Ve Tulane Hipertansiyon ve NIH hibe olarak Mükemmeliyet Merkezi Böbrek P20RR017659-08 (PI: Bu çalışma Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (WL Murfee PI) Devleti Regents Kurulu tarafından desteklenmiştir : L. Gabriel Navar).

1. Cerrahi Prosedür Set-Up Notlar <ol><li> Ameliyat öncesinde cerrahi malzemeleri ve aletleri sterilize edin. Her bir sıçan için steril cerrahi işlem için kullanılan Malzemeleri araçların yerleştirilmesi için steril bir yüzey olarak dışarı yerleştirebilinirler 1 drape dahil, merkezi x 1.5 0.5 hakkında önceden kesilmiş delikli bir drape sıçan üzerine yerleştirilecek ve gazlı bez. Esnasında, önceden kesilmiş delik sıçan üzerinde yapılan bir kesi ile uyumlu hale getirecektir. Ameliyat için gerekli Aletleri dikiş malzemesi kesmek için kullanılacak makas 1 standart çift, iki forseps ve sütür taşınması ve kavrama için ince bir iğne tutucu ve bir bıçak ile bir neşter vardır. Biz Özel Cerrahi Malzemeler ve Araçlar Tablo bizim laboratuar tarafından kullanılan ortak araçları listeledik. Ancak, nihai aracı seçim deneyci tercihlerine bağlıdır. </li><li> Cerrahi alan hazırlayın. Sağlamak için bir ısıtma yastık altında bir 100 ml% 0.9 steril tuzlu su torbası koyun o kişi w gelir tuzluITH mezenter dokusunun yaklaşık 37 için önceden ısıtılır ° C Salin bir alternatif olarak, Ringer çözeltisi ya da başka bir fizyolojik tampon kullanabilir. Eksteriorizasyon işlemi sırasında kolay erişim için steril bir örtü üzerine steril cerrahi aletler ve malzemeleri yerleştirin. Ayrıca, steril pamuk uçlu aplikatörler ve sütürlerin uygun 3 tip (4-0, 5-0 ve 7-0) ihtiyacınız olacaktır. Emin paketleri malzemeleri steril taşıma ile erişilebilir, böylece önceden açılmış yapar. Son olarak, en az 5 dakika için% 100 etanol içinde daldırarak pre-değiştirilmiş plastik aşaması dezenfekte. Aşamada merkezi (Şekil 1) kesilmiş bir eliptik delik olan bir 100 mm Petri yemektir. A Dremel Aracı başlangıçta yapmak ve, gerektiği takdirde, deliğin genişletmek için kullanılabilir. Deliği yapıldıktan sonra, kesme plastik kenarları farklı tanelerinin zımpara kağıdı kullanılarak düzgün yapılır. Sahne sonra ya etkisiz kil modelleme (yerel el sanatları mağaza satın alınan) veya Silic, nihayet, yıkanmış ve birTutkal yükseltilmiş bir düz yüzey temin etmek için delik kenarına eklenir. Doku ile temas öncesinde, sahne yeterince steril tuzlu su ile durulanmalıdır gerekecektir. </li><li> Anjiyogenez bu model için, biz genellikle erişkin erkek Wistar sıçanlar (350 ± 25 gr) kullanın. Diğer sıçan suşlara ve yaş kullanılabilir. Laboratuvarımızda, sıçanlar ketamin (80 mg / kg), ksilazin (8 mg / kg) ve atropin (0.08 mg / kg) ile intramüsküler enjeksiyon yoluyla anestezi uygulanmıştır. Yaklaşık 5 dakika sonra, anestezinin etkisi onaylanır ve farenin karın cildi tıraş edilir. </li></ol> 2. Sıçan mezenter eksteriorizasyon Modeli <ol><li> Vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerinde sırtında anestezi sıçan yerleştirin. Aseptik teknikler cerrahi işlem sırasında kullanılan. Steril eldiven giyin ve araç ve gereçlerin sıçan dokuları dışında steril olmayan yüzeylere temas etmesine izin vermeyin. </li><li> Mendil USI alternatif karın alanı temizleyinng% 70 izopropil ve iyot ile ıslatılmış steril gazlı bez. </li><li> Bisturi bıçak kullanılarak, cilt üzerinde küçük (yaklaşık 0,75 inç) uzunlamasına kesik ve sonra aşağıda sternum linea alba yaklaşık 1 inç edin. </li><li> Açıklığı kesi aynı hizada olacak şekilde karın bölümünün üzerine önceden kesilmiş drape yerleştirin. </li><li> Yavaşça kesi çevresinde basınç uygulayın. Bu genellikle kolayca tespit edilmesi için yeterince ince bağırsakta ortaya çıkmasına sebep olacaktır. </li><li> Pamuk uçlu aplikatör kullanarak, yavaşça ince bağırsağın bir bölümü çekin ve ileum bulun. Mezenter çekilirse gibi, yavaşça plastik aşamada (Şekil 2) dışarı yerleştirebilinirler gerekir. </li><li> 6-8 vaskülarize mezenterik pencereleri belirleyin. A mesenterik penceresi ince bağırsağın (Şekil 2) besleme arter / ven çiftleri arasındaki ince geçirgen zar olarak tanımlanır. </li><li> Eksteriorizasyon başlangıç ​​zamanı kaydedin. Mesente bırakınry bölüm 20 dakika batın. Eksteriorizasyon dönemde aralıklı doku batırma kalır ve kurumasına değil emin olmak için Petri kabındaki tuzlu su doldurmak için steril bir enjektör (5 ml) kullanın. </li><li> 20 dakikalık süresi boyunca, steril 7-0 sütür ile 2 merkezi mezenterik pencereleri işaretleyin. Işaretleri bağırsağın yakın yağ alanında yapılmalıdır. </li><li> Karın boşluğuna mezenter batın bölgesi dönün. </li><li> Kesintiye desen 5-0 monofilament sütür ile karın kas kapatın. </li><li> Kesintiye desen 4-0 monofilament sütür ile cilt kapatın. </li><li> % 70 isopropoyl ve iyot ile ıslatılmış steril gazlı bez mendil kullanarak alternatif ile sütüre alanı silin. </li><li> Sıçan her iki göz de göz kayganlaştırıcı jel sürün. Göz kayganlaştırma amacı, cerrahi işlem sırasında ve geri kazanım kornea kurumaya önlemektir. Göz yağlayıcı uygulama uygulanmalıdırcerrahi müdahale başlamadan önce. Gerekirse, kurtarma için kendi kafesine sıçan dönmeden önce göz yağ yeniden uygulayın. </li></ol> 3. Doku Hasat ve Fiksasyon <ol><li> Ilgi sonrası stimülasyon gününde, uyutmak ve sıçan euthanize. Laboratuvarımızda, fareler beuthanasia intrakardiak ile ötenazi ardından intramuskuler ketamin (80 mg / kg), ksilazin (8 mg / kg) ve atropin (0.8 mg / kg) ile enjeksiyon ve üzeri anestezi vardır. Beuthanasia hızlı ve ağrısız ötenazi için kullanılabilecek bir sodyum pentobarbital / fenitoin çözümdür. 0.2 ml - sıçan başına laboratuvar genelde 0.1 enjekte eder. </li><li> Karın boşluğuna yeniden açın ve yavaşça ince bağırsak kaldırmak ve iki işaretli pencere bulun. </li><li> Forseps ve mikro-makas kullanarak batın mezenterik pencereleri her kesin. Yağ başına pencerenin bir sınır da dahil olmak üzere daha sonraki dokusu mikroskop lamı üzerine yaymak için avantajlıdır. HemenPBS her pencere batırmayın. Keserken, pencerelerin dolum potansiyel kan aza indirmek için pencere yağ sınırları içinde arter / ven çiftleri ile kesme kaçınıyorum. Ayrıca, bağırsak içeriği sonuç pencereleri temas ettiği barsak ile kesme aza indirmek. </li><li> Pozitif yüklü mikroskop lamı üzerine dokulara yayılmasına forseps kullanın. İki dokular slayt başına monte edilebilir. </li><li> Dokuların kısmen kurutun ve bir neşter bıçağı aşırı şişman kaldırmak kullanarak izin verin. </li><li> Dokular artık sabit hazırız. Tipik fiksasyon yöntemleri kullanılabilir. Laboratuarımızda, biz genellikle 30 dakika boyunca metanol (-20 ° C) slaytlar düzeltmek. Başarılı etiketleme da sabitlenmemiş dokuları ile yapılmıştır. Tespit yöntemlerinin tercih edilen antikor bağlı olabilir. </li></ol> 4. Doku ile immün <ol><li> Dokular genel şimdi immünhistokimya için antikor başına talimatlarına göre etiketli olabilir. Rolleri belirlemek bizim ilgi göz önüne alındığındaanjiyogenez sırasında damar perisitler, bizim laboratuar yaygın endotel ve perivasküler hücreleri 10, 12, 13 için etiketler. Mikrovasküler ağların hiyerarşisi boyunca endotel hücreleri tanımlamak için yararlıdır etiketlerin, bir anti-PECAM antikor veya BSI-lektin vardır. Bu doku kullanılan perivasküler hücre işaretleyicileri NG2, desmin SM-α aktin, PDFGRβ ve sınıf III β-tubulin içerir. Aşağıda, bölüm 3.3 &#39;de, biz kolorimetrik ve floresan PECAM immün protokolleri protokolleri listeledik. </li><li> İlk primer antikor inkübasyon öncesi, kaydıraklar aşırı tampon çözeltisi kaldırmak için vakumda kurutulur vardır. Ayrıca, dokular, başlangıçta uzağa dokudan antikor çözeltileri kontrolsüz akışını önlemek için bir balmumu kalem ile açıklanmaktadır. Son olarak, tüm etiketleme adımları yıkama adımları takip ediyor. Adımları yıkama için, slaytlar boyama kavanoz içine yerleştirilir. Tampon çözelti yıkama süresi sırasında 3 kez değiştirilir. </li><li> Endotel hücre antikor etiketleme prosedürleri: &lt;p class = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM Kolorimetrik Lableing <ol><li> Primer antikor inkübasyon: Her doku üstünde yaklaşık 100-200 ml primer antikor çözeltisi (antikor tampon içinde seyreltilmiş 1:200 fare biyotinile CD31 monoklonal antikor (PBS +% 2 BSA% 0.1 Saponin)) Damla; bütün doku olduğundan emin olun antikor çözeltisi ile kaplanmıştır. Oda sıcaklığında 1 saat için inkübasyon. </li><li> 30 dakika süreyle PBS +0.1% saponin ile dokuları yıkayın. </li><li> İkincil antikor inkübasyon: Damla sekonder antikor çözeltisi (Vector Laboratories VECTASTAIN Elit ABC çözümü; bir streptavidin peroksidaz sekonder antikor çözeltisi) doku üstünde. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 30 dakika süreyle PBS +0.1% saponin ile dokuları yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca vektör Nova Kırmızı ile dokuları inkübe edin. Sonra su ile dokulara yükselecek. </li><li> Dağı slaytlar:% 95 etanol Dip slaytlar 10 kez. Immerse 2 dakika için% 100 etanol içinde kayar. Başka bir% 100 etanol içinde bırakın slaytlar yüzden2 dakika için Direkt Ekspres. Ardından 2 dakika arayla üst üste% 100 ksilen çözümler batırmayın slaytlar. VectaMount ince bir tabaka ve bir coverslip ile dokuları kurutmak ve kapatmak için izin ver. </li></ol> PECAM Floresan Etiketleme <ol><li> Primer antikor inkübasyon: Her doku üstünde yaklaşık 100-200 ml primer antikor çözeltisi (antikor tampon içinde seyreltilmiş 1:200 fare biyotinile CD31 monoklonal antikor (PBS +% 2 BSA% 0.1 Saponin)) Damla; bütün doku olduğundan emin olun antikor çözeltisi ile kaplanmıştır. Oda sıcaklığında 1 saat için inkübasyon. </li><li> 30 dakika süreyle PBS +0.1% saponin ile dokuları yıkayın. </li><li> Sekonder antikor inkübasyon:. Doku üstüne Damla sekonder antikor çözeltisi ((1:100 Streptavidin-Cy3 (PBS +% 2 BSA ile% 0.1 Saponin) antikoru tamponu içinde seyreltilir) 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe. </li><li> 30 dakika süreyle PBS +0.1% saponin ile dokuları yıkayın. </li><li> Dağı slaytlar: dokuların üst gliserol 50:50 PBS Damla. Kapakkapak kayma ile. Sonra, kapak kayma ve slayt arasındaki boşluğu kapamak için tırnak cilası kullanabilirsiniz. </li></ol></li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Immünohistokimyasal PECAM için etiketli sıçan mezenter dokuların Temsilcisi görüntüleri Şekil 3 görüntülenir. PECAM etiketleme mikrovasküler ağlar remodeling hiyerarşisi boyunca damar türleri tanımlar ve spesifik zaman noktalarında sonrası uyarılması azından anjiyojenik ölçümlerini ölçmek için kullanılabilir. PECAM etiketleme da damarları karşı venüller belirlenmesi için olanak sağlar. Besleme arteriyollerde genellikle eşleştirilmiş venüller (Şekil 4) göre daha küçük çaplarda ve uzamış endotel hücre morfolojisi gösterirler. Kılcal ve kılcal damar filizi kendi çapına ve bir şebeke dahilindeki göreli konumu göre tespit edilebilir. Remodeling ağlar tipik özellikleri arttı filizlenmesi kılcal damar yoğunluğu, damarlı bölge ve venular kıvrımlı dahilSığ. Çeşitli anjiogenik ölçümleri Kantitasyonu ağ büyüme (Şekil 5) zamanında ders tanımlar. Gün 3 ve 5. Gün ve Gün 10 unstimulated seviyeye getirileri arasında önceden var olan gemiler, tepelerinden filizlenme Kapiller. Küba&#39;da Bu geçici bir artış damar yoğunluğu ve damarlı bölge artışlar takip eder. Bu modelde büyük damarların yeniden kanıt olarak, arteriol ve venül segment sayısı da zaman boyunca artar. Laboratuvarımızda, bu model Bu yenilenme sürecinde 10, 11 sırasında belirli bir zaman noktasında hücresel fenotipik değişiklikleri tanımlamak için kullanılmaktadır. Örneğin, sınıf III β-tubulin anjiyogenik damarlar boyunca perisitler (Şekil 6) tanımlar. Unstimulated dokularda, sınıf III β-tubulin ifadesi sinir özgüdür. Bunun aksine, filizlenme kılcal tepe boyunca, sınıf III β-tübülin perivasküler hücreler olarak ifade edilir. Bu türsonucu anjiyo sürecine dahil yeni hücre tipleri tanımlamak için bu basit ve sağlam anjiyogenik modelinin kullanımını vurgulamaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> Şekil 1. Plastik sahne öncesi ve sonrası modifikasyon Görüntüler. Önceden modifiye aşamasında 100 mm Petri yemektir. Değişiklikler merkezinde elips şeklinde bir delik kesim ve kabarık, düzgün bir yüzey yaratmak için deliğin kenarına modelleme kil veya silikon tutkal sonradan eklenmiş. Bu yüzey batın mezenterik pencerelerin superfusion kolaylaştıran bir iç sınır sağlar. Ölçek çubuğu 1 cm. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> Şekil 2. Batın mezenterik bölgenin görüntüsü. Mezenterik pencereler ince bağırsağın besleyen arter / ven çiftleri arasındaki ince geçirgen membranların olarak tanımlanır. Eksteriorizasyon sırasındasüresi, mezenterik bölgede ortaya koydu ve bir modifiye petri içinde tuzlu batırılır. İnert sarı kil modelleme önceden kesilmiş delikten çekilebilecek şekilde mezenter için pürüzsüz bir yüzey sağlar. Ölçek çubuğu 1 cm. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> Şekil 3. Unstimulated doku ve doku 3 ve mezenter 10 gün sonrası eksteriorizasyon gelen mezenterik mikrovasküler ağların Temsilcisi görüntüler. PECAM etiketleme arteriyoller (A), venüller (V) ve kılcal (C) de dahil olmak üzere mikrovasküler ağların hiyerarşisi tanımlanır. Mesaj stimülasyon, mikrovasküler ağlar kılcal çimlenme (ok başları) ve damar yoğunluğunda bir artış göstermiştir. Ölçek çubuğu 100 mikron olduğunu. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> Erişkin sıçan mezenterik mikrovasküler ağ içinde arteriyol / venül çiftleri Şekil 4. Temsilcisi görüntüleris. Her iki görüntüleri, arteriol (A) daha küçük bir göreceli çap ve uzamış endotel hücre morfolojisi dayalı venüller (V) ayırt edilebilir. Ölçek çubukları 20 mm&#39;dir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> Şekil 5. Mikrovasküler büyüme sonrası mezenter eksteriorizasyon zaman boyunca anjiyogenik ölçümlerini Temsilcisi miktar. Doku alanı başına A) Vasküler alanı. Vasküler alana düşen kılcal filizi B) sayısı. Vasküler alan başına C) Toplam damar uzunluğu. * Unstimulated grubuna göre anlamlı bir farklılık gösterir. İstatistiksel karşılaştırmalar Dunn testi tarafından izlenen bir One-Way ANOVA kullanılarak yapılmıştır. (P &lt;0.05). UN unstimulated temsil eder. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> Şekil 6. 3 ve 10 unstimulated doku ve dokulardan mezenterik mikrovasküler ağların Temsilcisi floresan görüntülerigün mezenter dışsallaştırdığını gönderin. Immünofloresan PECAM etiketleme (kırmızı) endotel hücreleri tanımlayan ve sınıf III β-tubulin etiketleme (yeşil) sinirler (ok başları) ve perivasküler hücreleri (oklar) tanımlar. Perivasküler hücreler geçici çimlenme kılcal sırasında sınıf III β-tubulin upregulate. Unstimulated mikrovasküler ağlarda, sınıf III β-tubulin sinir özeldir ve perivasküler hücreleri belirlemek değil. 3 gün sonrası stimülasyon, sınıf III β-tubulin olumlu mikrodamarlar birlikte perivasküler hücreler etiketler. Günlük 10, sınıf III β-tubulin ifade desen unstimulated senaryoyu geri dönmeye başlarlar. Ölçek çubuğu 50 mikron olduğunu. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> Şekil 7. Mezenter eksteriorizasyon tarafından uyarılan mikrovasküler ağ büyüme sırasında izleme önceden etiketli lokal olarak uygulanan hücre fizibilite destekleyen Görüntüler. Hücreler Mezenter üzerinde superfused edildi20 dakikalık eksteriorizasyon döneminde ic pencereler. 1 gün sonrası cerrahi, DII etiketli hücreleri (kırmızı) PECAM pozitif mikrodamarlar (yeşil) ile dame odak düzlemi gözlendi. DII etiketli kemik iliği hücrelerinin A, B) Örnekler morfolojileri yuvarlak ve uzamış sergilenmesi. Bazı durumlarda (oklar) hücreleri kılcal boyunca uzamıştı. C) DII bir küme Örneği (ok) filiz kılcal bir ucu yakınında mezenkimal kök hücreleri etiketli. Ölçek çubukları 50 um (A) ve 20 um (B, C) vardır.

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases.">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407, 249-257 (2000).</li><li>le Noble, F. A., Stassen, F. R., Hacking, W. J., Struijker Boudier, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+hypertension.">Angiogenesis and hypertension.</a> J. Hypertens. 16, 1563-1572 (1998).</li><li>Peirce, S. M., Skalak, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+remodeling:+a+complex+continuum+spanning+angiogenesis+to+arteriogenesis.">Microvascular remodeling: a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis.</a> Microcirculation. 10, 99-111 (2003).</li><li>Anderson, C. R., Ponce, A. M., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+identification+of+an+extracellular+matrix+scaffold+that+microguides+capillary+sprouting+in+vivo.">Immunohistochemical identification of an extracellular matrix scaffold that microguides capillary sprouting in vivo.</a> J. Histochem. Cytochem. 52, 1063-1072 (2004).</li><li>Ponce, A. M., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+stimulus+determines+the+positioning+of+pericytes+within+capillary+sprouts+in+vivo.">Angiogenic stimulus determines the positioning of pericytes within capillary sprouts in vivo.</a> Microvasc. Res. 65, 45-48 (2003).</li><li>Franzen, L., Ghassemifar, R., Malcherek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mast+cell+activation+improves+connective+tissue+repair+in+the+perforated+rat+mesentery.">Experimental mast cell activation improves connective tissue repair in the perforated rat mesentery.</a> Agents Actions. 33, 371-377 (1991).</li><li>Anderson, C. R., Hastings, N. E., Blackman, B. R., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+sprout+endothelial+cells+exhibit+a+CD36+low+phenotype:+regulation+by+shear+stress+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+mechanism+for+attenuating+anti-proliferative+thrombospondin-1+signaling.">Capillary sprout endothelial cells exhibit a CD36 low phenotype: regulation by shear stress and vascular endothelial growth factor-induced mechanism for attenuating anti-proliferative thrombospondin-1 signaling.</a> Am. J. Pathol. 173, 1220-1228 (2008).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Mesentery+Angiogenesis+Assay.">Rat Mesentery Angiogenesis Assay.</a> J. Vis. Exp. (52), e3078 (2011).</li><li>Murfee, W. L., Rehorn, M. R., Peirce, S. M., Skalak, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+cells+along+venules+upregulate+NG2+expression+during+microvascular+remodeling.">Perivascular cells along venules upregulate NG2 expression during microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 13, 261-273 (2006).</li><li>Stapor, C. P., Murfee, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+class+III+&#946;-tubulin+as+a+marker+of+angiogenic+perivascular+cells.">Identification of class III &#946;-tubulin as a marker of angiogenic perivascular cells.</a> Microvascular Research. , (2011).</li><li>Yang, M., Aragon, M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+Mesenteric+Microvascular+Networks+from+Spontaneously+Hypertensive+Versus+Normotensive+Rats.">Angiogenesis in Mesenteric Microvascular Networks from Spontaneously Hypertensive Versus Normotensive Rats.</a> Microcirculation. , (2011).</li><li>Robichaux, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic/Blood+endothelial+cell+connections+at+the+capillary+level+in+adult+rat+mesentery.">Lymphatic/Blood endothelial cell connections at the capillary level in adult rat mesentery.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 293, 1629-1638 (2010).</li><li>Amos, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+The+role+of+human+adipose-derived+stromal+cells+in+inflammatory+microvascular+remodeling+and+evidence+of+a+perivascular+phenotype.">IFATS collection: The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype.</a> Stem Cells. 26, 2682-2690 (2008).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Eksteriorizasyon modeli 2006 yılında bildirilmiş ve anjiyogenez 4-7 önceki mekanik yaralanma sıçan mezenter modelleri uyarlanan ve sıçan mezenter 9 yararlanmak iyi kurulmuş ip enjeksiyon modelleri benzer sonuçlar üretir. 20 dakikalık eksteriorizasyon zaman deneysel olarak sağlam bir anjiyojenik yanıt üretmek belirlendi. Bu dönemde farklı şekillerde olabilir iken, mekanik çalışmalar ve hücre soyu çalışmalar için eksojen hücrelerinin doğrudan uygulama için anjiyogenik inhibitörlerinin yerel uygulama 4 için izin vermiyor. Mezenterik doku remodeling hücre içine şirketleşme Fizibilite önceden etiketli kemik iliği hücreleri ve mezenkimal kök hücreler (Şekil 7) kullanarak bizim laboratuvarda ön çalışmalar, ve insan adipoz-kaynaklı stromal hücrelerin enjeksiyon ip 14 akıbetini soruşturuyor başarısı tarafından desteklenmektedir . Laboratuarımızda, biz pericyte phen tanımlamak için bu model kullandımanjiogenik yanıt 10 saat boyunca ve hipertansiyon 12 gibi patolojik durumlar sırasında anjiyogenik potansiyelini değerlendirmek amacıyla otypic değişir. Anjiyojenik tepki ve bu model ile ilişkili hücre fenotipi değişiklikler de kronik hipoksiye maruz kalma 10, 11 gibi diğer sıçan mezenterik anjiyogenik modelleri görülebilir. Dışsallaştırdığını modeli bir sınırlaması anjiyogenez tam tetikleme mekanizması bilinmemektedir olmasıdır. Mezenter dışsallaştırdığını mast hücre degranülasyonu ve artan histamin düzeyi 6 ile bağlantılı olduğunu, ancak daha fazla araştırma daha fazla bilgi edinmek için gereklidir. Anjiogenik uyaran bir mikrovasküler ağ hiyerarşisi karşısında sağlam bir yeniden şekillenme tepki üreten, kuşkusuz çok etkenli olduğunu. Bilinmeyen mekanizmalar bu modelin önemli bir eleştirisini kalırken, yeniden üretimi ve basitlik hücresel dinamikleri invol belirlenmesi için cazip haledoğası gereği karmaşık kılcal filizlenme sürecinde ved. Modelin tekrarlanabilirliği laboratuarımızda 10, 12 daha önce yayınlanmış çalışmaların birden fazla sıçan suşları arasında mikrovasküler ağ büyüme (Wistar erkek ve dişi Sprague-Dawley) zamanında boyunca karşılaştırılabilir anjiyogenik ölçümlerini tarafından desteklenmektedir. Bu yana, yetişkin sıçan mesenterik dokuların çoğunluğu damarlı olup, model ayrıca hayvan başına incelenmek üzere birden fazla dokular için olanak sağlar. Fare mezenterik pencereler az yerli kanlanmalı ve bizim deneyim, sık gözlenebilen dallanma ağlar yoksun Ne yazık ki, bu model genetik fare modelleri ile açıkça geçerli değildir. Gelecek uygulamalar belirli zaman noktalarında intra-vital mikroskopi kullanılarak anjiyogenezi sırasında geminin işlevsellik soruşturma ve lenfanjiyogenezin ve nöron dahil ilgili hücresel dinamiklerinin incelenmesi içerir. Mezenterik pencere başına yerli vaskülarizasyonu ölçüde rou görünmesine rağmenyaş ile orantılı ghly, 4-5 haftalık kadar genç erkek Wistar sıçanlarda mikrovasküler ağları dallanma gözlemledik. Bu gözlemler eksteriorizasyon modeli de çağlar boyunca bir anjiyojenik farkları karşılaştırmak için uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Ek yorumlar </td></tr><tr><td> Asmak </td><td> Cardinal Health </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot; Bio-Shield Düzenli Sterilizasyon sarar </td></tr><tr><td> Noyes Mikro Makas </td><td> Roboz Cerrahi Alet </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes Micro Bahar Makas Kesme; Düz, Sharp-Blunt Nokta; 13mm Cutting Edge; 0.25mm İpucu Genişlik, 4 1/2 &quot;Uzunluk </td></tr><tr><td> Graefe forsepsle </td><td> Roboz Cerrahi Alet </td><td> RS-5135 </td><td> Forseps Kesme Micro, tırtıllı, hafif eğri; 0.8mm İpucu Genişlik; 4 &quot;Uzunluk </td></tr><tr><td> Graefe forsepsle </td><td> Roboz Cerrahi Alet </td><td> RS-5130 </td><td> Mikro Kesme Forseps, Dişli, Düz; 0.8mm İpucu Genişlik; 4 &quot;Uzunluk </td></tr&gt; <tr><td> 4-0 sütür </td><td> Ethicon </td><td> 699G </td><td> (1.5 metrik) ETHILON Naylon Dikiş Siyah Monofilament </td></tr><tr><td> 5-0 sütür </td><td> Ethicon </td><td> 8556 </td><td> (1.0 metrik) prolen poliprolen Sütür Mavi Monofilament </td></tr><tr><td> 7-0 sütür </td><td> Ethicon </td><td> 1647G </td><td> (0.5 metrik) ETHILON Naylon Dikiş Siyah Monofilament </td></tr><tr><td> Castroviejo Micro Needle Holder </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 12060-02 </td><td> İpucu Genişlik: 0.6mm 5mm: Uzunluk Sıkma Uzunluk: 9cm Düz ucu </td></tr><tr><td> Castroviejo İğne Tutucu </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 12565-14 </td><td> İpucu Şekli: Düz İpucu Genişlik: 1.5mm Mengene Uzunluk: 10mm Makas: Hayır Kilit: Evet Uzunluk: 14cm Dişli: Evet </td></tr><tr><td> Neşter Kolu </td><td> Roboz Cerrahi Alet </td><td> RS-9843 </td><td> Neşter Kolu, # 3; Katı, 4 &quot;Uzunluk </td></tr><tr><td> Steril Cerrahi Bıçak </td><td> Cincinnati Cerrahi </td><td> 0110 </td><td> Paslanmaz Çelik; Boyutu 10 </td></tr><tr><td> Petri Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td> Slippable eğimli Ridge, </td></tr></tbody></table> Özel Cerrahi Araç ve Gereçler Tablo. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Ek yorumlar </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering-Plough Hayvan Sağlığı Corp Birliği (MWI Veteriner kaynağından Sıralı) </td><td> MWI #: 011.168 </td><td> Aktif Madde: 100 ml başına, 390 mg sodyum pentobarbital, 50mg fenitoin sodyum </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Fort Dodge Hayvan Sağlığı (MWI Veteriner kaynağından Sıralı) </td><td> MWI #: 000.680 </td><td> Kateset 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Ksilazin </td><td> LLOYD. A.Ş. (MWI Veteriner kaynağından Sıralı) </td><td> MWI #: 009.307 </td><td> 100 mg / ml Anased </td></tr><tr><td> Tuzlu </td><td> Hospira A.Ş. </td><td> 94-217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASTAIN Elit ABC </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Vektör Nova Kırmızı </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> Özgül Reaktifler Tablo

rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis

Mikrovasküler ağ büyüme ve yeniden yapılanma yara iyileşmesi, inflamasyon, diyabetik retinopati, tümör büyümesi ve diğer hastalık koşulları 1, 2 kritik yönleri vardır. Ağ büyüme genellikle önceden varolan damarlardan yeni damarların büyümesi olarak tanımlanan anjiyogenez, atfedilir. Anjiogenik süreci de doğrudan bir perivasküler hücre kaplama ve damar genişlemesi kılcal edinimi olarak tanımlanan, arteriogenesis bağlantılıdır. Söylemeye gerek yok, anjiyogenez karmaşık ve hücresel ve moleküler düzeyde 3 birden fazla oyuncu içerir. Bir mikrovasküler ağ büyüdükçe ne anlama anjiyogenez süresi boyunca bir ağ hiyerarşisi boyunca zamansal ve mekansal dinamiklerini tanımlamak gerektirir. Bu bilgiler, damar büyüme manipüle yönelik tedavilerin geliştirilmesi için kritiktir. Bu makalede açıklanan eksteriorizasyon modeli uya için basit, tekrarlanabilir modeli temsilsıçan mezenter anjiogenezisi alanlarındaki durum. Bu sıçan mezenter 4-7 yara iyileşmesinde modellerden uyarlanmış ve pro-anjiyogenik ajanlar 8, 9 ip enjeksiyon yoluyla mezenterinde anjiyogenez uyarmak için bir alternatif oldu. Minimal cerrahi girişim gerektirir ve tek için tüm mikrovasküler ağların iki boyutlu görselleştirme sağlayan bir doku nispeten kısa bir süre boyunca kılcal lahanası, damar alanı ve damar yoğunluğu dramatik, tekrarlanabilir artar aşağıya üretir çünkü eksteriorizasyon modeli çekici hücre düzeyinde. Uyarılmış büyümesi yabancı anjiyogenik moleküllerin müdahalesi olmaksızın fizyolojik bir ortamda doğal anjiyogenik yanıtları yansıtır. Immünohistokimyasal etiketleme yöntemleri kullanarak, bu model anjiyogenez katılan yeni hücresel olayları tanımlamada son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Araştırmacılar, kolayca zaman sp yeniden şekillenme zamanı sırasında anjiyogenik ölçümleri ilişkili olabilirBu tür hücre fenotipik değişiklik ya da hücresel etkileşimler 4, 5, 7, 10, 11 gibi ecific dinamiği,.

Watch this Scientific Journal Video about Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis at JoVE.com

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Bu makale sıçan mezenter anjiogenezisi teşvik için basit bir model tanımlamaktadır. Modeli aşağı tek hücre düzeyine kadar tüm mikrovasküler ağlarının yüz görselleştirme tr sağlayan bir doku nispeten kısa bir süre boyunca kılcal filizlenmesi, damar alanı ve damar yoğunluğu dramatik artış üretir.

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

rat-mesentery-exteriorization-model-for-investigating-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K Görüntüleme.  Tulane University. Bu makale sıçan mezenter anjiogenezisi teşvik için basit bir model tanımlamaktadır. Modeli aşağı tek hücre düzeyine kadar tüm mikrovasküler ağlarının yüz görselleştirme tr sağlayan bir doku nispeten kısa bir süre boyunca kılcal filizlenmesi, damar alanı ve damar yoğunluğu dramatik artış üretir.

Video: Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Bir Anjiyogenez Çalışma in vitro model (Röportaj)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Biyoloji

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Montaj ve &#39;Kayma Rings&#39; Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...