El trabajo en el grupo de JWV con el apoyo de una beca de la UE Marie-Curie Reintegración, una beca Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), un horizonte de subvención (ZonMW) y por una beca VENI (NWO-ALW). El grupo de OPK con el apoyo de varias subvenciones STW (NWO), un SYSMO1 (IGdeJ) y SYSMO2 subvención, las FSE Eurocores biología sintética, la subvención (SynMod) y por el Centro de Genómica Kluyver de Fermentaciones Industriales y el Instituto superior de Alimentación y Nutrición.

<ol>
	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development.">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li><li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation.">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li><li>Veening, J. 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M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. 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No hay conflictos de interés declarado.

En contraste con muchas otras técnicas de célula única, el método de time-lapse microscopía de fluorescencia se describe aquí se puede utilizar para seguir la historia de una celda específica en relación con sus antepasados, su comportamiento, y eventos de la división. En combinación con los promotores objetivo marcado con fluorescencia o las proteínas, la activación específica vía de desarrollo puede ser seguido en el tiempo y localización de la proteína, así como la dinámica de proteínas pueden ser monitoreados durante el desarrollo de bacterias. Como se indicó anteriormente, los estudios se concentra en diferentes especies bacterianas se pueden realizar mediante la adaptación de las condiciones de crecimiento de acuerdo a los requerimientos de una bacteria específica. Las únicas limitaciones que encontramos están relacionados con las condiciones de crecimiento y tamaño de la muestra. Debido a un entorno cerrado, las condiciones del medio no se puede cambiar durante el experimento. Además, un máximo de cuatro cepas por experimento se puede controlar de manera eficiente. Teniendo en cuenta algunas medidas críticas, el método de análisis de células individuales se describe aquí se puede aplicar fácilmente utilizando cualquier microscopio automatizado. En el siguiente, un resumen de los pasos críticos se les dará. La información detallada se puede encontrar en el texto principal de preparación general:. Es una buena idea para comprobar los ajustes de enfoque automático necesarios para una bacteria específica antes del experimento. Asimismo, se aproximan a los valores óptimos para la visualización de la fluorescencia debe ser determinada de antemano, si es posible. Además, después de un preparado de línea de tiempo ayuda a tener todo el material listo para su uso en el tiempo (pre-calentamiento de la cámara del microscopio, la programación de la configuración de microscopio, la preparación de la diapositiva una hora antes de que las células se encuentran en la fase de crecimiento deseado, ver Figura 1) . Crecimiento de la B. subtilis en TLM y el MDL: TLM y el MDL son químicamente definido los medios de comunicación en la que el hambre B. subtilis sólo crece lentamente. El período de tiempo en el que las células se cultivan en los medios de comunicación podría tener que prolongarse dependiendo de la cepa específica. El lento crecimiento impide que las células acumulan unos sobre otros Preparación de la muestra microscopio:. Burbujas de aire entre la estructura del gen, la lámina de vidrio y la hoja de la cubierta tiene que ser prevenida para evitar la sequedad amplia del medio de agarosa-based. Lo mismo vale para la interfaz de deslizamiento medio / cover. Es crucial que las células lo suficientemente seco para evitar la natación y / o el crecimiento de capas múltiples Time-lapse microscopía de fluorescencia:. Pre-calentamiento de la lámina, así como la cámara del medio ambiente es crucial para evitar mayores problemas de enfoque automático. Las células deben ser seleccionados en el medio de una almohadilla de agar, ya que estos tienen la mayor probabilidad de permanecer en el campo y centrarse en el experimento (siempre que la muestra se secó lo suficiente). Un máximo de 10 puntos por los experimentos todavía funciona correctamente. Después de haber seleccionado la primera celda de interés sólo utilizar el software para ajustar el enfoque (véase el texto para más detalles). Comprobar si las células están todavía en el foco durante las primeras horas del experimento, en intervalos de 30 minutos. Análisis: Es importante comprobar antes de los procedimientos de análisis más amplio si el fondo del medio tiene valores similares en los canales de fluorescencia. Pequeñas partículas de polvo, los componentes del medio, las lentes sucios o pequeños grupos de agarosa pueden contribuir a la fluorescencia a nivel local aumentó, lo que hace la película de difícil o imposible de analizar Resolución de problemas:. Si las células crecen en la parte superior de la otra, esta bien podría indicar que el cubreobjetos se adjunta demasiado pronto o que el medio no es adecuado para el crecimiento de las monocapas microcolonias. Si las células de interés continuamente mueren de forma prematura, mientras que otras células en el portaobjetos se dividen felizmente, es posible que desee comprobar si se pone el filtro UV en la posición. También podría ayudar a disminuir el tiempo de exposición o la intensidad de la luz durante los experimentos de largo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Gene marco </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 cm </td></tr><tr><td> de alta resolución de baja fusión de agarosa </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> cubreobjetos grande </td><td> varios </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> Si lo desea, la membrana de colorante, por ejemplo, FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> otros tintes membrana también están disponibles: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Time-lapse microscopio con cámara ambiental </td><td> varios </td><td></td><td> ver los detalles de nuestro dispositivo en las secciones correspondientes </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

Durante los últimos años los científicos se convirtió cada vez más conscientes de que los datos medios obtenidos de los experimentos basados ​​en la población microbiana no son representativos de la conducta, el estado o el fenotipo de las células individuales. Debido a esta nueva visión de la serie de estudios célula aumenta continuamente (para una revisión reciente ver 1,2,3). Sin embargo, muchas de las técnicas aplicadas sola célula no permiten seguir la evolución y el comportamiento de una celda específica único en el tiempo (por ejemplo, la citometría de flujo o microscopía estándar). Aquí, le ofrecemos una descripción detallada de un método de microscopía utilizado en varios estudios recientes 4, 5, 6, 7, lo que permite seguir y registrar (fluorescencia de) las células bacterianas individuales de Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae a través del crecimiento y la división de muchas generaciones. Las películas resultantes pueden ser utilizados para construir los árboles filogenéticos se remontan al linaje de la historia de una sola célula dentro de una población que se originaron de un ancestro común. Este método de fluorescencia time-lapse microscopía no sólo pueden ser utilizados para investigar el crecimiento, la división y diferenciación de las células individuales, sino también para analizar el efecto de la historia de la célula y la ascendencia en el comportamiento celular específica. Además, time-lapse microscopio es ideal para examinar la dinámica de la expresión génica y localización de la proteína durante el ciclo celular de las bacterias. El método se explica cómo preparar las células bacterianas y la construcción del portaobjetos para permitir la derivación de células individuales en un microcolonias. En resumen, las células individuales son vistos en una superficie semi-sólido que consiste en el medio de cultivo complementado con la agarosa en el que crecen y se dividen en un microscopio de fluorescencia en una cámara de temperatura ambiental controlada. Las imágenes se capturan en intervalos específicos y posteriormente se analizaron mediante el software de código abierto ImageJ.

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Este protocolo establece un procedimiento paso a paso para controlar el comportamiento de células individuales de bacterias diferentes en el tiempo el uso automatizado de fluorescencia time-lapse microscopía. Además, proporcionar directrices a analizar las imágenes de microscopía.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

live-cell-imaging-bacillus-subtilis-streptococcus-pneumoniae-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

42.0K vistas.  University of Groningen. Este protocolo establece un procedimiento paso a paso para controlar el comportamiento de células individuales de bacterias diferentes en el tiempo el uso automatizado de fluorescencia time-lapse microscopía. Además, proporcionar directrices a analizar las imágenes de microscopía.