JMD ו MKB ממומנות באמצעות המדע Nanomedicine IGERT תוכנית טכנולוגיה ב Northeastern University (מימון NCI ו-NSF מענק DGE-0504331). עבודה זו מומנה גם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית גרנט R01 GM084366. כמו כן, אנו מודים Saumya דאס ואנתוני רוזנצווייג של BIDMC בבוסטון למתן myocytes לב מזומנים קווין על תרומתו בפיתוח פרוטוקול בעלי חיים.

1. הכנת optode לפני ביצוע optode, aliquots הרכיבים הם זקוקים, כך שהם יכולים להימדד בקלות מאוחסן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ג נתרן Ionophore X (NaIX) בקבוקון ו 50 מ&quot;ג נתרן tetrakis [3,5-bis (trifluoromethyl) פניל] borate (NaTFPB) יהיה כל להיות גדל tetrahyrdofuran (THF) ו aliquoted לתוך 1.5 פוליסטירן צינורות מ&quot;ל צנטריפוגות. במנדף כימי קטר, לפזר את 50 מ&quot;ג של NaIX ב 1 מ&quot;ל של THF בבקבוקון המשלוח ומערבבים כדי להבטיח מוצק נמס לחלוטין. העברת 100 μl של פתרון זה תוך 10 צינורות צנטריפוגה נפרד. חזור עבור NaTFPB. אפשר THF להתאדות במנדף כימי קטר בן לילה, התווית צינורות צנטריפוגה ומניחים אותם במקרר 4 מידה לאחסון. זה יוצר aliquots 5 מ&quot;ג NaIX יבש NaTFPB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את השלישי Chromoionophore (CHIII) ב 1 מ&quot;ל של THF ולהעביר בקבוקון זכוכית 3 מ&quot;ל. הוסף 1 מ&quot;ל של THF על הבקבוקון משלוח CHIII לפזר כל CHIII שיורית ולהוסיף את זה הבקבוקון מ&quot;ל 3 כוס. יהיו סך של 2 מ&quot;ל עכשיו. העברת 1 מ&quot;ל של CHIII בפתרון THF לשני נפרד 1.5 כוס בקבוקוני מ&quot;ל עם כמוסות מצופה טפלון. אחסן את הפתרון CHIII במקרר 4 תואר בריכוז הסופי של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li></ol> Aliquots אלו פתרונות ישמשו כדי להפוך את החומר optode. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 66 μl של bis (2-ethylhexyl) sebacate (DOS) לתוך מבחנה 1.5 מ&quot;ל עם מכסה זכוכית מצופה טפלון בורג - זה בקבוקון optode. DOS היא פתרון צמיגה כך יש להקפיד על מנת להבטיח את הכמות הנכונה של פתרון מועבר הבקבוקון. הכרך המתאים מ&quot;ג 60 ~ של DOS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 30 מ&quot;ג כלוריד גבוהה מולקולרית פולי (ויניל) משקל (PVC) ולהעביר את זה הבקבוקון optode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להוסיף את המרכיבים הפונקציונליים aliquoted אל הבקבוקון optode כדי ליצור את optode הרצוי. הריכוזים היחסיים של CHIII, NaIX ו NaTFPB תקבע את התגובה של החיישן כדי נתרן. ריכוזים אלה יכולים להיות מותאמים יש חיישן אידיאלי מגיב תאיים ריכוזי, עם Kd של 10 מ&quot;מ, או ריכוזי תאית, עם Kd של 150 מ&quot;מ. בנוסף, יהיו ככל הנראה אצווה כדי השתנות אצווה של כימיקלים מהספק וכיול של חיישנים הוא הכרחי כדי לקבוע אם התשובה הנכונה מתרחשת עבור כל אצווה חדשה של רכיבים כימיים. כאן אנו מתארים את השיטה כדי ליצור חיישן עם ריכוזים המשמשים בדרך כלל עבור מדידות נתרן תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף כימי קטר, להעביר 100 μl של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​CHIII בפתרון THF על הבקבוקון optode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 5 מ&quot;ג NaIX ב 300 μl של THF ולהעביר 300 μl אל הבקבוקון optode, זה בקורלציה ל 5 מ&quot;ג של NaIX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים aliquot 5 מ&quot;ג NaTFPB ב 500 μl של THF והעברת 20 μl של הפתרון הבקבוקון optode, זה בקורלציה ל 0.1 מ&quot;ג של NaTFPB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μl של THF על הבקבוקון optode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון של הבקבוקון optode מכילה 30 מ&quot;ג של PVC, 60 מ&quot;ג של DOS, 5 מ&quot;ג NaIX, 0.2 מ&quot;ג NaTFPB, 0.5 מ&quot;ג CHIII ב 500 μl של THF. מערבולת זו הבקבוקון בעדינות עד שכל PVC נמס. Optode צריך להיות בצבע אדום. הסכום הכולל של THF הוסיף הבקבוקון צריך להיות 500 μL ללא יחס של רכיבים בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר THF שנותרו NaIX ו aliquots NaTFPB להתאדות לילה מחדש התווית צינור עם כמות נכונה של חומר כימי. </li></ol> 2. יצירת nanosensors <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μl של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל 1,2-Distearoyl-SN-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N - [Methoxy (Polyethyleneglycol) -550] בכלורופורם (PEG-השומנים) לתוך בקבוקון 4 כוס משקה. אפשר כלורופורם להתאדות במנדף כימי קטר. תהליך זה יכול להיות מזורזת על ידי ייבוש הפתרון עם גז חנקן או אוויר בבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של מימית הפתרון הרצוי בקבוקון עם השומנים-PEG. מניחים את הצנצנת על שקע מעבדה מתחת קצה sonicating ולהעלות את הבקבוקון עד הקצה הוא כ 7 מ&quot;מ עמוק הפתרון ו sonicate בהספק sonication נמוכה למשך 30 שניות. כאן אנו משתמשים דיגיטלי ברנסון sonifier להגדיר משרעת של 15% עם קרן ½ אינץ&#39; קצה בקוטר צעד. בתמיסה מימית ניתן שום פתרון. לדוגמה, כדי לקבוע את התגובה של החיישנים נשתמש 10 mM HEPES pH 7.2 עם בסיס trizma. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם הפתרון הוא להיות sonicated, לערבב 50 μl של החומר optode עם 50 μl של dichloromethane בתוך צינור microcentrifuge 0.6 מ&quot;ל. מערבבים עם פיפטה כדי להבטיח ערבוב אפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את sonifier כדי sonicate במשך 3 דקות. הפעל את sonication ובעוד sonicating להוסיף את תערובת פתרון optode אל הבקבוקון ידי טבילה קצה פיפטה לתוך הפתרון מחלק 100 μl של פתרון מהיר אפילו זריקה אחת,. הפתרון צריך להפוך לכחול, depending על מימית הפתרון בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר sonication להמשיך למשך כ 30 שניות ואז להנמיך את המגבה כך טיפ sonicating הוא כ 2 מ&quot;מ עמוק פתרון. זה צריך להתחיל לאורר את הפתרון ואת הפתרון יהיה אטום. פעולה זו מסייעת להסיר את THF dichloromethane שיורית ומן הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר sonication תושלם, להרים את הפתרון nanosensor לתוך מזרק 5 מ&quot;ל. צרף 0.2 מיקרומטר מזרק לסנן ולחלק את הפתרון nanosensor לתוך בקבוקון זכוכית עם מכסה בורג בראש. הפתרון צריך להיות ברור וכחול אם בתמיסה מימית המכילה פחות מ -10 מ&quot;מ נתרן יש pH פחות מ על 9 משמש. אחרת, זה צריך להיות ללא צבע או ורוד. </li></ol> 3. קביעת התגובה nanonsensor שיטה זו משמשת כדי לקבוע את התגובה של nanosensors תוכנן כדי למדוד נתרן תאיים. ריכוזים שונים מומלץ לשמש nanosensors ריכוז תאי נתרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות מלאי של 10 mM HEPES (0 Na) ו 1M נתרן כלורי (NaCl) ב 10 mM HEPES (1 M Na) ו-pH של כל הפתרונות הללו על 7.2 באמצעות בסיס trizma. מיקס פתרונות המניות של 0 ו -1 Na ​​Na M ב 50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגה חרוטי כדי ליצור פתרונות עם: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 NaCl בריכוז mM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש התחתונה אופטי 96 צלחת גם כדי לקבוע את התגובה. הוסף 100 μl של ריכוז כל אחד נתרן 3 בארות בעמודה. זה יהיה לייצר מערך של 3 x 10 בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף גם כל 100 μl של nanosensors שזה עתה הוכנו לטעון לתוך fluorometer microplate. אנו משתמשים מולקולרית התקנים Spectramax M3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו היטב את כל אורכי הגל הבאים: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> עירור (ננומטר) </td><td> פליטה (ננומטר) </td><td> ניתוק (ננומטר) </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table> עוצמת nanosensor באורך גל זה תלוי בריכוז הנתרן. השימוש הגל תלוי היישומים. עבור איטי מדידות הדינמיקה תאיים, אנו משתמשים nm/570 488 ננומטר (עירור / פליטה) לבין 488 ננומטר nm/670 אשר מאפשרים לנו יחס שני אורכי גל להפחית את הרעש. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן מסורתי, optode נתונים מומר ערכים אשר הם: α = (אני - אני דק &#39;) / (מקסימום אני - אני דק&#39;), שבו אני נמצא את עוצמת בריכוז הנתרן נתון, אני דקות הוא בעוצמה הנמוכה ביותר המדידות תגובה ואני מקסימום היא עוצמת הגבוה ביותר המדידות התגובה. המר או היחס בין עוצמת ב 570 ננומטר מחולק מעוצמת ב 670 nm או את עוצמת ב 680 ננומטר ל α. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנות מזימות, או Excel או מקור משמשים בדרך כלל במעבדה שלנו, לעלילה α לעומת יומן של ריכוז הנתרן, הגדרת יומן של ריכוז הנתרן אפס -1. Fit עקומת sigmoidal התגובה. מתוך העקומה, לחשב את ריכוז הנתרן ב α = 0.5 המייצג את הריכוז שבו החיישן מגיב בצורה אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את יחס CHIII, NaIX ו NaTFPB ב optode כדי ליצור nanosensors עם תגובה אופטימלית סביב ריכוז נתרן של עניין. </li></ol> 4. תאיים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידות תאיים, nanosensors נעשים ברמת הגלוקוז מ&quot;ג / 5 מ&quot;ל במים microinjected לתוך התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול או העברת התאים בכלי זכוכית או תחתית תא הדמיה עם תחתית זכוכית coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים מדיה ברור או פתרון של Tyrode. הר קאמרית הדמיה או צלחת על מיקרוסקופ epifluorescence. אנו משתמשים LSM Zeiss 7 מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי זכוכית עם חולץ פיפטה. אנו משתמשים סאטר בוערים חום p-97 עם 1 מ&quot;מ OD, 0.78 מזהה זכוכית מ&quot;מ, לקוטר טיפ אחרון סביב 300-500 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למילוי פיפטה עם פתרון nanosensor באמצעות מזרק ומחט המילטון, או מטעין microtip ו פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר פיפטה לתוך בעל המצורפת micromanipulator ומחובר מערכת הזרקה בלחץ מבוקר. כאן אנו משתמשים EXFO Burleigh PCS micromanipulator 6000 וכן מערכות רפואיות תאגיד מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את פיפטה על גבי התא, אל הציטופלסמה, לפעמים יש צורך &quot;ברז&quot; בעל מניפולטור לחדור את הממברנה. להזריק את הפתרון nanosensor ובמהירות למשוך את פיפטה. </li></ol> 5. הדמיה בשנת vivo כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת Northeastern ועדת שימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nanosensorsעבור in vivo, הדמיה תאית מתקבלות פוספט שנאגרו מלוחים והותאמו להם מענה אופטימלי נתרן בריכוז הנתרן של mM 135. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקה הגדרת הדמיה של nanosensors פלורסנט בעכברים, אנו משתמשים לומינה IVIS השניה יחידת ההרדמה הקשורים אליו. לחטא את אינדוקציה לתאי הדמיה. המקום CD1 עכברים בעירום (כ 20 גרם) בחדר אינדוקציה לחשוף אותם isoflurane. אחוז flowrate isoflurane וחמצן מנוהל ישתנו בהתאם למין ומשקל של עכברים. חכו העכברים להיות בהרדמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בעכברים מורדמים, להסיר את העכברים מהאולם אינדוקציה מקום החדרה הדמיה. שמור על עכברים תחת הרדמה. עבור כל עכבר, לחטא את האזורים הזרקת הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק סטרילי אינסולין 31G עם 10 μL של nanosensors לוודא להסיר את כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לתפוס קפל קטן של עור לאורך החלק האחורי של העכבר במקום ההזרקה הרצוי. בעוד לתפוס את העור, להוסיף את המזרק לתוך העור עם שפוע פונה כלפי מעלה ואת במקביל המחט לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזרקת חיישנים, למשוך בחזרה על הבוכנה את המזרק על מנת להבטיח את המחט לא מוכנס לתוך כלי דם. ואז, בעדינות להזיז את המחט ימינה ושמאלה כדי ליצור כיס בתוך העור. זה יהיה למזער את הלחץ בחזרה הגורמת החיישנים לדלוף של הזריקה. להזריק את חיישנים להסיר בעדינות את המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות תפעילו לחץ על הזריקה וגם למחות כל פתרון שאולי דלפה של הזריקה. זה יהיה למזער את הקרינה מן חיישנים לא מוזרקים לתוך העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרה על שלבים 5.4 עד 5.7 עד מספר אזורי ההזרקה הרצוי הוא הגיע. שישה אתרים הזרקת מחולקת באופן שווה על הצד הימני והשמאלי של הגב מומלץ. עבור עכבר בנפרד, לשנות מחטים אם המחט הופכת קשה להכניס לתוך העור. מחטים לא אמור להיות משותף בין העכברים. זה יהיה למזער העברת מחלות או זיהום צולבות בין העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור דימות חיישנים נתרן ניאון, שאנו רוכשים הן brightfield ו פלורסנט תמונות של עכברים באמצעות מערכות הסינון מתאימים ביותר מקרוב את nm/680 640 ננומטר (עירור / פליטה) בספקטרום של nanosensors וכי גם למזער את autofluorescence של העור. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. עקומות התגובה של חמש קבוצות שונות nanosensor נתרן. קבוצה מייצגת nanosensors מ optode ניסוחים שונים שהיו באותה כמות של CHIII, NaTFPB, PVC ו-DOS, אך כמויות משתנות של NaIX. הנתונים הומרו ערכי α שימוש בעוצמות 639/680 ננומטר. הנתונים הם ממוצע של 3, ברים שגיאה מושמט לבהירות, עם עקומת sigmoidal מצויד באמצעות מקור. ב עקומת התגובה הזאת, את הריכוז המרבי של נתרן המשמש היה 500 מ&quot;מ. Kd של nanosensors עבור נתרן נתרן נע בין 10 מ&quot;מ (כתום יהלומים) של כ 150 מ&quot;מ (ריבועים שחורים). <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הזריקה myocytes לב הילוד. היו תאים בתרבית על coverglass, רכוב על מיקרוסקופ מוזרק עם nanosensors נתרן. המוצגים הם פלורסנט (עירור 639 ננומטר), brightfield, ואת כיסוי. שים לב כמה אשכולות חיישן מתרחשת אבל יש מורפולוגיה תאים נורמליים, יש חיישנים מתפזרת ברחבי cytosol ואין העמסה גרעיני. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="איור 3"/> 3. איור תת עורי הזרקה של עכברים עם nanosensors נתרן. תשע זריקות שונות של נתרן nanosensors נעשו לחלל תת עורית של עכברים בעירום. שניהם בשדה בהיר ותמונות ניאון (640/680) הם מעולף.

<ol>
	<li>Adrogue, H. J., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyponatremia.">Hyponatremia.</a> N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).</li><li>Kim, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BACE1+regulates+voltage-gated+sodium+channels+and+neuronal+activity.">BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity.</a> Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).</li><li>Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+sodium+concentration+continuously+monitored+with+fluorescent+sensors.">in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors.</a> Integr Biol (Camb). , (2010).</li><li>Minta, A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+nano-optodes+incorporating+quantum+dots.">Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).</li><li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+ion-selective+nanosensors+for+intracellular+analysis+with+improved+lifetime+and+size.">Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size.</a> Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).</li><li>Schaffar, B., Wolfbeis, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium-selective+optrode.">A sodium-selective optrode.</a> Mikrochim Acta III. III, 109-109 (1989).</li><li>Seiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sodium-selective+optode+membranes+based+on+neutral+ionophores+and+assay+of+sodium+in+plasma.">Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma.</a> Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).</li><li>Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensor+for+sodium+based+on+ion-pair+extraction+and+fluorescence.">Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence.</a> Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).</li><li>Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrier-Based+Ion-Selective+Electrodes+and+Bulk+Optodes.+1.+General+Characteristics.">Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics.</a> Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).</li><li>Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sodium+dynamics+in+isolated+cardiomyocytes+using+fluorescent+nanosensors.">Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).</li><li>Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-Selective+Optodes+Measure+Extracellular+Potassium+Flux+in+Excitable+Cells.">Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).</li><li>Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , .</li><li>Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+optical+PEBBLE+nanosensors+for+real-time+magnesium+ion+concentrations+inside+viable+cells.">Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells.</a> Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging.">in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היווצרות nanosensors צריך לקחת לא יותר מ 10 דקות פעם הפתרון optode נעשה ואת השומנים PEG יבשים. Optode לא ניתן לבצע רק במהירות בעת הצורך, אך כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס, הם יכולים להיות יציבים במשך חודשים. הראינו כי nansensors, יצרו פעם אחת, הם יציבים בתמיסה במשך שבוע לפחות,. עם זאת, יש להקפיד על מנת למנוע photobleaching לאורך זמן זה על ידי חסימת nanosensors מן האור בעוד 6 nanosensors נתרן היו הפגינו כאן, optodes כבר יצרה עבור רוב ביולוגית יונים רלוונטיים כגון אשלגן כלוריד. 10,12 הרחבנו גם את הטכנולוגיה הזו מולקולות קטנות, כגון גלוקוז 13. בנוסף להפקת nanosensors לפקח analytes שונים, nanosensors אלה ניתנים שינויים אחרים שיהפכו אותם שימושי ניסויים ביולוגיים ביותר. לדוגמה, ציפוי פני השטח, במקרה זה פולי (אתילן גליקול), יכול בקלות להיות שונה באמצעות כל מולקולה amphiphilic כי הוא מסיס במים. זה מאפשר את האפשרות של functionalizing אלו חלקיקים עבור יישומים או מטרות שונות. הגודל של חלקיקים יכולים גם להיות מותאם על ידי שינוי ציפוי פני השטח, את עוצמת sonication או ממס בשימוש. האינדיקטורים סידן פלורסנט כבר לא יסולא בפז בקביעת סידן איתות תאיים, אולם לא צובעת נתרן זמין רגיש יש את המאפיינים אותו אידיאלי. Optode חלקיקים נועד לספק שיטה חלופית עבור יונים הדמיה intracellularly כבר בפיתוח במשך שנים. 14 בנינו על המחקר הקודם כדי ליצור nanosensors ספציפית עבור הדמיה נתרן תאיים כי יהיה בתקווה לספק אמצעי כדי להבין כיצד האותות נתרן משפיע על תפקוד הסלולר שינויים איתות הגורמות מחלות מסוימות. השימוש nanosensors פלורסנט in vivo מציעה בזמן אמת חלופה מינימלית פולשנית עבור analytes ניטור על פני שיטות אחרות כגון דם שואבת. 3 נתרן ו גלוקוז nanosensors מבוסס על טכנולוגיה לעיל הוכחו לעקוב אחר שינויים נתרן גלוקוז, בהתאמה vivo. 3,13 עם זאת, יש כיום קיימות מגבלות שיטה זו ככלי ניטור. לדוגמה, חיישנים חייב להכיל fluorophore עם ספקטרום עברה מספיק כדי למזער autofluorescence רקע מן העור. 15 שנית לכיוון אדום האינפרא אדום הקרוב, טכניקת ההזרקה הנוכחי אינו לייצר זריקה אחיד של nanosensors אשר עלולה להיגרם על ידי כך טעויות כמו וריאציה לעומק ההזרקה. למרות מגבלות אלה, הפיתוח של אלה nanosensors פלורסנט הפגנה מוצלחת שלהם יכול להפוך חיישנים אלה כלי המחקר שיטה שלא יסולא בפז עבור ניטור בריאות המטופל.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם המוצר </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> IVIS לומינה II חבילת כלי </td><td> Caliper מדעי החיים </td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD-1 עכברים בעירום </td><td> צ&#39;ארלס ריבר </td><td> קוד הזנים: 086 </td><td> Immunodeficient </td></tr><tr><td> אינסולין מזרקים </td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3 / 10 סמ&quot;ק מ&quot;ל, 8mm, 31G </td></tr><tr><td> משקל מולקולרי גבוה PVC </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaIX </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נימי זכוכית דקים חומה </td><td> סאטר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG השומנים </td><td> אוואנטי ליפידים פולאר </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. מספק רשימה של כימיקלים וציוד המשמשים בהליך זה. כימיקלים כל המשותף שאינם רשומים נרכשו מ Sigma.

fluorescent nanoparticles for the measurement of ion concentration in biological systems

הומאוסטזיס יון מוסדר היטב בכל הגוף הוא הכרחי למניעת מצבים מתישים כגון התייבשות. 1 לעומת זאת, והנתיבים יון מהיר ברמה התאית נדרשים ליזום פוטנציאל פעולה בתאי להתרגש. תקנה 2 נתרן משחק תפקיד חשוב בשני במקרים אלה, אולם השיטה לא קיימת כיום עבור ניטור רציף רמות נתרן in vivo 3 ו 4 בדיקות נתרן תאיים אינם מספקים תוצאות מפורטות דומה כמו בדיקות סידן. במאמץ למלא את שני החללים הללו, nanosensors פלורסנט פותחו יכול לפקח על ריכוזי הנתרן במבחנה in vivo. 5,6 חיישנים אלה מבוססים על טכנולוגיית יון סלקטיבי optode וכוללת חלקיקי פלסטיק פולימרי, שבו הכרה נתרן ספציפי אלמנטים, pH רגיש fluorophores, ותוספים המוטבעים. 7-9 מכני, אלמנט הכרה נתרן תמציות נתרן לתוך החיישן. 10 ממוצא זה גורם fluorophore pH רגיש לשחרר יון מימן כדי לשמור על ניטרליות מטען בתוך החיישן אשר גורם שינוי פלואורסצנטי. החיישנים נתרן הם הפיכים וסלקטיבית עבור נתרן ואשלגן על תאיים גם בריכוזים גבוהים. 6 הם כ 120 ננומטר בקוטר והם מצופים פוליאתילן גליקול להקנות biocompatibility. באמצעות שימוש בטכניקות microinjection, חיישנים יכול להיות מועברת לתוך הציטופלסמה של תאים שם הם הוכחו לפקח על הדינמיקה נתרן ומרחב המכות myocytes לב. 11 בנוסף, יש להם גם מעקב בזמן אמת שינויים בריכוז הנתרן in vivo כאשר הוא מוזרק תת עורי לעכברים 3 בזאת, אנחנו מסבירים בפירוט ולהפגין את המתודולוגיה בודה nanosensors נתרן הניאון בקצרה להדגים את יישומים ביולוגיים המעבדה שלנו משתמשת nanosensors עבור:. microinjection של חיישנים לתוך התאים, ועל הזרקה תת עורית של החיישנים לעכברים .

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems at JoVE.com

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

חלקיקים פלורסנט המיוצר במעבדה שלנו משמשים ריכוזי הדמיה יונים והנתיבים יון במערכות ביולוגיות כגון תאים במהלך נוזל איתות ביניים במהלך הומאוסטזיס פיזיולוגיים.

חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

fluorescent-nanoparticles-for-measurement-ion-concentration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.2K Views.  Northeastern University. חלקיקים פלורסנט המיוצר במעבדה שלנו משמשים ריכוזי הדמיה יונים והנתיבים יון במערכות ביולוגיות כגון תאים במהלך נוזל איתות ביניים במהלך הומאוסטזיס פיזיולוגיים.

Video: Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

תהודה מגנטית elastography מתודולוגיה להערכת של רקמות מהונדסות צמיחה Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

לימוד-משנה רך מערכות ביולוגיות על פני אורך בקנה מידה רחבה מן ננומטר ו מיקרומטר גדלים בזווית-הקטנה ניוטרון diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

מיזוג קיטוב ריכוז יון בין חופפי Ion Exchange ממברנות כדי לחסום את ההתפשטות של אזור הקיטוב

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

ייצור של חלקיקי מתכת על ידי פעימה לייזר ablation בנוזלים: כלי לחקר מאפיינים אנטיבקטריאליים של חלקיקים

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

פלאש NanoPrecipitation בשביל העטיפה של תרכובות הידרופוביות, הידרופילית חלקיקים פולימרים

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

אולטרסאונד דופלר חוצה תותח פונקציונלי לניטור זרימת הדם במוח

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

התקני שדה חשמליים ומגנטיים לגירוי רקמות ביולוגיות

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...