Die Arbeit in der Gruppe der JWV wird von einem EU Marie-Curie Reintegration Fellowship, ein Sysmo2 Grant (NWO-ALW/ERASysBio), eine Horizon-Stipendium (ZonMw) und durch eine VENI Gemeinschaft (NWO-ALW) unterstützt. Die Gruppe der OPK wird von mehreren Standard-Zuschüsse (NWO), ein SYSMO1 (IGdeJ) und SYSMO2 gewähren, eine ESF Eurocores SynBio gewähren (SynMod) und durch die Kluyver Center for Genomics of Industrial Fermentation und die Top-Instituts für Lebensmittel und Ernährung unterstützt.

<ol>
	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development.">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li><li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation.">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li><li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis.">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li><li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems.">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li><li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides.">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li><li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division.">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li><li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li><li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSICIC:+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution.">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li><li>Montero, L. l. o. p. i. s. . P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li><li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li><li>Hoskins, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6.">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li><li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction.">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Im Gegensatz zu vielen anderen einzelnen Zelle Techniken kann der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie hier beschriebene Methode verwendet, um die Geschichte einer bestimmten Zelle mit Hinweis auf seine Vorfahren, sein Verhalten und Division Veranstaltungen folgen werden. In Kombination mit fluoreszenzmarkierten Ziel Promotoren oder Proteine, können umschriebene Entwicklungsstörung Stoffwechselwegaktivierung in Zeit-und Protein-Lokalisierung sowie Protein Dynamik kann während bakterielle Entwicklung beobachtet werden folgen. Wie bereits erwähnt, können Studien konzentriert sich auf verschiedene Bakterienarten durch die Anpassung der Wachstumsbedingungen nach den Anforderungen für ein bestimmtes Bakterium durchgeführt werden. Die einzigen Einschränkungen stießen wir an die Wachstumsbedingungen und Stichprobengröße zusammen. Aufgrund einer geschlossenen Umgebung können mittlere Bedingungen nicht während des Experiments geändert werden. Darüber hinaus kann ein Maximum von vier Stämme pro Experiment effizient überwacht werden. Angesichts einige kritische Schritte beschrieben, die einzelne Zelle Analyseverfahren kann hier leicht unter Verwendung eines automatisierten Mikroskop werden. Im Folgenden wird ein Überblick über diese wichtigen Schritte gegeben werden. Detaillierte Informationen finden Sie im Haupttext zu finden Allgemeine Vorbereitung:. Es ist ratsam, den Autofokus-Einstellungen für ein bestimmtes Bakterium vor dem Experiment erforderlich zu überprüfen. Ebenso sollte in etwa die optimalen Einstellungen für die Visualisierung von Fluoreszenz im Voraus bestimmt werden, wenn möglich. Darüber hinaus folgt eine vorbereitete time-line hilft, alle wesentlichen bereit, in der Zeit verwenden (Vorwärmen des Mikroskops Kammer, die Programmierung der Einstellungen des Mikroskops, die Vorbereitung der Folie 1 Stunde, bevor die Zellen in der gewünschten Wachstumsphase befinden, siehe Abbildung 1) haben . Das Wachstum der B. subtilis in TLM und CDM: TLM und CDM sind chemisch Hunger Medien definiert, in dem B. subtilis wächst nur langsam. Der Zeitraum, in dem die Zellen in den Medien angebaut werden müssen möglicherweise verlängert abhängig von der spezifischen Belastung werden. Das langsame Wachstum verhindert, dass Zellen häufen sich gegenseitig Vorbereitung des Mikroskops Probe:. Luftblasen zwischen den Gen-Rahmen, den Objektträger und dem Deckglas müssen verhindert werden, um umfangreiche Trocknen der Agarose-basierte Medium zu verhindern. Das gleiche gilt für das Medium / Deckglas-Schnittstelle. Es ist unverzichtbar, dass die Zellen genügend trocken, zum Schwimmen und / oder mehrschichtigen Wachstum zu verhindern Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie:. Vorwärmen der Folie sowie die Klimakammer ist entscheidend für die großen Autofokus Probleme zu vermeiden. Die Zellen sind in der Mitte einer Agar-Pad gewählt werden, da diese die höchste Chance, in Feld und Fokus während des Experiments (vorausgesetzt, die Probe wurde gut genug getrocknet) zu bleiben. Es können maximal 10 Stellen pro Experimente noch einwandfrei funktioniert. Nachdem Sie die erste Zelle des Interesses nur die Software, um den Fokus einzustellen (siehe Text für Details). Prüfen Sie, ob die Zellen noch in Fokus in den ersten Stunden des Versuches in 30 min Abständen Analyse:. Es ist wichtig, vor der erweiterten Analyse-Verfahren zu überprüfen, ob der Hintergrund des Mediums ähnliche Werte hat in der Fluoreszenz-Kanäle. Kleine Staubpartikel, mittel-Komponenten, verschmutzte Linsen oder winzige Agarose Klumpen können lokal erhöhte Fluoreszenz beitragen, dass der Film schwer oder unmöglich zu Trouble Shooting zu analysieren:. Wenn die Zellen auf der jeweils anderen zu wachsen, könnte dies entweder darauf hin, dass das Deckglas wurde angebracht zu früh oder dass das Medium nicht für das Wachstum von Mikrokolonien Monoschichten geeignet. Wenn Zellen von Interesse kontinuierlich vorzeitig sterben, während andere Zellen auf dem Objektträger glücklich zu teilen, möchten Sie vielleicht zu prüfen, ob Sie die UV-Filter setzen in Position. Es könnte auch dazu beitragen, die Belichtungszeit oder die Lichtintensität während der langen Experimenten zu verringern.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Gene Rahmen </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 cm </td></tr><tr><td> hochauflösende niedrig schmelzenden Agarose </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> großen Deckglas </td><td> mehrere </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> wenn gewünscht, Membran-Farbstoff, z. B. FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> andere Membran Farbstoffe sind ebenfalls erhältlich: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Zeitraffer-Mikroskop mit Klimakammer </td><td> mehrere </td><td></td><td> Details für unser Gerät in den entsprechenden Abschnitten </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

In den letzten Jahren beschäftigen sich Wissenschaftler zunehmend bewusst, dass die durchschnittlichen Daten von mikrobiellen Population basierten Experimenten nicht repräsentativ für das Verhalten, Status oder Phänotyp der einzelnen Zellen. Aufgrund dieser neuen Erkenntnisse die Anzahl der einzelnen Zelle Studien steigt kontinuierlich (neuere Übersichten siehe 1,2,3). Allerdings wissen viele der einzelnen Zelle angewandten Techniken nicht zulassen, dass die Überwachung der Entwicklung und das Verhalten einer bestimmten Zelle in der Zeit (zB Durchflusszytometrie oder Standard-Mikroskopie). Hier bieten wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung eines Mikroskopie-Methode in mehreren neueren Studien 4, 5, 6, 7, die nach und Aufzeichnung (Fluoreszenz) einzelnen bakteriellen Zellen von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae durch Wachstum und Teilung für viele Generationen ermöglicht werden. Die resultierenden Filme können verwendet werden, um phylogenetische Stammbäume durch Rückverfolgung der Geschichte einer einzelnen Zelle innerhalb einer Population, die von einem gemeinsamen Vorfahren entstanden zu konstruieren. Das Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie Methode kann nicht nur verwendet werden, um Wachstum, Teilung und Differenzierung der einzelnen Zellen zu untersuchen, sondern auch um die Wirkung von Zelle Geschichte und Abstammung auf spezifische zelluläre Verhalten zu analysieren. Darüber hinaus ist Zeitraffer-Mikroskopie ideal geeignet, um die Genexpression Dynamik und Proteinlokalisierung während der bakteriellen Zellzyklus zu untersuchen. Die Methode wird erläutert, wie die Bakterienzellen vorbereiten und bauen den Objektträger zu den Auswuchs von einzelnen Zellen in eine Mikrokolonie ermöglichen. Kurz gesagt, sind einzelne Zellen auf einem semi-feste Oberfläche aus Wachstumsmedium mit Agarose, auf dem sie wachsen und sich teilen unter dem Fluoreszenzmikroskop in einem temperierten Klimakammer ergänzt gesichtet. Die Bilder werden in bestimmten Abständen erfasst und später analysiert mit dem Open-Source-Software ImageJ.

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um einzelne Zelle Verhalten verschiedener Bakterien in der Zeit mit Hilfe automatisierter Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie zu überwachen. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien, wie die Mikroskopie-Aufnahmen zu analysieren.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

live-cell-imaging-bacillus-subtilis-streptococcus-pneumoniae-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

42.0K Aufrufe.  University of Groningen. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um einzelne Zelle Verhalten verschiedener Bakterien in der Zeit mit Hilfe automatisierter Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie zu überwachen. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien, wie die Mikroskopie-Aufnahmen zu analysieren.