misure di risposta. Convertire il rapporto di intensità a 570 nm divisa per l&#39;intensità a 670 nm o l&#39;intensità a 680 nm a α. </li><li> Utilizzare un software tramando, Excel o origine sono tipicamente utilizzati nel nostro laboratorio, per tracciare α contro il log della concentrazione di sodio, l&#39;impostazione del log della concentrazione di sodio zero a -1. Montare una curva sigmoidale alla risposta. Dalla curva, calcolare la concentrazione di sodio ad α = 0,5 che rappresenta la concentrazione alla quale il sensore risponde in modo ottimale. </li><li> Regolare il rapporto di CHIII, NaIX e NaTFPB nel optode per creare nanosensori con risposta ottimale intorno alla concentrazione di sodio di interesse. </li></ol> 4. L&#39;imaging intracellulare <ol><li> Per le misure intracellulari, il nanosensori sono realizzati in 5 mg / ml di glucosio in acqua e microiniezione nelle cellule. </li><li> Crescere o trasferire le cellule di un piatto fondo di vetro o di una camera di imaging con fondo di vetro coprioggetti. </li><li> Incubare le cellule nei media chiara o la soluzione di Tyrode. Montare la camera di immagini o un piatto su un microscopio a epifluorescenza. Usiamo un Zeiss LSM 7 microscopio confocale. </li><li> Tirare capillare di vetro con un estrattore pipetta. Usiamo un sutter fiammeggiante marrone p-97 con 1 mm di diametro, 0,78 mm ID vetro, ad un diametro punta finale intorno a 300-500 nm. </li><li> Backfill la pipetta con la soluzione di nanosensori usando una siringa e un ago Hamilton, o un caricatore microtip e una pipetta. </li><li> Montare la pipetta in un supporto che è collegato a un micromanipolatore e collegato ad un sistema di controllo pressione di iniezione. Qui usiamo un Burleigh EXFO 6000 PCS micromanipolatore e un medico Systems Corporation iniettore. </li><li> Abbassare la pipetta sulla parte superiore del cellulare e nel citoplasma, a volte è necessario &quot;toccare&quot; il titolare del manipolatore di perforare la membrana. Iniettare la soluzione di nanosensori e rapidamente ritirare la pipetta. </li></ol> 5. Imaging in vivo Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati da Animal Care Northeastern University e del comitato Usa. <ol><li> Nanosensoriin vivo, immagini extracellulare sono realizzati in tampone fosfato salino e regolata per avere una risposta ottimale al sodio ad una concentrazione di sodio di 135 mm. </li><li> Per l&#39;iniezione set-up e imaging del nanosensori fluorescenti nei topi, si usa il IVIS Lumina II e della sua unità anestesia associati. Disinfettare l&#39;induzione e camere di imaging. Luogo CD1 topi nudi (circa 20g) nella camera di induzione e di esporli a isoflurano. La percentuale di portata isoflurano e di ossigeno somministrata varia a seconda della specie e il peso dei topi. Attendere che i topi per diventare completamente anestetizzato. </li><li> Dopo i topi vengono anestetizzati, togliere i topi dalla camera di induzione e posto nella camera di imaging. Tenere i topi sotto anestesia. Per ogni mouse, disinfettare le zone di iniezione desiderato. </li><li> Riempire una siringa da insulina sterile 31G con 10 ml di nanosensori avendo cura di rimuovere tutte le bolle d&#39;aria. </li><li> Utilizzando pinze, afferrare una piega piccola porzione di pelle lungo la parte posteriore del mouse al sito di iniezione desiderato. Afferrare la pelle, inserire la siringa nella pelle con lo smusso rivolto verso l&#39;alto e il parallelo ago alla pelle. </li><li> Prima di iniettare i sensori, tirare indietro lo stantuffo della siringa per assicurare l&#39;ago non è inserito in un vaso sanguigno. Poi, con delicatezza spostare l&#39;ago a destra e sinistra per creare una tasca all&#39;interno della pelle. Questo ridurrà al minimo la contropressione che provoca i sensori a trapelare del sito di iniezione. Iniettare i sensori e rimuovere delicatamente la siringa. </li><li> Esercitare una leggera pressione al sito di iniezione e spazzare via qualsiasi soluzione che potrebbe essere trapelato dal sito di iniezione. Questo ridurrà al minimo fluorescenza da sensori che non vengono iniettati nella pelle. </li><li> Ripetere i passaggi attraverso 5,7 fino a 5,4 il numero delle aree di iniezione desiderata. Sei siti di iniezione equidistanti sul lato destro e sinistro della schiena sono raccomandati. Per ogni individuo del mouse, cambiare gli aghi se l&#39;ago diventa difficile da inserire nella pelle. Aghi non devono essere condivisi tra i topi. Questo ridurrà al minimo la trasmissione della malattia o la contaminazione incrociata tra i topi. </li><li> I sensori per l&#39;imaging di sodio fluorescente, acquistiamo sia immagini campo chiaro e fluorescenza dei topi utilizzando set di filtri che meglio soddisfano le nm/680 640 nm (eccitazione / emissione) spettro della nanosensori e che anche minimizzare l&#39;autofluorescenza della pelle. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Curve di risposta di cinque set diversi nanosensori di sodio. Ogni set rappresenta nanosensori dalle formulazioni optode diversi che avevano la stessa quantità di CHIII, NaTFPB, PVC e DOS, ma quantità variabili di NaIX. I dati sono stati convertiti in valori α utilizzando l&#39;intensità di 639/680 nm. I dati sono una media di 3, barre di errore omesso per chiarezza, con una curva sigmoidale montato utilizzando Origine. In questa curva di risposta, la massima concentrazione di sodio è stato utilizzato 500 mm. La Kd dei nanosensori sodio sodio variava da 10 mm (diamanti arancione) a circa 150 mm (quadrati neri). <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Iniettato neonatale miociti cardiaci. Le cellule sono state coltivate su vetrino coprioggetti, montata su un microscopio e iniettati con nanosensori di sodio. Vengono mostrati fluorescenti (eccitazione 639 nm), chiaro, e di sovrapposizione. Si noti che alcune di clustering sensore si verifica, ma le cellule hanno una morfologia normale, i sensori si sono diffuse in tutto il citoplasma e non c&#39;è carica nucleare. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Iniezione sottocutanea di topi con nanosensori di sodio. Nove diverse iniezioni di sodio nanosensori sono stati fatti nello spazio sottocutaneo di topi nudi. Sia del campo luminoso e immagini a fluorescenza (640/680) sono sovrapposti.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La formazione di nanosensori non dovrebbe richiedere più di 10 minuti una volta la soluzione optode è stato fatto e il PEG secca lipidica. Optode non possono essere effettuate solo rapidamente quando necessario, ma se conservato a 4 gradi Celsius, possono essere stabile per mesi. Abbiamo dimostrato che la nansensors, una volta formate, sono stabili in soluzione per almeno una settimana. Tuttavia, occorre prestare attenzione per evitare che photobleaching tutto questo tempo, bloccando il nanosensori dalla luce 6 Mentre nanosensori di sodio sono state dimostrate qui, optodes sono stati creato per la maggior parte degli ioni biologicamente rilevanti quali potassio e cloruro. 10,12 Abbiamo anche esteso questa tecnologia per piccole molecole come il glucosio 13. Oltre a generare nanosensori di monitorare analiti diversi, questi nanosensori sono suscettibili di altri cambiamenti che renderanno utili in esperimenti più biologica. Ad esempio, il rivestimento della superficie, in questo caso poli (glicole etilenico), può essere facilmente cambiata utilizzando qualsiasi molecola anfifiliche che è solubile in acqua. Ciò consente la possibilità di funzionalizzazione queste nanoparticelle per le diverse applicazioni o obiettivi. La dimensione delle nanoparticelle può essere regolata modificando il rivestimento di superficie, l&#39;intensità sonicazione o il solvente utilizzato. Indicatori di calcio fluorescenti sono stati inestimabili nella determinazione di segnalazione intracellulare di calcio, ma senza coloranti sodio disponibile sensibili hanno le stesse caratteristiche ideali. Optode nanoparticelle lo scopo di fornire un metodo alternativo per l&#39;imaging intracellulare degli ioni sono in sviluppo da anni 14. Abbiamo costruito su questa ricerca precedente per creare nanosensori specifici per l&#39;imaging di sodio intracellulari che si spera di fornire un mezzo per capire come segnalazione di sodio influisce sulla funzione cellulare e alterazioni nella segnalazione che portano a determinate malattie. L&#39;utilizzo di nanosensori a fluorescenza in vivo offre in tempo reale alternativa minimamente invasiva per analiti di monitoraggio rispetto ad altri metodi come ad esempio i prelievi di sangue. 3 di sodio e glucosio nanosensori basati sulla tecnologia sopra hanno dimostrato di tenere traccia delle modifiche di sodio e glucosio, rispettivamente in vivo. 3,13 Tuttavia, attualmente esistono limitazioni di questo metodo come uno strumento di monitoraggio. Per esempio, i sensori deve contenere un fluoroforo con uno spettro sufficientemente spostato verso il rosso vicino infrarosso in modo da minimizzare autofluorescenza sfondo dalla pelle. 15 In secondo luogo, la tecnica di iniezione di corrente non produce iniezione uniforme dei nanosensori che può essere causato da tali errori come variazione in profondità di iniezione. Nonostante questi limiti, lo sviluppo di questi nanosensori fluorescenti e la loro manifestazione di successo potrebbe rendere questi sensori uno strumento di ricerca prezioso e metodo per il monitoraggio sanitario dei pazienti.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome prodotto </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> IVIS Lumina II Strumento pacchetto </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD-1 topi nudi </td><td> Charles River </td><td> Ceppo Codice: 086 </td><td> Immunodeficienti </td></tr><tr><td> Siringhe insulina </td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3 / 10 cc mL, 8mm, 31G </td></tr><tr><td> Alto peso molecolare in PVC </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaIX </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sottili pareti di vetro capillare </td><td> Sutter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG lipidi </td><td> Lipidi Avanti Polar </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Fornisce un elenco di prodotti chimici e delle attrezzature utilizzate in questa procedura. Tutti i prodotti chimici comuni non elencati sono stati acquistati dalla Sigma.

fluorescent nanoparticles for the measurement of ion concentration in biological systems

Omeostasi di ioni strettamente regolata in tutto il corpo è necessario per la prevenzione di tali stati debilitanti come la disidratazione. 1, invece, i flussi di ioni rapida a livello cellulare sono necessari per l&#39;avvio di potenziali d&#39;azione nelle cellule eccitabili. 2 Regolamento di sodio svolge un ruolo importante in entrambi questi casi, tuttavia, attualmente non esiste alcun metodo per il monitoraggio continuo dei livelli di sodio in vivo 3 e sonde di sodio intracellulare 4 non lo prevedano simili risultati dettagliati come sonde di calcio. Nel tentativo di riempire questi due vuoti, nanosensori fluorescenti sono state sviluppate in grado di monitorare le concentrazioni di sodio in vitro e in vivo. 5,6 Questi sensori si basano sulla tecnologia agli ioni selettivi optode e sono costituiti da particelle polimeriche plastificato in cui il riconoscimento specifico di sodio elementi, pH-sensibile fluorofori, e additivi sono incorporati. Meccanicisticamente 7-9, l&#39;elemento di riconoscimento di sodio estratti di sodio nel sensore. 10 Questo l&#39;estrazione fa sì che il fluoroforo pH-sensibile per rilasciare uno ione idrogeno per mantenere la neutralità di carica all&#39;interno del sensore, che provoca un cambiamento di fluorescenza. I sensori di sodio sono reversibili e selettivi per il sodio potassio oltre anche ad alte concentrazioni intracellulari. 6 Sono circa 120 nanometri di diametro e sono rivestiti con polietilene glicole di impartire biocompatibilità. Utilizzando tecniche di microiniezione, i sensori possono essere forniti nel citoplasma delle cellule dove hanno dimostrato di monitorare le dinamiche di sodio temporale e spaziale di battere miociti cardiaci. 11 Inoltre, hanno anche monitorato in tempo reale i cambiamenti nelle concentrazioni di sodio nel vivo quando iniettato per via sottocutanea in topi 3 del presente regolamento, spieghiamo in dettaglio e dimostrare la metodologia per la realizzazione di nanosensori sodio fluorescenti e brevemente dimostrare le applicazioni biologiche nostro laboratorio utilizza il nanosensori per:. la microiniezione dei sensori all&#39;interno delle cellule, e l&#39;iniezione sottocutanea di sensori in topi .

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Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Nanoparticelle fluorescenti prodotte nel nostro laboratorio vengono utilizzati per concentrazioni di ioni di imaging e flussi di ioni in sistemi biologici come cellule durante la segnalazione e fluido interstiziale durante l&#39;omeostasi fisiologica.

Le nanoparticelle fluorescenti per la misurazione della concentrazione di ioni in sistemi biologici

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

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Video: Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodologia Elastografia risonanza magnetica per la valutazione dei Tissue Engineered Construct crescita

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

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Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Unire Ion Concentrazione polarizzazione tra giustapposti Ion membrane a scambio di bloccare la propagazione della Zona Polarizzazione

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produzione di nanoparticelle metalliche mediante ablazione laser pulsata nei liquidi: uno strumento per studiare le proprietà antibatteriche delle nanoparticelle

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash nanoprecipitazione per l'incapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Ecografia doppler transcranici funzionale per il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivi elettrici e a campo magnetico per la stimolazione dei tessuti biologici

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Metodi rapidi ed enzimatici per l'amplificazione di modelli minimi e lineari per la prototipazione di proteine utilizzando sistemi privi di cellule

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...