İş JWV grup AB Marie-Curie Reintegration Bursu, Sysmo2 Grant (NWO-ALW/ERASysBio), Horizon hibe (ZonMW) ve Veni dostluk (NWO-ALW) tarafından desteklenmektedir. OPK grubu birkaç STW hibe (NWO), SYSMO1 (IGdeJ) ve SYSMO2 hibe, bir ESF Eurocores SynBio hibe (SynMod) ve Endüstriyel Fermantasyon ve En İyi Gıda ve Beslenme için Enstitüsü Genomik Kluyver Merkezi tarafından desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development.">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li><li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation.">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li><li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis.">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li><li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems.">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li><li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides.">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li><li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division.">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li><li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li><li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSICIC:+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution.">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li><li>Montero, L. l. o. p. i. s. . P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li><li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li><li>Hoskins, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6.">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li><li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction.">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

, Pek çok diğer tek hücreli tekniklere aksine, burada açıklanan geçen zaman floresan mikroskopi yöntemi atalarının, onun davranış ve bölünme olayları ile ilgili belirli bir hücre tarihini takip kullanılabilir. Floresan etiketli hedef rehberleri veya protein ile birlikte, belirli gelişim süreçleri etkinleştirme süresi ve protein yerelleştirme yanı sıra protein dinamikleri bakteriyel gelişimi sırasında izlenebilir takip edilebilir. Yukarıda belirtildiği gibi, farklı bakteri türleri üzerinde yoğunlaşan çalışmalar, belirli bir bakteri gereklerine göre büyüme koşullarına adapte tarafından yapılabilir. Karşılaştığımız sınırlamalar büyüme koşulları ve örneklem büyüklüğü ile ilgili. Kapalı bir ortam olması nedeniyle, orta koşulları, deneme sırasında değiştirilecek. Ayrıca, deney başına dört suşlarının maksimum verimli bir şekilde takip edilebilir. Bir kaç kritik adımlar göz önüne alındığında, tek bir hücrenin analiz yöntemi, burada açıklanan herhangi bir otomatik mikroskop kullanarak kolayca uygulanabilir. Aşağıda, bu kritik adımların bir bakış verilecektir. Ayrıntılı bilgi ana metin Genel hazırlık: deney öncesinde belirli bir bakteri için gerekli olan otomatik odaklama ayarlarını kontrol etmek akıllıca olacaktır. Aynı şekilde, eğer mümkünse yaklaşık floresan görünüm için en iyi ayarları, önceden belirlenmiş olmalıdır. Ayrıca, hazırlanmış bir zaman çizgisi izleyen zaman içinde kullanıma hazır tüm malzeme (öncesi ısınma, mikroskop odasının, mikroskop ayarları programlama, hücreler istenilen büyüme aşamasında önce bir saat slayt hazırlama, bkz Şekil 1) yardımcı olur B. Büyüme TLM ve CDM subtilis: TLM ve CDM kimyasal açlık medya tanımlanan hangi B. subtilis sadece yavaş yavaş büyür. Hücreleri medya yetiştirilen zaman dilimi belirli bir gerginlik bağlı olarak uzun süreli olabilir. Birbirlerine kazık yavaş büyüme hücreleri engeller mikroskop numunesinin hazırlanması: gen çerçeve, cam slayt ve kapak kayma arasında hava kabarcıkları agaroz tabanlı orta geniş kurumasını önlemek için önlenebilir. Aynı orta / kapak kayma arayüzü için de geçerlidir. Bu hücrelerin yeteri kadar kurumaya bırakın, yüzme ve / veya çok katmanlı büyümesini önlemek için çok önemlidir Time-lapse floresan mikroskopi: Ön ısınma slayt çevre odasının yanı sıra, önemli otofokus sorunları önlemek için çok önemlidir . Bu deney sırasında (örnek yeterince kurutulmuş) alan ve odak kalmak için en yüksek şansı beri Hücreler, bir agar ped ortasında seçili olmalıdır. Deneyler başına 10 yerde maksimum hala düzgün çalışır. Seçildikten sonra ilk hücrenin sadece ilgi odağı ayarlamak için (ayrıntılar için metne bakınız) yazılımını kullanabilirsiniz. Hücreler, ilk saatlerde 30 dakika aralıklarla deney Analiz hala odak olup olmadığını kontrol edin: Bu orta arka plan floresan kanallarda benzer değerlere sahip olup olmadığını önce genişletilmiş analiz prosedürleri kontrol etmek için önemlidir. Sorun Giderme analiz etmek için film zor veya imkansız hale Küçük toz partikülleri, orta bileşenler, kirli lensler veya küçük agaroz kümeleri, yerel olarak artan floresan katkıda bulunabilir: hücreler birbirinin üstüne büyürse, bu da lamel olduğunu gösteriyor olabilir çok erken ya da orta microcolony mono tabakaları büyüme için uygun değildir bağlı. Mutlu slayt diğer hücrelere bölmek ise ilgi hücreler sürekli ölen pozisyonda UV filtre koymak olmadığını kontrol etmek isteyebilirsiniz. Aynı zamanda uzun deneyler sırasında maruz kalma süresi ya da ışık yoğunluğunu azaltmak için yardımcı olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Gene Kare </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1.7 x 2.8 cm </td></tr><tr><td> yüksek çözünürlüklü düşük erime agaroz </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> büyük kapak kayma </td><td> birkaç </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> istenirse, membran boya, örneğin FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> diğer membran boyalar da mevcuttur: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Zaman atlamalı mikroskop çevre odasına </td><td> birkaç </td><td></td><td> bizim cihaz için ilgili bölümlerde ayrıntıları görmek </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

Son birkaç yılda bilim adamları mikrobiyal nüfusa dayalı deneylerden elde edilen ortalama veriler tek hücrelerinin davranış, durum veya fenotip temsilcisi olmadığı giderek daha duyarlı hale geldi. Bu yeni anlayış, tek bir hücre çalışmaları sayısı (son değerlendirmeleri için 1,2,3 bakın) sürekli artıyor . Ancak, birçok uygulanan tek bir hücre teknikleri, belirli bir zaman içinde tek bir hücrenin (örneğin, flow sitometri veya standart mikroskopi) gelişimini ve davranışlarını izlemek izin vermez. Burada, biz, takip eden ve kayıt (floresan), Bacillus subtilis ve Streptococcus pneumoniae birçok nesiller için büyüme ve bölünme yoluyla bireysel bakteri hücrelerinin sağlayan birkaç son çalışmalar 4, 5, 6, 7, kullanılan mikroskop yöntemi ayrıntılı bir açıklama sağlar. Ortaya çıkan film, tek bir ortak atadan kökenli bir nüfus içinde tek bir hücrenin geçmişi geri izleme filogenetik soy ağaçları oluşturmak için kullanılabilir. Bu zaman atlamalı floresan mikroskopi yöntemi sadece tek tek hücrelerin büyüme, bölünme ve farklılaşma araştırmak için değil, aynı zamanda hücre geçmişi ve soy spesifik hücresel davranışı üzerinde etkisini analiz etmek için kullanılabilir. Ayrıca, ideal zaman atlamalı mikroskopi, bakteri hücre döngüsü sırasında, gen ekspresyonu dinamikleri ve protein lokalizasyonu incelemek için uygundur. Bu yöntem, bakteri hücrelerinin hazırlamak ve bir microcolony tek hücre akıbet etkinleştirmek için mikroskop lamı inşa nasıl açıklar. Kısacası, tek hücre, büyür ve bir sıcaklık kontrollü çevre oda içinde bir floresan mikroskop altında bölmek agaroz ile desteklenmiş büyüme orta oluşan bir yarı-katı yüzey fark vardır. Görüntüler belirli aralıklarla yakalanır ve daha sonra, açık kaynak yazılımı ImageJ kullanılarak analiz edilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

live-cell-imaging-bacillus-subtilis-streptococcus-pneumoniae-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

42.0K Görüntüleme.  University of Groningen. Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.