JWV의 그룹에 작업이 EU 마리 퀴리 합체 원정대, Sysmo2 그랜트 (NWO-ALW/ERASysBio), 호라이즌 부여 (ZonMW)와 VENI 친목 (NWO - ALW)에 의해 지원됩니다. OPK의 그룹은 여러 STW 보조금 (NWO), SYSMO1 (IGdeJ)와 SYSMO2 부여, ESF Eurocores SynBio 부여 (SynMod)와 산업 발효 및 식품 영양에 대한 최고 연구소의 게놈에 대한 Kluyver 센터에 의해 지원됩니다.

<ol>
	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development.">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li><li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation.">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li><li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis.">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li><li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems.">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li><li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides.">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li><li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division.">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li><li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li><li>Guberman, J. 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M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

많은 다른 단일 세포 기술에 대조적으로, 여기에서 설명한 시간 경과 형광 현미경 방법은 그 조상의 행동, 그리고 분열 이벤트에 관한 특정 세포의 역사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 찬란 표시 대상 발기인 또는 단백질와 함께 구체적인 발달 경로의 활성화는 시간과 단백질 지방화뿐만 아니라 단백질 역학이 박테리아 개발되는 동안 모니터링할 수 있습니다에 따라 수 있습니다. 위에서 표시된 다른 세균 종에 집중 연구는 특정 세균에 대한 요구 사항에 따라 성장 조건을 적응하여 수행할 수 있습니다. 우리가 발생한 유일한 제한은 성장 조건과 샘플의 크기와 관련이 있습니다. 밀폐 환경으로 인해 중간 조건은 실험 기간 동안 변경할 수 없습니다. 또한, 실험 당 4 개의 변종이 최대가 효율적으로 모니터링할 수 있습니다. 몇 가지 중요한 단계를 고려, 단일 세포 분석 방법은 여기에 설명된 쉽게 어떤 자동화된 현미경을 사용하여 적용할 수 있습니다. 다음에서 이러한 중요한 단계의 개요가 주어집니다. 자세한 정보는 주요 텍스트에서 찾을 수 있습니다 일반 준비 사항 :. 그것은 이전 실험 특정 박테리아에 필요한 자동 초점 설정을 확인하는 것이 현명합니다. 가능하면 마찬가지로, 형광의 시각화에 대한 대략적인 최적의 설정은, 사전에 결정되어야합니다. 또한, 준비 시간 라인을 따라하는 것은 시간에 사용할 준비가 모든 자료 (사전 온난, 현미경 챔버를 현미경 설정을 프로그래밍, 세포가 원하는 성장 단계에되기 전에 슬라이드 한 시간 준비를 참조 그림 1)을하는 데 도움이 B.니다. 성장 TLM와 CDM에 subtilis : TLM과 CDM은 화학적으로 기아 미디어를 정의하는 B. subtilis은 천천히 자랍니다. 세포가 언론에서 재배되는 시간 기간은 특정 변형에 따라 연장 될 수도 있습니다. 느린 성장은 서로에 말뚝의 세포를 방지 현미경 샘플의 준비 :. 유전자 프레임, 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공기 방울은 아가로 오스 기반 매체의 광범위한 건조를 방지하기 위해 예방해야합니다. 동일 매체 / 커버 슬립 인터페이스 보유하고 있습니다. 그것은 수영 및 / 또는 여러 계층의 성장을 방지하기 위해, 세포가 충분히 건조하게하는 데있어 매우 중요합니다 시간 경과 형광 현미경 :. 슬라이드뿐만 아니라 환경 챔버 사전 온난 주요 오토포커스 문제를 방지하기 위해 중요합니다. 이들은 실험 (시료가 충분히 건조했습니다 제공) 중 분야와 초점을 유지하기 위해 최고의 기회를 갖고 있기 때문에 세포는 한천 패드의 중간에 선택되어야합니다. 실험 당 10의 위치 최대 여전히 제대로 작동합니다. 선택하는 데 후 관심의 첫 번째 셀은 (자세한 내용은 텍스트를 참조) 초점을 조정하는 소프트웨어를 사용합니다. . 세포가 30 분 간격의 실험 분석의 첫 번째 시간 동안 초점이 아직 있는지 확인하십시오 : 이것은 매체의 배경 형광 채널에서 유사한 가치를 가지고 있는지 사전에 연장 분석 절차를 확인하는 것이 중요합니다. . 작은 먼지 입자, 중간 부품, 더러운 렌즈 또는 작은 아가로 오스의 대단히 짧은 시간 문제 해결을 분석할 수있는 동영상이 어렵거나 불가능하게 만들었 로컬 증가 형광에 기여할 수 세포가 서로의 위에 성장하는 경우,이 중 coverslip가되었음을 나타내고 있습니다 너무 빨리 또는 매체가 microcolony monolayers의 성장에 적합하지 않습니다 첨부. 슬라이드에 다른 세포 행복 나누기 반면 관심 세포가 지속적으로, 일찍 죽으면, 당신은 위치에서 UV - 필터를 넣어 여부를 확인 할 수 있습니다. 또한 오랜 실험 중에 노출 시간이나 빛의 강도를 감소하는 데 도움이 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 진 프레임 </td><td> ABgene </td><td> AB - 0578 </td><td> 1.7 X 2.8 cm </td></tr><tr><td> 고해상도 낮은 용융 아가로 오스 </td><td> 시그마 </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> 큰 커버 슬립 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 24 X 50mm </td></tr><tr><td> 원하는 경우, 멤브레인 염료 예 : FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> 다른 멤브레인 염료도 사용할 수 있습니다 : <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> 환경 챔버와 함께 시간 경과 현미경 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 해당 섹션에있는 장치에 대한 세부 정보를 볼 </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

지난 몇 년 동안 과학자들은 미생물의 인구 기반의 실험에서 얻은 평균 데이터는 단일 세포의 동작, 상태 또는 표현형 대표하지 않는 점차 알게되었습니다. 때문에이 새로운 통찰력 단일 세포 연구의 번호는 (최근 리뷰를 1,2,3 참조) 지속적으로 상승합니다. 그러나, 적용된 단일 세포 기술을 많은 시간에 한 구체적인 하나의 셀 (예 : 유동세포계측법 또는 표준 현미경)의 개발 및 동작을 모니터링 허용하지 않습니다. 여기서 우리는 다음과 녹음 (의 형광) 바실러스 subtilis 많은 세대를위한 성장과 분열을 통해 연쇄상 구균의 pneumoniae의 개별 세균 세포 수있는 몇 가지 최근의 연구 4, 5, 6, 7,에 사용되는 현미경 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 그 결과 영화는 하나의 공통된 조상에서 유래 인구 이내에 단세포의 역사를 다시 추적하여 phylogenetic 가계 나무를 구성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시간 - 저속 형광 현미경의 방법뿐만 아니라 성장, 분할 및 개별 세포의 분화를 조사뿐만 아니라, 특정 세포의 행동에 세포의 역사와 조상의 효과를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 시간 경과 현미경은 이상적으로 세균 세포주기 동안 유전자 발현 역학 및 단백질 지방화를 검사 적합합니다. 방법은 박테리아 세포를 준비하고 microcolony에 단일 세포의 가지를 사용하는 현미경 슬라이드를 구성하는 방법에 대해 설명합니다. 즉, 하나의 세포들은 성장 온도 제어 환경 챔버 내에서 형광 현미경으로 분리하는 아가로 오스와 보충 성장 매체로 구성된 반 고체 표면에 발견됩니다. 이미지는 특정 간격으로 캡처하고 나중에 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 분석하고 있습니다.

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

이 프로토콜은 자동 형광 시간 경과 현미경을 사용하여 시간에 다른 박테리아의 단일 세포의 행동을 모니터하기위한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 어떻게 현미경 이미지를 분석하는 지침을 제공합니다.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

live-cell-imaging-bacillus-subtilis-streptococcus-pneumoniae-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

42.0K 조회수.  University of Groningen. 이 프로토콜은 자동 형광 시간 경과 현미경을 사용하여 시간에 다른 박테리아의 단일 세포의 행동을 모니터하기위한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 어떻게 현미경 이미지를 분석하는 지침을 제공합니다.