Le travail dans le groupe de JWV est soutenu par une bourse Marie Curie de l&#39;UE de réintégration, une subvention Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), un horizon (ZonMw) de subvention et par une bourse VENI (NWO-ALW). Le groupe d&#39;OPK est soutenu par des subventions de plusieurs STW (NWO), un SYSMO1 (IGdeJ) et SYSMO2 subvention, une ESF Eurocores biologie synthétique subvention (SynMod) et par le Centre de génomique Kluyver de la fermentation industrielle et l&#39;Institut supérieur pour l&#39;alimentation et la nutrition.

<ol>
	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development.">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li><li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation.">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li><li>Veening, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division.">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li><li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li><li>Guberman, J. 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M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li><li>Hoskins, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6.">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li><li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction.">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Contrairement à beaucoup d&#39;autres techniques de cellule unique, la méthode time-lapse de microscopie par fluorescence décrites ici peuvent être utilisés pour suivre l&#39;histoire d&#39;une cellule spécifique à l&#39;égard de ses ancêtres, son comportement, et les événements de division. En combinaison avec des promoteurs cibles marquées par fluorescence ou de protéines, spécifiques activation de la voie de développement peuvent être suivies dans le temps et la localisation des protéines ainsi que la dynamique des protéines peuvent être surveillés pendant le développement bactérien. Comme indiqué plus haut, les études se concentrant sur différentes espèces bactériennes peuvent être réalisées en adaptant les conditions de croissance selon les exigences pour une bactérie spécifique. Les seules limites que nous avons rencontrées sont liées aux conditions de croissance et taille de l&#39;échantillon. En raison d&#39;un environnement hermétique, des conditions de milieu ne peut pas être changé pendant l&#39;expérience. Par ailleurs, un maximum de quatre souches par expérience peut être contrôlé efficacement. Considérant quelques critiques, la méthode seule cellule d&#39;analyse décrites ici peuvent facilement être appliqués en utilisant un microscope automatisé. Dans la suite, un aperçu de ces étapes critiques sera donnée. Des informations détaillées peuvent être trouvées dans le texte principal la préparation générale:. Il est sage de vérifier les réglages autofocus requis pour une bactérie spécifique avant l&#39;expérience. De même, environ paramètres optimaux pour la visualisation de la fluorescence devrait être déterminé à l&#39;avance, si possible. Par ailleurs, suite à un prêt de temps en ligne permet d&#39;avoir tout le matériel prêt à l&#39;emploi dans le temps (pré-réchauffement de la chambre du microscope, la programmation des réglages du microscope, la préparation de la lame, une heure avant les cellules sont en phase de croissance désiré, voir figure 1) . Croissance de B. subtilis dans le TLM et MDP: TLM et le MDP sont chimiquement défini les médias dans lesquels la famine B. subtilis ne pousse que lentement. La période de temps dans lequel les cellules sont cultivées dans les médias pourrait être prolongée en fonction de la souche spécifique. La croissance lente empêche les cellules de s&#39;accumuler sur l&#39;autre Préparation de l&#39;échantillon de microscope:. Bulles d&#39;air entre le cadre de gènes, la lame de verre et de la lamelle doit être empêché pour éviter le dessèchement vaste du milieu à base d&#39;agarose. La même chose vaut pour l&#39;interface de glissement moyen / couverture. Il est crucial de laisser les cellules assez sec, pour éviter la baignade et / ou de croissance de couches multiples Time-lapse de microscopie par fluorescence:. Pré-réchauffement de la lame ainsi que la chambre de l&#39;environnement est essentielle pour prévenir les problèmes majeurs autofocus. Les cellules doivent être choisis au milieu d&#39;un tampon d&#39;agar, puisque ceux-ci ont le plus de chance de rester dans le champ et de se concentrer pendant l&#39;expérience (fourni l&#39;échantillon a été séché assez bien). Un maximum de 10 emplacements par des expériences fonctionne toujours correctement. Après avoir sélectionné la première cellule d&#39;intérêt à utiliser le logiciel pour ajuster la mise au point (voir texte pour plus de détails). Vérifiez si les cellules sont encore en mise au point pendant les premières heures de l&#39;expérience dans des intervalles de 30 min. Analyse: Il est important de vérifier avant de procédures d&#39;analyse étendue si le contexte du milieu a les mêmes valeurs dans les canaux de fluorescence. Petites particules de poussière, les composantes moyennes, les verres sales ou minuscules touffes d&#39;agarose peuvent contribuer à la fluorescence localement accrue, ce qui rend le film difficile, voire impossible d&#39;analyser Dépannage:. Si les cellules se développent au-dessus de l&#39;autre, cela pourrait indiquer soit la lamelle a été attachée trop tôt ou que le support n&#39;est pas adapté à la croissance de monocouches microcolonie. Si les cellules d&#39;intérêt sans cesse mourir prématurément, tandis que d&#39;autres cellules sur la lame divisent heureusement, vous pouvez vérifier si vous mettez le filtre UV en position. Il pourrait également aider à diminuer le temps d&#39;exposition ou l&#39;intensité lumineuse au cours des expériences de long.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Gene Cadre </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 cm </td></tr><tr><td> haute résolution basse température de fusion d&#39;agarose </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> lamelle grands </td><td> plusieurs </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> si désiré, une membrane de teinture, par exemple FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> colorants autre membrane sont également disponibles: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Time-lapse microscope avec chambre environnementale </td><td> plusieurs </td><td></td><td> voir les détails de notre dispositif dans les sections correspondantes </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

Durant les dernières années les scientifiques de plus en plus conscients que la moyenne des données obtenues par des expériences de la population microbienne base ne sont pas représentatifs du comportement, le statut ou le phénotype des cellules individuelles. Grâce à cette nouvelle perspective le nombre d&#39;études seule cellule augmente continuellement (pour des revues récentes, voir 1,2,3). Cependant, la plupart des techniques cellule unique appliquée ne permettent pas de suivre l&#39;évolution et le comportement d&#39;une seule cellule spécifique dans le temps (par exemple, la cytométrie en flux ou la microscopie standard). Ici, nous fournir une description détaillée d&#39;une méthode de microscopie utilisée dans plusieurs études récentes 4, 5, 6, 7, ce qui permet de suivre et d&#39;enregistrer (de fluorescence des) personne cellules bactériennes de Bacillus subtilis et Streptococcus pneumoniae par la croissance et la division pour de nombreuses générations. Les films qui en résulte peut être utilisé pour construire des arbres phylogénétiques lignée en remontant l&#39;histoire d&#39;une cellule unique dans une population qui provenaient d&#39;un ancêtre commun. Cette méthode time-lapse de fluorescence microscopie peut être utilisé non seulement pour enquêter sur la croissance, la division et la différenciation des cellules individuelles, mais aussi d&#39;analyser l&#39;effet de l&#39;histoire de la cellule et l&#39;ascendance sur le comportement cellulaire spécifique. Par ailleurs, la microscopie time-lapse est idéalement adapté à examiner la dynamique de l&#39;expression génique et la localisation des protéines au cours du cycle cellulaire de la bactérie. La méthode explique comment préparer les cellules bactériennes et de construire la lame du microscope pour permettre à l&#39;excroissance de cellules individuelles dans une microcolonie. En bref, des cellules individuelles sont repérés sur une surface semi-solide composé d&#39;un milieu de croissance complétées par d&#39;agarose sur lequel ils croissent et se divisent sous un microscope à fluorescence dans un environnement contrôlé température de la chambre. Les images sont capturées à des intervalles spécifiques et sont ensuite analysés en utilisant le logiciel open source ImageJ.

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour surveiller le comportement seule cellule de bactéries différentes dans le temps en utilisant la fluorescence automatisée de microscopie time-lapse. En outre, nous fournir des lignes directrices comment analyser les images de microscopie.

Imagerie de cellules vivantes de la<emBacillus subtilis> Et Streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

live-cell-imaging-bacillus-subtilis-streptococcus-pneumoniae-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

42.0K vues.  University of Groningen. Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour surveiller le comportement seule cellule de bactéries différentes dans le temps en utilisant la fluorescence automatisée de microscopie time-lapse. En outre, nous fournir des lignes directrices comment analyser les images de microscopie.

Imagerie de cellules vivantes de la Et Streptococcus pneumoniae À l'aide automatisée de microscopie time-lapse