Bu çalışma AMD bir NIH / NHGRI Genom Scholar / Fakültesi Geçiş Ödülü (K22 HG002908) ve Sistem Biyolojisi Enstitüsü ve Lüksemburg Üniversitesi arasında bir stratejik ortaklık tarafından desteklenmiştir. Suşları veya plazmidlerden talepleri Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com) yöneltilmelidir.

1.. Gerilme İnşaat ve Karakterizasyonu <ol><li> Haploid suşları çiftleşme ve diploid 2 seçerek veya doğal olarak oluşan bir heterozigot suşu kullanılarak çapraz kullanılacak heterozigot diploid soy oluşturun. Suşları GFP liman olmamalı. </li><li> Gerginlik YPD 2 + 200 ug / ml G418 üzerinde büyümek mümkün olduğunu onaylayın. </li><li> Gerilme sporlanmalanna mümkün olduğunu onaylayın. İYİ düşük sporulasyon verimlilik haçlar ile uyumlu, ancak düşük frekanslı sporulasyon artar FACS sıralama süre gereklidir. <ol><li> 5 ml YPD suşun bir O / N kültür ayarlamak ve 30 ° C&#39;de çalkalama ile büyür </li><li> PBS (pH 7.4) ile O / N kültürünün 0.5 ml üç kez yıkayın. </li><li> Yıkanan hücreler Pelet, 2 mi sporlaşma ortamının 7&#39;de süpernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığında hücreleri kışkırtmak ve 40X objektif ile bir faz kontrast ışık mikroskobu kullanılarak tetdar oluşumu için günlük kontrol edin. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Tetratların az sayıda (~ 20) geleneksel diseksiyonu 2,3 ile haç spor canlılığı tahmin. Farklı arka planlar arasında gerginlik melezlerde spor canlılığı yaygın ve beklenmeyen değişir. Ancak, spor canlılığı önsel beklentileri önceki suşları tasarrufu ve genotiplenmesi emek ve maliyet-yoğun adımlara BEST deney etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenle, bu adım son derece tavsiye edilir. </li></ol> Barkodlu Plazmitlerin Kütüphanesi ile diploidlerin 2. Dönüşüm <ol><li> Aşağıdaki modifikasyonlarla Gietz ve Woods 8 içerisinde tarif edilen transformasyon protokolü kullanılarak heterozigot diploid soy içine pCL2_BC Barkodlanan plazmid yerleştirin. <ol><li> Hücreler, 20 dakika boyunca 30 ° C de dönüşüm karışımı ile inkübe edildikten sonra, transformasyon karışımı hacminin% 8 DMSO ilave edin. DMSO ilavesi dönüşüm etkinliği i geliştirmek için bulunmuşturn Biraz gerginlik arka 9. </li><li> Isı şoku aşamasından sonra, kısa bir santrifüj ile pelet hücreleri dönüşüm karışımı süzün ve YPD yavaşça hücreleri yıkayın. Daha sonra, 1 ml YPD hücreleri tekrar süspansiyon ve onları çalkalama olmaksızın, 3 saat boyunca oda sıcaklığında kurtarmak için izin verir. </li></ol></li><li> Agar plakaları YPD + G418 (200 ug / ml) üzerine kaplama ile transformantların seçin. Plasmid barkodlar karmaşık bir havuz sağlamak için, koloni çok sayıda plaka başına ~ 2500 koloni ile örneğin 5 plakaları hasat. </li><li> Koloniler (30 ° C&#39;de 2-3 gün büyüme) görebilir sonra, dikkatli bir şekilde, sıvı YPD + G418 (200 ug / ml) +% 15 gliserol içine plaka onları kazınarak transformantların havuz. Vortex Bu hücre süspansiyonu, bir kriyokoruma şişeye aktarın ve C. her plaka için ayrı bir donmuş stok sağlayın -80 ° C&#39;de dondurun. Bu dondurulmuş stokları Aşama 3.1 için başlangıç ​​suşlar olarak görev yapar ve ayrıca arzu edildiği takdirde, daha sonraki bir tarihte fazla iki baştan oluşturmak için de kullanılabilir. </li&gt; </ol> 3.. Barkodlu tetradların Edinme Dönüştürülmüş Hücreleri Kütüphanesi sporlanan <ol><li> Çalkalama ile 30 ° C&#39;de 5 ml YPD + G418 (200 ug / ml) içerisinde O / N büyüme 2.3 oluşturulan donmuş stoktan hücreleri canlandırmak. </li><li> O, hücreleri yıkanır / N kültürler PBS (pH 7.4) içinde 3 kat ve sporlaşma ortamının 7 artı 200 ug / ml G418 içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında sporulasyon kültürleri kışkırtmak ve yeni tetradların oluşturan durduruldu kadar günlük sporulasyon ilerlemeyi izlemek. </li><li> Kültür iyi biçimli iki baştan ve nispeten daha az dyads içerir sonra, ajitasyon kültürleri kaldırma ve en az 7 gün boyunca oda sıcaklığında bırakın. Bazı haçlar (7.3 &#39;de açıklandığı gibi değerlendirilen) kısa sürede tetradların oluşmuş gibi plaka sindirim ve bozulma üzerinde mükellef olsa da, ilave inkübasyon (bizim deneylerde 7-10 gün), diğer haç için gereklidir. Bu nedenle, bu adım son derece tavsiye edilir. </li></ol> 4. KurmakTetrad Sıralama için FACS kapıları Meiotically pCL2_BC plazmid üzerinde SPS2-GFP füzyon sporülasyon kültüründe iki baştan tespit edilir ve floresan ile kültürden izole edilmesini sağlar ifade edilmiştir. Aşağıdaki protokol, bir FACSAria II için geliştirilmiştir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Dört ardışık kapılarının Şekil 2.. FACS kapılar. Bir dizi iki baştan izole etmek için kullanılır. (A) gösterilen kapıları ve (B) kümeleri sayısını azaltmaya yardımcı olur. Floresan olaylar (C) &#39;de kapı ile seçilir. (D) &#39;de histogram iki tepe vardır. Sol zirve olaylar öncelikle tetradların (sol inset görüntü), ve sağ altta olaylar genellikle bağlı bir tomurcuk (sağ inset görüntü) ile tetradların vardır. Son bir kapısıçoğunlukla tetradların (kırmızı bar) olan olayları seçmek için bu histogramına uygulanır. Bu rakam ark 1, Ludlow modifiye edilmiştir. <ol><li> FACS sıralayıcı üzerine sporlu kültürünü yükleyin ve enkaz, clumped hücreleri ve damlacık başına birden hücreleri hariç iki ileri dağılım ve yan dağılım kapıları kurmak (Şekil 2A ve 2B). </li><li> SPS2-GFP raportör yapıyı kullanırken dyads ve tetradların 10 dahil floresan hücreler, bir nüfus var olmalıdır. Kapısı bu floresan olayları (Şekil 2C) dahil FSC vs GFP. </li><li> Soy arka bağlı olarak, iki baştan ve diğer hücreler bulunmaktadır kümeleri kaldırmak için ilave bir kapısı dahil etmek için gerekli olabilir. Bu gerekli ise, floresan olayların FSC histogramı incelemek ve alt FSC (Şekil 2B, kapı olaylar kırmızı olan) ile olayları içeren bir kapı belirtin. </li><li> T verimliliğini kontrol edin<html> o bir mikroskop lamı üzerine ~ 1500 tetradların sıralama ve 400X büyütmede faz kontrast mikroskop kullanılarak olmayan tetratların için tetratların oranını sayarak rejimini yolluk. Tetratların yüzdesi doğru sadece ~ 200 sıralanmış olayları sayarak tahmin, ama ~ 1.500 süreyi azaltır sıralama mikroskop lamı üzerine hücreler arıyor geçirmiş olabilir. Seçenek olarak ise, non-tetratların için tetratların oranının Aşama 4.5 sırasında değerlendirilebilir. </li><li> Periyodik sıralayıcı doğru bir mikroskop lamı üzerine 25 tetradların sıralama ve 400X büyütmede faz kontrast mikroskop kullanarak damlacık bulunan hücreleri inceleyerek olayların raporlama numarası olup olmadığını kontrol edin. Damlacık 25 iki baştan olmalıdır. FACS aletin varyansını değerlendirmek için 3-4x tekrarlayın. </li></ol> Bir Agar Plate üstüne 5. Sıralama tetradların p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; FACS sıralayıcı agar levhasının Şekil 3.. Yerleştirme. Standart (dairesel) agar plakası, standart bir (100 mm dikdörtgen) ortasına yerleştirilen askiyle sonuçlanır ki, küçük bir çözelti damla içine iki baştan sıralamak için 96 oyuklu plaka ilk hücre sıralayıcı sahnede yerleştirilir ve sıralayıcı (bu durumda D5 olarak) belirli bir kuyuya tetradların yatırmak için programlanmıştır. Daha sonra, dairesel agar plakası 96 oyuklu plaka üzerine yerleştirilir ve askiyle sonuçlanır ki içinde damla belirtilen aşkın ortalanacak şekilde hizalanır. <ol><li> FACS sıralayıcı yakınında konumlanmış bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde en az 1.5 saat için YPD + G418 (200 ug / ml) plakaları istenilen sayıda ısıtın. </li><li> Sıralama protokolü önemli bir özelliği doğru FACS askiyle sonuçlanır ki çözümün bir yüzme havuzu içeren bir agar plaka üzerinde belirli bir yere tetradların kriteri hedef yeteneğidir. T Bunu yapmak için, bir &quot;dönüm noktası&quot; koyun 96-plakao sıralayıcının hücre birikimi birimi (ACDU) otomatik. 96-iyi bir formatta bir kuyuya 25 tetradların sıralamak bir tür düzen hazırlayın. Seç de plakanın ortasına yakın, örneğin iyi D5. Şekil 3, bir hücre sıralayıcı üzerine yüklendi bir kap ve 96-çukurlu bir levhayı gösterir. Plaka başına 25 tetradların Sınıflandırma iyi ayrılmış koloniler verir. </li><li> Sıralayıcı için 37 ° C inkübatör 10 agar plakaları istifini getirin. </li><li> Plakasının merkezine yakın agara askiyle sonuçlanır ki bu çözeltisinin bir agar plakası ve pipet 25 ul (0.7 M sorbitol içinde 1 mg / ml) al. Sonra, Adım 5.2, örneğin iyi D5 iyi hedef üzerinde askiyle sonuçlanır ki damlacık hizalama, dönüm noktası 96-plaka üzerinde plaka koyun. </li><li> Çeşit başlangıç ​​ve agar plaka üzerinde askiyle sonuçlanır ki damlanın ortasına 25 tetradların yatırmak. Sonra çıkarın ve kapak plakası. </li><li> Tekrar 5.4 Adımları 5.5 25 kadar tetradların yığını her tabakta askiyle sonuçlanır ki damlacıklar halinde tasnif edilmiştir. </li&gt; <li> 37 ° C inkübatör tetrad içeren plakaların geri koyun. </li><li> Tüm plakalar tetradların bulana kadar 5,7 ile 5,3 Adımları tekrarlayın. </li></ol> 6.. Ayırma Sporlar <ol><li> 1.5 saat boyunca 37 ° C &#39;de dörtlü ihtiva eden agar plakaları her bir yığın inkübe edin. </li><li> , Inkübatörden plakaları çıkarın plaka başına 15-25 steril 3 mm cam boncuk ekleyin ve 3-5 dakika için bir yığın (ya da 5 plakaları iki istif gibi) halinde plakalar çalkalanır. En iyi spor ayırma arka ya da ön yan yana katı plakaları hareket ile elde edilir. Bu tür plakanın dış kenarında boncuk &quot;girdap&quot; bu plakaları hareket etmeyin. Bittiğinde plakalar üzerinde boncuk bırakın. </li><li> Boncuk 30 ° C inkübatör kadar yüz plakalarının yığını yerleştirin. 37 ° C inkübatör sonraki yığın plakaları almak ve Adım 6.2 tekrarlayın. </li><li> 30 ° C&#39;de plakalar O / N inkübe </li></ol> 7. Hasat Kolonileri <ol><li> Sonra30 ° C&#39;de, bir O / N inkübasyon, küçük koloniler plakalar üzerinde oluşturulmuş olmalıdır. Dikkatle cam boncuk bozmadan inkübatör plakaları kaldırmak. </li><li> Dikkatle tarafından cam boncuk çıkarın ve hızlı bir şekilde derin kabın üzerinde plakaları tersini. Konteyner onları yukarı sıçrama ve agar plaka vurmak için izin vermeden boncuk yakalamak için yeterince derin olmalı. Bu ters çevrilir ise plakanın alt dokunulduğunda plakasına sıkışmış boncuk çıkarmak yardımcı olabilir. Bu boncuklar, iyonu giderilmiş su ile durulama ve otoklavlama ile sterilize, sabun ile iyice yıkanarak yeniden kullanılabilir. </li><li> Her plaka üzerinde kolonilerin sayısını ve spor ayırma ve geri kazanım verimini tahmin etmek kolonilerin numarasını kullanabilirsiniz. Örneğin, yakın% 100 canlılığı ile bir haç için plaka başına 25 tetradların plaka başına 100 koloni toplam verim verebilecek. </li><li> Her Colo yeterli kolonilerin sayıları (yüksek-canlılığı haçlar için&gt; 65), transfer hücreleri ile plakalardan+ G418 YPD sıvı ihtiva eden 96 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyunun içine ny. Ayrıca, kuyular aynı agar plaka koloniler içerdiğini not edin; Bu bilgi tetrad atama programına yardımcı olmak için kullanılır. </li><li> Genotipleme için ve donmuş gliserol stokları olarak suşları kaydetmek için tohum kültürleri 96 oyuklu sıvı plakaları kullanın. RAD-tag dizileme ve dizi analizi Detayları Ludlow ark 1 bulunabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Karmaşık özellik eşleme 11 DNA rekombinasyonu 12 altında yatan mekanizmaların çalışmaya kadar genetik araştırma birçok alanda, döl son derece büyük sayıda ve DNA dizilimi yüksek hacim gerektirir. Yüksek verimli DNA sekanslama kapasiteli konvansiyonel yaklaşımlar gücünü evlenmek teknikler daha önce, tedaviye dirençli olan çalışma sağlamak için potansiyele sahiptir. Çeşitli yüksek verimli maya genetik yöntemler özel sorunları etkin bir şekilde tatbik edilmiş olmasına rağmen, geleneksel her tetrad çözümlemesiyle geniş uygulanabilirliği yetersiz kalmaktadır sınırlamaları vardır. Tetrad diseksiyonu birleştirerek yüksek verimlilik yaklaşımı istihdam ve maya haçlar soyunu genotiplenmesi ile İYİ adresleri bu zorlukları. Mültipleksli RAD-tag sıralama ile bağlantılı olarak, İYİ benzersiz tetdar barkod vasıtasıyla tetdar ilişkilerini koruyarak her döl suşu için genotip bilgi toplamaktadır için ucuz bir yol sunar.0; Tüm şu anda yüksek verim yöntemler kullanılır, EN İYİ en yakın bir elle disseke maya haç tarafından sağlanan bilgiler tartışıldı. İYİ iki önemli özelliklere sahiptir. İlk hızla (Protokol 5-6 adımlar) uzaklıkta kültür içinde unsporulated hücrelerden izole etmek için iki baştan FACS kullanılmasıdır. Floresan olaylar (tetradların) binlerce izole yeteneği İYİ throughput en büyük kazanç sağlar. Bu otomasyon sayesinde görsel nadir olayları tanımlamak için gereken artan zaman, düşük sporulasyon verimlilik ile haç için manuel diseksiyon üzerinde daha büyük bir avantaj sağlamaktadır. İkinci önemli özelliği bir tetrat her kardeş sporun iletilir son derece karmaşık bir moleküler barkod (Protokol Adım 2) kullanılmasıdır. Bu barkod rasgele Elle, düzenli bir ızgara dizisi hücrelerin hafifletilen için, bir agar plaka üzerinde dağıtılmıştır sporlar arasındaki ilişkileri tetrad yeniden hesaplama için kullanılabilir çünkü. Son olarak,moleküler barkod ve sporlaşma spesifik GFP raportör geni fiziksel olarak (aynı plazmid üzerinde) bağlı olduğu için, moleküler barkod muhafaza yalnızca iki baştan FACS sıralama seçilir. Kültürler sporlaşma ortamının inkübe edilmelidir süreyi yöneten iki önemli nokta vardır. Sporulasyon özel raportör (SPS2-GFP) erken mayoz ifade edilir, çünkü ilk, tek başına GFP mayoz (yani dyads) tamamlamamış hücrelerin tam 4-spor tetradların ayırt etmez. Ek FACS yolluk floresan, eksik tetratların sayısını azaltmak olsa da, bu istenmeyen olayları azaltmak için en kolay yolu sadece sporulasyon kültürünü izleme (3.3 Adım) ve bir kez yeni tetradların oluşturan durdurdu ilerlemektedir. Deneylerde, kriteri dyads sıklığı% 1&#39;den daha az olan. İkincisi, ajitasyon olmadan oda sıcaklığında sporulasyon ortamda harcanan bazı haçlar ek süre SIG (Adım 3.4)istatistiksel olarak anlamlı oranda Aslında bu adım, bazı haçlar bozulması için kesinlikle gerekli olan kaplama sırasında cam boncuk tetratların ayrılması ((Protokol Adım 6). geliştirir. Tüm yüksek verimli metotlar gibi, İYİ gelen geleneksel yaklaşımından daha &quot;gürültülü&quot; dir. Geleneksel tetrad diseksiyonu karşılaştırıldığında BEST verimliliğinde mütevazı azalma çeşitli faktörlerin kombinasyonları sonucu olabilir. Bir faktör, işlemin mekanik gerilimlere karşı spor ölüm ya da artmış yayılma esnasında cam tanelerine yapışma neden olabilir ki, aksi halde uygun sporların artan kaybıdır. İkinci faktör mayoz sırasında basit plazmid kaybı olabilir. Üçüncü faktör karışık genotipleri ile kolonilerden kaynaklanan kullanılabilir sömürgelerinde etkili bir azalma olabilir, bizim pilot kolonilerin yaklaşık ~ 5% 1 geçer. Bu koloniler kardeş spor ayrılık başarısızlıklarını temsil olasıdır. Çünkü hızlı fluorçeşitli teda sıralama ve spor ayırma tetratların muazzam numaraları koleksiyon izin, İYİ de bu ölçekte verimlilik düşüşler aşmak için donatılmıştır. BEST gelecek tekrarlamalar manuel diseksiyon yaklaşan verimliliği artırmak olsa da, DNA dizileme kapasite mevcut üstel yörünge hızla kullanılabilir gerginlik kaybı bu düzeyde telafi edeceğini belki daha olasıdır. Ne olursa olsun, İYİ uygulanabilir için ölçekte tetdar analizini gerçekleştirmek için yeteneği şu anda manuel yöntemlerle olanaksız olan çalışmaları sağlayacaktır.

Yaygın tetrad analizi olarak bilinen Mayotik gen haritalama, maya genetik merkezidir. Kısaca, her biri, her kromozomun tek bir kopyasını içeren iki haploid suşları, her kromozomdan iki kopya, her ebeveynden biri ile bir heterozigot diploid gerginlik oluşturmak için evlendirilen. Azot için diploid hücreler açlıktan kromozomlar, yinelenen yeniden düzenlenmesini geçmesi ve her ebeveyn alellerin yeni kombinasyonları ile dört haploit hücreleri (sporlar veya ayırımlarındaki) bölün (sporulasyon) hangi mayoz neden olur. Tek bir mayoz kaynaklanan dört sporlar tetrad adı verilen bir manuel işlemle izole edilebilir. 1937 yılında 4 orijinal yayınlanmasından bu yana nispeten daha az değişti Konvansiyonel tetdar diseksiyonu 2,3, üç hedefi vardır. İlk olarak, mayoz (tetradların) geçirmiş hücreleri vejetatif hücrelerin bir arka plan uzak izole edilmelidir. Geleneksel analizde, bu kullanarak, kim bir araştırmacı tarafından gerçekleştirilirBir mikroskop, görsel olarak bir agar plaka üzerinde iki baştan tanımlar ve bir mikromanipülatör cihaz görsel bir agar plaka üzerinde iki baştan belirlenmesi ve plaka bir hücre içermeyen alanı üzerine tetrad taşımak için bir mikro manipülatörün kullanılması kullanmaktadır. Daha sonra, Tetrad dört sporlar fiziksel interspore çiftleşme önlemek için ayrılmalıdır. Bir tetrad içindeki sporları bir TSKB&#39;lerin, orijinal diploid hücrenin hücre duvarının kalıntısı ve interspore köprü 5, bir dizi her ikisi tarafından bir arada tutulur. Geleneksel tetrad analizde ascus enzimatik sindirimi ile çıkarıldı ve bir araştırmacı interspore köprüleri kırmak ve sporlar ayrı takılmak mikromanipülatör kullanır. Son olarak, bireysel sporlar sporlar arasındaki ilişkiyi korur bir ızgarah model halinde dizilirler, dört bir satırda, yani tüm döl aynı orijinal tetrat kardeş sporlar. Deneyimli bir maya araştırmacı 10 tetradların (genel kabul görmüş en az sayıda diseksiyon işlemini tamamlayabilirsinizYaklaşık 15 dakika içinde) haç başına. Biz 1 (BEST) T etrads arasında nabled S equencing B ARCODE E dediğimiz yeni bir yüksek verimli tetdar genotiplendirme yöntemi geliştirdik. İYİ izole döl çok sayıda, genotip, ve dört öz değişmesine ait ürünlerin kardeş spor ilişkileri geri olanak sağlayan bir şekilde, bireysel olarak muhafaza oluşumunu ve genotipleme sağlayarak yüksek verimli genetik mevcut yöntemler genişletmektedir. Bu üç temel strateji (Şekil 1) kullanılarak gerçekleştirilir. Üretim GFP ile mayoz geçirmiş hücreler etiketler ve onları (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre ile izole edilebilir sağlayan bir raportör konstruktunun giriştir. İkinci bir tetdar dört sporları iletilir ve rekombinant Progen bir DNA dizilemesi ile okunabilir bir biçimde son derece karmaşık bir DNA barkod eklenmesi (15 rasgele bir nükleotid string) olduğuBöylece y ve aynı tetrat ikinci kardeş sporlar tanımlar. Üçüncü genotiplendirme adımdır, ve en iyi yakalayan genomik işaretleri bir dizi yanı sıra tetdar özel barkod hem de çok sayıda genotiplendirme platformları ile uyumludur. Biz, böylece tutarlı, 2-3 döl soylarının genomunun% yanı sıra yakalama, bir kısıtlama alanı ile ilişkili etiket DNA dizilemesi (RAD-seq) belirli bir kısıtlama bölge 1 için genom sekanslama yönlendirir 6 yöntemi kullanan plazmid kaynaklı barkod . Çapraz deneysel olarak türetilmiş genotipleme verileri ile birlikte tetrad ilişkilerinin geri düşük sıra kapsamı ile belirteçlerin durumu ve inviable (ve dolayısıyla kurtarılamaz) bireylerin dahil olmak üzere, komple genotip eksik bilgilerin doğru bir çıkarım sağlar. Burada, öz değişmesine ait eşleme için en yaygın olarak kullanılan mikroorganizma, maya S. yöntemin uygulanmasını tarif cerevisiae. Bununla birlikte, organizma özgü rea küçük ikameleri ileGent, GFP ile kaynaşmış, örneğin farklı sporlaşma-spesifik proteinler, yöntem, öz değişmesine ait eşleme yoğun ya da şu anda çok daha dirençli iş olduğu organizmalar dahil olmak üzere diğer mikroorganizmalar, kolaylıkla devredilecek olmalıdır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Şekil 1. Iyi yöntem. (A) plazmid pCL2_BC bir sporülasyon özel GFP füzyon, G418&#39;e karşı direnç ve bir 15-mer rastlantısal barkod ile 2 mikron plazmiddir. Plazmid kütüphane yapımı Ludlow et al 1 &#39;de tarif edilmektedir. (B) Barkodlanan plasmidin bir havuz bir çapraz diploid soy dönüştürülmüştür. (C) Transformantlar daha sonra seçime yetiştirilir ve ~ 10000 dönüştürülmüş koloniler bir araya toplanmış ve sporule edilir. Mayoz bölünme sırasında tetrat her spor bir co devralırBarkodlanan plazmid py. (D) iki baştan FACS ile unsporulated hücrelerinden ayrılan ve sindirildi ve her spor bir koloni oluşturmak için izin bozulmuş agar plakaları üzerinde toplanır. (E) koloniler daha sonra, 96-gözlü levhalar içine toplanmıştır fenotiplenebilmektedir ve genotipleme edilir. Genotiplenmesi sırasında plasmid barkod okumak ve her tetrat dört üyelerini tespit etmek için kullanılır. Bu rakam Ludlow ark 1 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

Tetrad analiz maya genetiği için değerli bir araçtır, ancak sürecin zahmetli manuel doğa büyük ölçeklerde başvurusunu engellemiştir. Barkod tetradların sekanslanması (BEST) 1, izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri Etkin. İYİ doğrudan ascus enzimatik olarak sindirilir ve sporlar bozulur ve rastgele cam boncuk dizilmiş kaplama ile agar plakalar üzerine tetratların floresan-aktive edilmiş hücre sıralama izin veren bir sporülasyon özel GFP füzyon proteini sayesinde iki baştan izole eder. Sporlar genotiplemesi sırasında okunan moleküler barkod kullanarak, aynı tetrat kökenli yani bilgi hangi haploid kolonileri sonra, kardeş spor ilişkiler atanır. Manuel diseksiyon darboğaz kaldırarak, tetratların yüzlerce veya hatta binlerce dakika içinde izole edilebilir. Burada maya İYİ gerçekleştirmek için gerekli deneysel prosedürleri ayrıntılı bir açıklama sunmakSaccharomyces cerevisiae, haploid öz değişmesine ait soyundan türetilen koloni izolasyonu ile bir heterozigot diploid suşu ile başlayarak.

İYİ ölçüde tetratların gelen sporlar izole edilebilir hızını artırabilir. Bu yöntem teslim throughput bir örnek olarak, bir araştırmacı, 3 saat içinde 149 1 agar plakaları ile sıralama FACS ve spor ayırma (Aşama 5.1 ile 6.3) gerçekleştirilir. Bir eşdeğer verimi (yaklaşık 3.725 tetradların) manuel diseksiyon fazla 90 saat gerektirir. Ancak, pek çok yüksek üretim yöntemleri ile birlikte, yöntemin mevcut yineleme manuel diseksiyon kıyasla verimliliği bir zararı bulunmaktadır. Kolonilerin sayısı azalır manuel diseksiyon (Adım 1.4) tarafından belirlenen haç spor canlılığı, göre hesaplanan beklenti ile karşılaştırıldığında kurtarıldı olarak bu kayıp tezahür eder. Spor kaybının (Tartışma) nedenleri rastgele sporlar etkiler varsayılarak, tahmin geri koloniler, 1, 2, 3 ya da 4 sporlar geri edildiği tetratların üyesi olan (Şekil 4) ne kadar çok yapılabilir. Tetrad düzeyde başarıyla (koloniler) sporlar kurtarmak için. Başarısızlık de yöntemde verim Şekil 4. Simülasyon Binom dağılımı kullanıldı vs spor inviability, cam boncuk spor yapışma, birbirinden sporlar ayırmak için yetmezliğine bağlı olabilir başarılı bir şekilde geri kazanılmış tüm sporların oranına göre 4, 3, 2 veya 1 koloni üreten (en az bir başarılı bir şekilde geri sporlu) tetratların beklenen oranını hesaplamak üzere. Ya da 4 - - spor tetradların Bu grafik sonuçta 3 içine monte edilecek suşların sayısında kaba bir rehber olarak hizmet edebilir. Plaka artar başına kolonilerin sayısı arttıkça, kazanılan tam tetratların sayısı yapar. Deney yukarıda açıklanan,% 100 spor canlılığı yakın olan bir haç 25 tetradların (det olarak) manuel diseksiyon ermined 1 149 agar plakaları üzerine plakalanmıştır. Bu deneyde, plaka başına gözlenen koloni sayısı 20 sporlar ayrı koloniler oluşturmak için başarısız olduğunu gösteren, 80 oldu. Plaka başına kolonilerin ortalama sayısı 65 ya da daha çok koloni ihtiva eden plakalar 61 hasat edilmiştir ve dizilenmiştir 62. Koloniler oldu. Ya da 4 - - sıralama kalite kontrol geçti 3.700 suşların,% 72 hesaplama 3 ayrıldı olabilir spor tetradların.

Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Tetradların Barkod Etkin Sıralama (BEST), izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri değiştirir. İYİ, agar plakaları üzerine sıralama floresan-aktive edilmiş hücre tarafından iki baştan izole cam boncuklar ile çalkalama ile sporlar ayırır ve rasgele dizilmiş koloniler moleküler barkod ile aynı orijinal tetrat türetildi belirler.

İYİ: tetradların Barkod Etkin Sıralama

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

best-barcode-enabled-sequencing-of-tetrads

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Görüntüleme.  Pacific Northwest Diabetes Research Institute.  Tetradların Barkod Etkin Sıralama (BEST), izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri değiştirir. İYİ, agar plakaları üzerine sıralama floresan-aktive edilmiş hücre tarafından iki baştan izole cam boncuklar ile çalkalama ile sporlar ayırır ve rasgele dizilmiş koloniler moleküler barkod ile aynı orijinal tetrat türetildi belirler. 

Video: BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biyoloji

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

İYİ: tetradların Barkod Etkin Sıralama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler