Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (hibe sayısı MCB-0.447.750) bir hibe tarafından finanse edildi.

1. Ice-Cap Fide Tabaklar Agar Büyüme Medya ile hazırlayın Erimiş büyüme ortamı (0.5x Murashige ve Skoog (MS), bazal tuz karışımı, 2 mM Morpholinoethanesulfonic asit (MES),% 0.6 agar (w / v), pH 5.7) MicroFill Mikroplaka Dispenseri kullanarak otoklavlanmış Fide Tabaklar içine sürülür. Bir litre medya 18 Fide Tabaklar başına ihtiyaç vardır. <ol><li> Vidalı üst kapakları ve 20 dakika otoklav ile bir litrelik cam şişelerde büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> Otoklav bir litre distile su vidalı kapak ile cam şişe. Aynı zamanda da alüminyum folyo ile sarılmış boş Fide Tabaklar otoklavda. </li><li> 65 yaşında bir kuluçka ayarlamak için otoklava medya ve su transferi ° C Bu sıcaklık, erimiş bir devlet büyüme ortamı devam edecektir. </li><li> Otoklav sonrası, folyo ve kuru laminer akış kaput yer Fide Tabaklar çıkarın. Tabaklar, yapışkanlı bant, böylece geçmeden önce tamamen kuru olmalıdırtamamen plakaların kuyuların alt delik mühür. </li><li> % 95 etanol ile sterilize etmek için bench aşağı doğru silin. </li><li> Sterilize etmek için,% 95 etanol Fide Tabaklar için şeffaf plastik kapaklar bekletin. Laminer akış kaput etanol ve kuru hava kapaklarını çıkarın. Otoklav eriyecek, çünkü plastik kapaklar sterilize etmek için otoklava sokmayın. </li><li> Ambalaj bandını her Fide Plaka altına uygulayın ve sıkıca rulo aracını kullanarak mühür. </li><li> 65 ° C&#39;de su banyosu içinde erimiş büyüme ortamı ve steril suyun şişe yerleştirin. </li><li> MicroFill makineye oda sıcaklığında% 70 etanol içeren bir şişe takın ve tasfiye döngüsü MicroFill makine tesisat sterilize etmek için iki kez çalıştırmak. </li><li> MicroFill makine steril su ile şişe takın. Sıhhi tesisat sıcak ve etanol sistemi temizlemek için temizleme çevrimi altı kez çalıştırın. Bu işlem boyunca şişe su 65 ° C banyo kalmalıdır. </li><li> Steril su ile temizler tamamladıktan sonra, hemen MicroFill makine erimiş büyüme medya şişe takın. Tasfiye döngüsü distile su tesisat temizlemek için iki kez çalıştırın. Bu işlem boyunca 65 ° C banyo şişe büyüme medya kalmalıdır. </li><li> 450 mikrolitre büyüme medya her Fide Plaka kuyuların içine koyun. Hızla büyüme medya MicroFill makine tesisat katılaşarak olmadığını çalışın. </li><li> Fide Tabaklar dolu olduğunda, hemen MicroFill makinenin şişe 65 ° C steril su ekleyin ve temizleme çevrimi sıhhi tesisat temizlemek için 12 kez çalıştırmak. Bu işlem boyunca 65 ° C banyo şişe su kalmalıdır. </li><li> Bir MicroFill makine mevcut değilse, Fide Tabaklar da el-kanallı pipet kullanarak mühürlü plakaların içine erimiş agar pipetleme tarafından hazırlanmış olabilir. </li><li> Her Fide Tabaklar t kuyu kontrol edino büyüme ortamı herhangi bir kuyu dışarı sızdırılmış olmadığından emin olun. Bireysel kuyulara El pipet ek erimiş büyüme ortamı gerektiği gibi. </li><li> Şeffaf plastik bir kapak ile her levha Kapak ve büyüme ortamı oda sıcaklığında Fide Tabaklar katılaşmasını sağlamak. Yığın plakaları ve depolama için alüminyum folyo ile sarın 4 ° C Mağaza plakaları ters depolama sırasında kuyulardan su birikmesini önlemek için. </li></ol> 2. Ice-Cap Fide Tabaklar ve çimlenmeye Fideleri içine Sow Tohumları Daha önce bir tohum yükleme cihazı (2) Fide Tabaklar Arabidopsis tohum dağıtımı için yarı otomatik bir yöntem tanımlanmıştır. Bu cihaz, tohum bazı partiler için yararlı olsa da, biz Arabidopsis tohumu farklı partiler tarafından gösterilen tohum boyutu değişkenlik Bu cihazın genel kullanımını sınırlar bulduk . Biz bu tohum dağıtımı için bir alternatif otomatik bir yöntem geliştirme sürecindeŞu anda biz Fide Tabaklar içine tohum dağıtım için en etkili strateji, aşağıda açıklandığı gibi elle, bu adımı gerçekleştirmeniz olduğunu t bulduk. <ol><li> Whatman filtre kağıdı üzerine kuru tohumları serpin. </li><li> % 95 etanol tüm tohumların etanol ile kaplıdır, böylece tohum üzerine koyun. Bu tedavi yüzeyi tohum sterilize edecektir. </li><li> Tohumları kuru hava için izin ver. </li><li> Değiştirilmiş bir tek cam Pasteur pipeti kullanarak Fide Tabaklar kuyulara bireysel tohumları aktarın. Pasteur pipet ucu yanan tarafından mühürlenir. Ortaya çıkan cam ucu tek bir tohum kolayca kaldırdı ve Fide Plaka kuyulardan agar yüzeyine transfer olmak için izin verir agar medya, hafifçe dokunarak ıslatılır. Bu tohum kaplama aracın çift başlı bir versiyonu da verimi artırmak için kullanılabilir. </li><li> Her Fide Plaka şeffaf plastik kapak ve conta ile Micropore cerrahi bant ile kaplayın. Yığılmış plakaları sarınalüminyum folyo ve mağaza Arabidopsis tohumları ile 4 ° C dört gün için tohumların çimlenme tabakalandırmak ve senkronize etmek için. Domates tohumu dört gün boyunca, 12 ° C&#39;de karanlıkta muhafaza edilmelidir. </li><li> 18 ° - 20 ° C çimlenme başlatmak için floresan ışığı altında Fide Tabaklar yerleştirin. </li></ol> 3. Ice-Cap Çeşmesi Fide Tabaklar transfer Fide Plakalar ışık altında dört gün sonra, Ice-Cap çeşme Fide Tabaklar aktarın. Arabidopsis için, fide genellikle 10 ila 14 gün Ice Cap çeşme bırakılmıştır. <ol><li> Ice-Cap Çeşmesi bir plastik saklama kutusu içine yerleştirilmiş olan özel raf yapının üstüne bir tanımlama levha koyarak birleştirin. Tesviye fındık çerez levha seviyesini ayarlamak için kullanın. Bir dalgıç pompa saklama kutusu yerleştirin ve bir yaylı cla kullanarak çerez levha yan pompa çıkış hortumu eklemekmp. Ice-Cap Çeşmesi, Ice-Cap Çeşmesi yüzey direkt floresan aydınlatma alması için bitki büyüme odası ya da büyüme odasına bir raf üzerinde birleştirin. </li><li> Ice-Cap Çeşmesi 3 parça 1 kısım musluk suyu distile su karışımı ile doldurun. Dalgıç pompa, su seviyesinin altında birkaç santimetre kadar çeşme su ilave edilmelidir. Laboratuvar bant kullanarak plastik saklama kutusu, son su seviyesi ve işaretleme kalemi işaretleyin. </li><li> Kök Tabaklar Kök Plaka her iyi bir 3/32-inch çapında paslanmaz çelik bilya ekleyerek hazırlayın. </li><li> Paslanmaz çelik bilyalar kullanılarak yapılan özel bir top dağıtma cihazı, 1 Kök Plaka eklenebilir . Bu cihaz 96-PCR plaka yüzey üzerine alüminyum folyo tek bir sayfaya yerleştirme ve folyo yüzey üzerinde her bir kuyunun merkezleri yerleri işaretlemek için bir işaretleme kalemi kullanarak yapılır. Bu işaretli levha folyo alüminyum ek bir 6 sayfa üstüne yerleştiriliril ve kullanılan pipet ucu kutusu kapağı ve pürüzsüz bir yüzeye sarılı. Böyle bir ahşap şiş gibi keskin bir aracı daha sonra 96 ​​pozisyonların her biri tek bir metal topu tutmak için yeterince büyük bir çimen oluşturmak için kullanılır. Topları ile bu dağıtım cihazı doldurmak için, aşırı metal topları cihaz üzerinden dökülür ve aşırı topları kaldırmak için hafifçe çalkalanır. Kök Plaka sonra topu Kök Plate her kuyuya bir damla devrildiğinde dağıtım cihazı, üst üzerine yerleştirilir. </li><li> Kök Plaka MicroFill makine kullanarak her bir kuyunun 340 mikrolitre 3 parça 1 kısım musluk suyu distile su karışımı ekleyin. Çelik bilyalar, su dağıtım önce Kök Plaka eklenmiş olduğunu emin olun. </li><li> Fide Tabaklar altındaki kapalı yapışkan film soyun ve plakalar şeffaf plastik kapakları kaldırmak. Kök Plaka metal bir top ve su içeren her Fide Plaka yerleştirin ve iki elastik hai ile birlikte iki tabak güvenlir bantları. </li><li> Ice-Cap Çeşmesi yığılmış Ice-Cap tabak yerleştirin. Plakalar Ice-Cap Çeşmesi zaman açık plastik kapaklar kullanılmamalıdır. Fide Plate A-01 Kök Plaka A-01 ile uyumlu olduğundan emin olmak için kontrol edin. </li><li> Fide çoğunluğu Kök Tabaklar nüfuz kök doku kadar yığılmış Fide / Kök Tabaklar Ice-Cap Çeşmesi bırakılmalıdır. Ice-Cap Çeşmesi Arabidopsis fide için ideal gelişme sıcaklığı yaklaşık. 18 ° C Çerez levha su seviyesi Fide Plate fide batık olduğunu öyle derin, öyle ki su Kök Tabaklar kuyu içine akabilir, ama olmamalıdır. Su seviyesi doğru değilse doğru derinlik farklı bir çerez levha almak gerekir. </li><li> Ice-Cap Çeşmesi, orijinal su seviyesini korumak için periyodik olarak damıtılmış su ekleyin. Çeşme saf distile su ekleyerek yerini alacakçeşme suyu mineral bileşimi değiştirmeden sıvı buharlaşması nedeniyle kaybetti. Ice-Cap Çeşmesi Su seviyesi günlük olarak kontrol edilmelidir. </li></ol> 4. Hasat Kök dokusu Kök dokusu kök Plate suyun donma ve ardından Kök Plaka uzak Fide Plaka soyma hasat edilir. <ol><li> Gün kök doku hasat öncesi, Ice-Cap Çeşmesi&#39;nden yığılmış Ice-Cap Tabaklar çıkarın. </li><li> Yığılmış Fide ve Kök plakalar kuyuları arasında üç ahşap şiş takın. Şiş amacı, dondurma işlemi için hazırlık Kök plakalar kuyulardan Fide Tabaklar hazretleri yükseltmektir. </li><li> Gece ışıkları altında durmak eklenen tahta şiş ile yığılmış Ice-Cap Tabaklar izin verin. Bu kuluçka sonraki dondurma ve plaka ayırma işlemleri kolaylaştıran Kök Tabaklar, sıvı hafif buharlaşma sağlar. </li><li> Üzerindedoku hasat gün, donmuş bir banyo hazırlayın. 96-iyi bir metal termal blok kuru buz ve% 95 etanol karışımı ile kabına yerleştirin. Termal blok ca sıcaklık dengelenmesi için izin ver. 20 dakika. Pyrex çanak yalıtım malzemesi gibi düşük sıcaklık laboratuar tezgah yüzeyine zarar vermez, böylece mitten bir otoklav gibi bazı tip üstüne yerleştirin. </li><li> 5 dakika soğutulmuş termal blok ve inkübe içine tahta şiş ile yığılmış Ice-Cap tabak yerleştirin. Kök Plate Bu süre boyunca katı su donar. Fide Plate fide, bu tedavi sırasında dondurmak ve tam canlı kalmaz. </li><li> Termal blok yığılmış Ice-Cap plakaları çıkartın ve oda sıcaklığında bench üzerine koyun. Lastikleri ve yığılmış plakalar ahşap şiş çıkarın. Fide Plaka üst plakalar &quot;crack&quot; için sıkıca bastırın. Kök Plaka ve Fide Plaka ap soyma sonra dikkatlicesanat. </li><li> Kök Tabaklar su oda sıcaklığında çözünme izin verin. Çözülme 25 termal blok ° C Kök Tabaklar kuluçka hızlandırılmış </li></ol> 5. Mağaza Fide Plate in the Dark Düşük Sıcaklık Doku hasat sonrasında fide plakaları genotip analizi yapıldığında ise fide canlılığını koruyacaktır düşük ısıda karanlıkta saklanabilir. Fide canlılığı etkileyen birkaç hafta boyunca bu sıcaklıklarda saklanabilir. <ol><li> Fide plakanın alt kısmında mühür, yapışkan bant ile doku hasat sonrasında. </li><li> Fide Plaka üstüne şeffaf plastik kapak yerleştirin ve mikropor bant ile sabitleyin. </li><li> Birlikte çeşitli Fide Tabaklar Yığın ve alüminyum folyo ile sarın. </li><li> Arabidopsis fide, 4 tabak ° C Domates fideleri için, 12 ° C&#39;de plakaları Bir kez genotipleme se, tamedlings bu düşük sıcaklık kuluçka kaldırılır ve aşağıda açıklandığı gibi toprak nakledilen olabilir. </li></ol> 6. DNA Ayırma PCR reaksiyonları için uygun DNA, kök doku örnekleri kolayca elde edilebilir. Arabidopsis kök doku örnekleri ele toplam DNA verim ca. Ortalama 2 400 ng. <ol><li> Kök Tabaklar su DNA ekstraksiyon işlemi gerçekleştirmeden önce tamamen çözülmüş olduğundan emin olun. Herhangi bir kuyu ortalamaya göre önemli ölçüde daha az su olup olmadığını belirlemek için tabak olmadığını kontrol edin. El pipet distile ilave su gerektiren kuyu içine su. </li><li> Kök Plakalar her bir kuyunun 25 mikrolitre; Tris-EDTA solüsyonu (50 mM EDTA, pH8 500 mM Tris, pH 8) eklemek için MicroFill makinesi kullanın. </li><li> Kök plakalar termal sızdırmazlık folyo ve ısı yapıştırma makinesi kullanarak kuyu Seal. </li><li> GenoGrinder makine mühürlü kök tabak yerleştirin.aşağı bakacak şekilde plakalar mühürlü sonuna. Bu plaka yönünü, en iyi boncuk hareketi sağlar ve boncuk kuyularda yapışmasını önler. Dakikada 1350 vuruş GenoGrinder plakalar 3 ½ dakika sallayın. </li><li> Mikroplak taşıyıcıları ile bir santrifüj plakaları transferi ve 3500 RPM hızında 10 dakika boyunca plakalar döndürmek 4 ° C pelet için pulverize kök doku. </li><li> Sonucunda seyreltilmiş özü doğrudan PCR reaksiyonlarında kullanılabilir genomik DNA içerir. Tipik bir PCR reaksiyonu bu DNA özü 2 mikrolitre katacak. </li><li> DNA örnekleri depolama için mikroplak mührü yapışkanlı bant ve yer eksi 20 ° C DNA örnekleri kalitesinde belirgin bir azalma ile birkaç ay boyunca saklanabilir. </li></ol> 7. Toprak için İstenilen Genotip ile Fideleri aktarın Genotip analizi tamamlandıktan sonra, istenilen genotipi ile fideler Fide transfer edilebilirToprağa Tabaklar. <ol><li> Fide Plakalar soğuk depolama çıkarın ve suya doymuş toprak karışımı ile tencere hazırlamak. </li><li> Fide Plaka ayrı bir fide çıkarmak için, bir fide zarar vermeden agar fişi kapmak için olanak sağlayan bir forseps kullanın. Forseps ile agar fişi fide zarar vermemek için dikkatli olmak Fide Plaka agar fiş alın ve yavaşça kaydırın. Alternatif olarak, basınçlı hava agar tak ve hafifçe dışarı fide iyi çekmek için kullanılabilir. Fiş bench üzerine dışarı çıkar kadar kuyunun altındaki küçük delikten basınç uygulayın. </li><li> Toprak agar fişi boyutu küçük bir delik hazırlayın. Toprak agar fiş yerleştirin ve toprak fide güvenliğini sağlamak için agar fişi etrafında nemli toprak paketi. Herhangi bir fide her yerinden agar kaldırmak için teşebbüs etmeyin. </li><li> Standart büyüme koşulları altında bir büyüme odasında nakledilen fide yerleştirin. Için plastik bir kapak ile tencerenin kapağını kapatın.İlk iki gün sonra nakli. Daha sonra kapağını kaldırın ve bitkilerin standart koşullar kullanarak büyümeye devam ediyor. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 4A, Ice-Cap sistemi kullanılarak yetiştirilen Arabidopsis fidelerinin bir örnek gösterilmiştir . Bu fide resmi alındığında, iki hafta boyunca, Ice-Cap çeşme ve doku hasat için hazır olduklarını vardı. Bu aynı fide kök doku Şekil 4B gösterilmiştir. Arabidopsis kök dokusunun bir örnek çıkarılan DNA toplam tutarı 100 ng 700 ng 2 aralığında genellikle. Bu verim hesaplama sadece bir kısmını ham kök ekstresinin kullanımına dayanmaktadır. Bu ca sadece. Ham kök ekstresi% 10 genellikle DNA ekstraksiyon işlemi için kullanılan, ham özü koruyarak, sonraki analiz için önemli ölçüde daha genomik DNA elde etmek mümkündür. Kullanılarak elde edilen genomik DNA toplam tutarı Ice-Kap prosedür PCR reaksiyonları 2 yüzlerce gerçekleştirmek için yeterli. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig1.jpg" /> Şekil 1: Ice-Cap sürecinin akış şeması. A) fide çimlenmeye agar büyüme ortamı içeren Fide Plate. Kökler agar nüfuz ve plakasının altına doğru büyüyebilir. Plaka kuyu diplerinde delikler yapışkan film ile mühürlenir. B) Fide Plaka Kök Plaka su içeren ve metal bir topu üst üste. Kökler Fide Plaka kuyu diplerinde delikleri çıkmak ve Kök Plaka kuyu içine büyümek. Yığılmış Ice kap tabak kuru buz / etanol banyo termoblok yerleştirilir önce C) Ahşap şiş gün Fide Plaka ve Kök Plate arasında eklenir. Kök Plate su donup sonra D), 96 doku örnekleri ile Kök Plaka Fide Plaka verimli, Kök Plaka soyulmuş.96 canlı fide ve Fide Plaka. Ahşap şişleri bu adımı sırasında iki tabak ayrılmasını kolaylaştırmak. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig2.jpg" /> Şekil 2: Fide Plaka ve Kök Plaka Fotoğrafları. A) Fide Plaka ve ayrı ayrı görülen Kök Plate. B) Fide Plaka Kök Plaka üstüne yığılmış. DNA ekstraksiyonu için kullanılan çelik bilya Kök Plaka kuyuları görülebilir. Elastik bantlar iki plaka birlikte güvence altına almak için kullanılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig3.jpg" /> Şekil 3: Ice-Cap Çeşmesi Ice-Cap Çeşmesi Kök Tabaklar kuyuların üstleri kesin yükseklikte sabit bir su seviyesini korumak için kullanılır. Bu sürekli sulama sistemi kök plakaların kuyulardan su buharlaşma ve terleme nedeniyle tükenmiş haline gelmemesi sağlar. A) bir ev yapılmış raf.yığılmış Ice-Cap Tabaklar oturduğu çerez levha destekler. B) çeşme yüzeyi boyunca düzgün bir su derinliği elde edilir, böylece tam çerez levha düzeyini ayarlamak için bir araç sağlar 1 &quot;fındık birinin yakın çekim görüntüsü. C) Bu resim tüm görüntüler parçalar Ice-Cap Çeşmesi D) monte Ice-Cap Çeşmesi ev yapımı raf oluşturmak için gerekli bir dalgıç fıskiye pompası sürekli ev yapımı dayanmaktadır çerez levha, alt rezervuar su hareket raf. yaylı kelepçe hortum çerez levha kenarına takmak için kullanılır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig4.jpg" /> Şekil 4: Ice-Cap süreci Arabidopsis fide kullanılarak yetiştirilir. A) Üstten görünüm bir Fide Plaka iki kuyu içine aşağı bakıyor. Her iyi bir Arabidopsis fide içerir. B) Kök Plate iki kuyu Yandan görünüm. Kökler büküm görülebileceğikuyuların iç yüzeyi etrafında. Bu resimde fide ca Ice-Cap Çeşmesi olmuştu. iki hafta ve doku hasat normal olurdu büyüme aşamasında.

<ol>
	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan Ice-Cap yöntemi, tek bir gün içinde bireysel bitkilerin bile yüzlerce ya da binlerce, doku örnekleri toplamak ve verimli bir şekilde kullanmak genotipleme reaksiyonlar için bu örnekleri genomik DNA ayıklamak için, bir bilim adamının sağlar. Bireysel bir bilim adamı, kısa bir süre içinde binlerce fide genotipi yeteneği vererek, Ice-Cap yöntemi, aksi takdirde gerçekleştirmek için pratik olmazdı bir dizi genetik deneyler kolaylaştırmak için bir potansiyele sahiptir. Bazı örnekler aşağıda verilmiştir. <ol><li> Genetik Haritalama. Güzel ölçekli genetik haritalama araştırmacı 3 kromozom boyunca belirli bir aralık içinde rekombinasyon olayları tanımlamak için ise hızlandırılmış olabilir. Bu aralığı çok kısa bir genetik mesafe gerektiriyorsa, o zaman rekombinasyon olayları ayırma haritalama nüfus nispeten nadir olacaktır. Bu nedenle, istenilen yeniden bulmak için bireysel bitkiler ekran binlerce için gerekli olabilircombinant bireyler. Bu süreç büyük ölçüde Ice-Cap kullanımı ile hızlandırılmış olabilir. Genom yeniden sıralama çağında bile, doğrudan belirli bir mutasyon bir ilgi fenotipi doğrudan sorumlu olduğunu göstermek için hala gereklidir. Bu durumlarda, aday mutasyon aslında etken olduğunu kanıtlamak amacıyla yakından bağlantılı diğer mutasyonlar uzak ilgi mutasyon ayırmak için gerekli olacaktır. Bu gibi durumlarda, Ice-Cap sıkıca bağlı mutasyonlar arasında bir çift bağ kırılması için etkili bir yöntem sağlayacaktır. </li><li> Multi-mutantlar. Arabidopsis okuyan araştırmacılar için fonksiyonel fazlalık 4-6 aşmak için tek bir bireyin içine birkaç farklı lokusların mutant allel birleştirmek için yaygın hale gelmiştir. Bir örnek olarak, bir genetik geçişi ile tek bir bitki dört farklı lokusların mutant allel birleştirmek isteyen bir durumda düşünün. Bu proje için, üretmek için gerekli olacaktırgeçiş şemasının bir parçası olarak bu dört lokusların heterozigot birey. Bu dörtlü heterozigot setleri tohum, dörtlü homozigot döl ortaya çıkan nüfus 256 kişiden birinin bir oranda mevcut olması bekleniyor. Geleneksel yöntemler ile bu nadir bir birey için Eleme oldukça emek yoğun olurdu. Karşılaştırıldığında, Ice-Cap bu proje için kullanarak, tek bir nesil nadir dörtlü homozigot belirlenmesi için etkin bir strateji ile bilim adamı sağlayacaktır. </li><li> iTILLING. Laboratuvarımız son zamanlarda yeni bir yaklaşım, genlerdeki Arabidopsis 7 faiz kaynaklı mutasyonların varlığı için tarama nitelendirdi. Bu yöntem, kimyasal bir mutajen 8-10 ile tedavi edilen bireylerin sipariş popülasyonlarda mutasyonlar bulmak için kullanılan bu toprağın işlenmesinde adında kurulmuş bir teknik bir çeşididir. Bir ind, toprağın işlenmesinde kişiselleştirilmiş bir versiyonu çünkü iTILLING yöntem adında varividual bilim adamı geleneksel olarak büyük bir araştırma ekibi tamamlamak için gerekli bir şey başarmak için. Ice-Cap, 7 iTILLING yöntemi aşağıda açıklandığı gibi ayrılmaz bir parçasıdır. </li></ol> ITILLING arkasındaki fikir, geleneksel toprağın işlenmesinde projeler için oluşturulan dayanıklı mutant nüfusunun aksine duruyor geçici bir mutant nüfusu üretmektir. ITILLING için, 50 ila 100 Buz kap bloklar halinde bir Hacimli M2 nüfus tohumları ekilen ve DNA Ice-Cap yöntemi ile elde edilir. Arabidopsis fideler daha sonra yerleştirilen 4 ° C Ice-Cap DNA mutasyon tarama kullanılarak yapılır preparatlarıyla. Domates fideleri 12 ° C&#39;de saklanır. Fide taşıyan istenilen mutasyonlar tespit edildikten sonra, Ice-Cap plakalardan kurtarıldı ve toprağa aktarılır. iTILLING ekrana, tüm bir araştırma toplum için uzun süreli bir mutant nüfus sağlamak için uygun değildir. ITILLING Bunun yerine, bir strateji sağlarBir bilim adamı, verimli ve nispeten düşük bir maliyetle, hızlı bir avuç gen mutasyonları için özel bir mutant nüfusunun ekranı yapabilirsiniz. Ice-Cap Arabidopsis, domates, pirinç büyüyen ve genotipleme için etkili bir yöntem olarak buldular. Biz diğer bitki türleri de Ice-Cap uygun olması gerektiğini bekliyoruz. Bir sınırlama Ice-Cap kalınabilmektedir çeşitli türlerin tohumlarının boyutu. 96 plaka kuyuların içine sığacak kadar küçük tohumlar Sadece bitkiler bugünkü yapılandırma Ice-Cap ile uyumlu olacak.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Öğütücü </td><td> DNA ekstraksiyonu için Kök Tabaklar sallayarak Makine </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene ABD </td><td> AB-0384 </td><td> Manuel ısı yapıştırma makinesi doku bozulmasına önce Kök Tabaklar </td></tr><tr><td> Sallanan mikroplak taşıyıcıları ile donatılmış Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Sallanan mikroplak taşıyıcıları ile herhangi bir santrifüj uygun olacaktır </td></tr><tr><td> MicroFill Mikroplaka Dispenseri </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Otomatik dolum mikropleytin sıvı dağıtıcı </td></tr><tr><td> BIALETTI marka17x11 inç Ticari Büyük Cookie Sheet </td><td> Hedef Department Store </td><td> www.bialetti.com </td><td> Bu özel çerez levha, Ice-Cap için ideal bir derinliğe sahiptir. </td></tr><tr><td> Özel Metal Raf </td><td> Donanım Mağaza </td><td></td><td> Tam bir açıklama için metne bakınız </td></tr><tr><td> 33 Litre plastik saklama kutusu </td><td> Hedef Department Store </td><td> Sterilite Marka </td><td> Ice-Cap Fountain. Plastik saklama kutusu 17x11 inç çerez levha içine alabilecek kadar büyük </td></tr><tr><td> Saat Çeşmesi Pompa başına 30 galon </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Küçük bahçe gereçleri satan mağazalarda bulunan dalgıç fıskiye pompası </td></tr><tr><td> Fıskiye pompası için hortum </td><td> Herhangi bir laboratuvar tedarik şirketi </td><td></td><td> Fıskiye pompası ile uyumlu Hortum </td></tr><tr><td> Plastik Kelepçe </td><td> Donanım Mağaza </td><td></td><td> Çerez için hortum tutun Kelepçelevha </td></tr><tr><td> Falcon Microtest düz dipli 96-iyi polistren levhalar şeffaf plastik kapakları </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Ice-Cap Fide Tabaklar kapsayan için şeffaf plastik kapakları </td></tr><tr><td> 3M cerrahi bant Micropore </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch çapında paslanmaz çelik bilyalar </td><td> Hartford Teknolojileri, Rocky Hill, CT </td><td> 034-006-1K </td><td> Hasat sonrası kök doku bozmak için kullanılır. </td></tr><tr><td> 3 inç elastik saç bantları </td><td> Yerel bakkal </td><td></td><td> Fide Kök Plaka Plaka güvenliğini sağlamak için kullanılan </td></tr><tr><td> 4 mm çaplı tahta şiş </td><td> Yerel bakkal </td><td></td><td> Bu şiş kebapları hazırlamak için genellikle kullanılır </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marka, frit olmadan 1 ml filtre plakaları </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> Alt delik 96-iyi Fide Tabaklar. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Tall-Baca PCR Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-iyi Kök Tabaklar </td></tr><tr><td> Ağar - hücre kültürü test </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic asit (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige ve Skoog (MS), bazal tuz karışımı </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Kolay Peel ısı folyo sızdırmazlık </td><td> ABgene ABD </td><td> AB-0745 </td><td> Kök Plakalar doku bozulması için önce sızdırmazlık için ısı sızdırmazlık filmi </td></tr><tr><td> Duck Marka Ekstra Geniş Ambalaj Teyp, 3.00 &quot;x 54,6 yd </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Hiçbir madde. 21242139 </td><td> Yapışkan bantdepolama için DNA ekstreleri içeren sızdırmazlık mikropleytin </td></tr><tr><td> Sızdırmazlık Rulo </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> El mikropleytin üzerine yapışkan sızdırmazlık bantı basarak yuvarlanan aracı düzenlenen </td></tr><tr><td> 96-metal termal blok </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Kök Plakalar doku hasat için dondurmak için kullanılır. </td></tr><tr><td> Whatman Filtre kağıdı </td><td> Whatman Uluslararası </td><td> 1002 090 </td><td> Yüzey sterilizasyon tohumları kullanılır </td></tr><tr><td> Tek kullanımlık Pasteur Pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;tek Pasteur pipeti Fide Plaka tohum transferi için kullanılan </td></tr><tr><td> Pyrex pişirme çanak (20 cm x 30 cm) </td><td> Hedef Department Store </td><td></td><td> Kuru buz / etanol banyosu oluşturmak için kullanılır. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

Bu bitkilerin çok sayıda genotipleme gerektiren projeler geliştirmek için bitki bilim adamları için yaygın hale gelmektedir. Herhangi bir genotipleme projesinde ilk adım, her bir bitkinin bir doku örneği toplamak için. Bu görevi geleneksel yaklaşım örnek bitkiler için bir-at-a-zaman. Ancak, bir dilek bireylerin genotip yüzlerce ya da binlerce genotipleme boru hattının önemli bir darboğaz bu strateji sonuç kullanıyorsanız. Biz burada açıklamak Ice-Cap yöntemi, bir bilim adamı, tek bir günde 1,2 birkaç bin fide doku toplamak için izin vererek bu zorluğu yüksek verimli bir çözüm sağlar. Bu verim düzeyi, doku, bitki yerine bir-at-a-çok 96-at-a-zaman hasat olduğu gerçeği ile mümkün hale gelmiştir. Ice-Cap yöntem fide büyüme, doku hasat ve DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için entegre bir platform sağlar. Ice-Cap temelinde seedli büyüme96-kuyucuğu yığılmış çifti NGS. Üst plaka kuyu bireysel fide çimlenmeye agar büyüme medya fişleri içerir. Agar medya aracılığıyla üst plaka, bir delikten çıkmak ve daha düşük bir plaka içeren su geçer kökleri aşağı doğru büyür. Üst plaka fide oda sıcaklığında devam ederken, DNA ekstraksiyon, kök doku içeren alt tablası su doku hasat için hızla dondurulur. Üst plaka, 96 kök doku örneklerinde buz ve 96 canlı fideler ile bir tabak içinde donmuş bir tabak verimli alt tabak soyulmuş. Bu teknik, kök doku yakalamak için buz kullandığı için &quot;Ice-Cap&quot; olarak adlandırılmıştır. Fide içeren 96 plaka daha sonra folyo ile sarılmış ve düşük sıcaklık transfer. Bu işlem fideler daha fazla büyüme askıya ama onların canlılığı etkilemez. Genotip analizi tamamlandıktan sonra, istenilen genotipi ile fideler 96-iyi p transfer edilebilirdaha fazla yayılması için toprağa geç. Biz, Arabidopsis thaliana, domates, pirinç ve fide kullanarak Ice-Cap yöntemi yararını göstermiştir . Biz yöntem 96-kuyucuğu kuyu içine sığacak kadar küçük tohumlar bitkilerin diğer türler için de geçerli olması gerektiğini bekliyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping | Biology | Video

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap yöntemi bir 96-kuyucuğu ve her fide olmayan yıkıcı hasat kök doku bitkilerin büyümesine izin verir. Bu kök dokusu elde edilen DNA genotipleme reaksiyonlar için kullanılabilir. Ice-Cap iyi çalıştığını bulduk<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Domates, pirinç fideleri.

Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis</emYüksek Verim Genotiplendirme için 96-iyi Tabaklar ve Domates Tesisleri>

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

ice-cap-method-for-growing-arabidopsis-tomato-plants-96-well-plates

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

22.7K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. Ice-Cap yöntemi bir 96-kuyucuğu ve her fide olmayan yıkıcı hasat kök doku bitkilerin büyümesine izin verir. Bu kök dokusu elde edilen DNA genotipleme reaksiyonlar için kullanılabilir. Ice-Cap iyi çalıştığını bulduk Arabidopsis thaliana, Domates, pirinç fideleri.

Video: Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biyoloji

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca<sup&gt; 2+</supArabidopsis Bitkilerde&gt; Sinyalleri

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...