Yazarlar, video sunmak için Sigma-Aldrich Dan Bess teşekkür ederiz. Biz de Don Şubesi, Evgenii Cherny Scott Chesla Elizabeth Hadac Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju Elena Korchagina Caroline Oliver Martin Olsson, Stephen Parker, İgor Rodinov teşekkür bunların sonuçları ve FSL yapıları tasarımı, sentezi ve biyolojik aktivitesinin belirlenmesinde katkı Alexander Tuzikov ve Eleanor Williams.

Aşağıdaki protokol biyolojik membranlar içine FSL yapıları ekleme (Şekil 1) genel prosedürü anlatılmaktadır. Basitlik için protokolü sadece% 100 konsantrasyonda hücreleri (kodecytes) sevk edecektir. Ancak, vadeli hücreler virionlar (kodevirions) veya organizma veya hücresel yapılar ve seyreltici kendi konsantrasyonu ile değiştirilebilir önemli değil, test, kontrol ve deneyler arasında her zaman tutarlı olması koşuluyla. Tipik olarak kırmızı kan hücreleri ile hematokrit% 80, ama virionlar, embriyo ve diğer hücreleri genellikle% 1&#39;den daha az. Bu yöntem çok sağlam ve herhangi bir varyasyon tarafından kullanılan modifiye membranlar üretecek, ancak arıtma, özel uygulamalar için gerekli değişiklik derecesi optimize etmek ve standartlaştırmak için gerekli olacaktır. 1. FSL, hazırlanması oluşturur <ol><li> Seyreltici 1.0mL (ya da ürün eklemek belirtildiği gibi) eklenmesi ile ürün flakon FSL inşa stok solüsyonu ilk sulandırmak kuru FSL ürün (Tablo 1) hazırlamak için. Kısaca sonikasyon (30 saniye). Bu 100 mcL steril kaplar içine aliquoted ve 2-8 ° C ile bir hafta kadar, ya da 3 aya kadar donmuş muhafaza edilebilir bir 1mg/ml çözüm hazırlayacaktır. </li><li> Çalışma hazırlamak için FSL miseller homojenize (30 saniye) stok solüsyonu kısaca sonikasyon kullanmak hemen önce, ekleme için çözümler oluşturmak. FSL inşa tampon (tercihen yüksek hidrofobik lipidler veya malzeme içermeyen), istenirse bir menzil içinde veya gerekli konsantrasyonu sulandırınız. </li></ol> Notlar: <ol><li> FSL yapıları genellikle, lipit içeren medya hücrelerin içine gireceğiz ama genellikle PBS veya diğer lipid ücretsiz medya daha çok 50X yüksek FSL çalışma konsantrasyonları gerekecektir. </li><li> Çalışma aralığı dilüsyonları uygulama tespit yöntemi duyarlılığı, FSL yapının türüne ve gerekli modifikasyon derecesine bağlıdır. Genelde seyreltme aralığı 10-500 karbonhidrat FSL yapıları için seyreltici mL başına FSL mikrogram ve fluorophores ve biyotin gibi diğer FSL yapıları için 1-100 mg / ml arasında olacak. </li><li> Birden fazla FSL inşa içeren ekleme seyrelticiler hazırlanıyor, sadece normal çalışma konsantrasyonda aynı seyreltici yapıları birbirine eklemek. Bir yapı diğerinden daha çok daha yüksek konsantrasyonda ise, konsantrasyon bazı ayarı (artış) daha az bir yapı için gerekli olabilir. Alternatif yapıları daha az izlenen, en yüksek konsantrasyon ilk inşa, tercihen sırayla eklendi olabilir. </li><li> FSL inşa konsantrasyonu 1000 mcg / ml üzerinde bir hücre zarı içine önemli miktarda lipid tanıtmak ve hücrenin şeklini değiştirmek veya lizis için daha duyarlı hale getirebilir. </li><li> FSL inşa çalışan çözümler 2-8 ° C&#39;de saklanır ve bir kaç gün içinde kullanılmalıdır. </li><li> FSL yapıları su içinde seyreltilmesi olabilir ama istikrar düşer ve birkaç saat içinde kullanılması gerekir. Prospektüste sulandırıldıktan seyreltici olarak su belirtirse flakonda ürün aynı zamanda tuzları (as prospektüste belirtilen) içerecektir. </li></ol> 2. Membranlar içine FSL Construct (ler) yerleştirilmesi <ol><li> İlk hücreler santrifüj yoluyla bağlanmamış lipidler FSL değişiklik ücretsiz yıkama ve yıkama çözüm olarak PBS veya lipid ücretsiz cep medya kullanarak. </li><li> Paketi hücreler veya seyreltici 100 mcL askıya. </li><li> Aynı zamanda, ideal olarak iyi huylu, ancak ilgili FSL yapısı değiştirilmiş hem de değiştirilmemiş hücreleri (FSL çözüm yerine PBS ile inkübe) ve / veya hücreleri olmalıdır kontrolleri hazırlar. </li><li> Hücreleri için uygun bir seyreltme FSL çözümü (1 veya daha fazla FSL yapıları içeren) 100 mcL ekleyin ve 37 1-2 saat inkübe ° C Benzer bir sonuç 25 6 saat inkübasyon elde edilebilir 4 ° C veya gece (18 saat) ° C - ağır hücre süspansiyonları kullanılır karıştırma birkaç saatte tavsiye edilir. </li><li> Herhangi bir ücretsiz FSL yapıları kaldırmak ve uygun bir süspansiyon hazırlamak için (isteğe bağlı) PBS veya medya ile iki kez yıkayın. </li></ol> Notlar: <ol><li> Seyreltici hücreleri askıya almak için kullanılan hücre kültür ortamı, PBS, hücre depolama çözümleri, vb olabilir, ama tercihen lipit (örneğin fetal buzağı serumu) veya deterjan (örneğin TWEEN) olmadan. </li><li> Farklı birimler (100 mcL daha) oranları (01:01 hücre / FSL çözüm daha) veya inkübasyon süresi ve sıcaklığı koşulları tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kullanılan aynı oran, konsantrasyon ve hacim olarak kullanılıyor olabilir. </li></ol> 3. Kullanma ve Görselleştirme <ol><li> Kodecytes lipid ücretsiz medya FSL değişikliği süreci tamamlandıktan sonra 4-8 ° C&#39;de saklanır veya kullanılmış olabilir. </li><li> Kodecytes ve kodevirions genellikle değiştirilmemiş hücre / virionlar olarak aynı şekilde davranır ve Handl olabilired ve normal test sistemleri (mikroskopi, seroloji, flow sitometri, vb.) altında incelendi. Genellikle çözücü / deterjan / membranlarda lipit yapıları Zehir lipidler kaçınma dışında hiçbir özel gereksinimleri var. </li></ol> Notlar: <ol><li> Hücrenin yaşam için lipid ücretsiz medya saklandığı takdirde, yapıları, kırmızı hücreler gibi inaktif hücreleri, membran kalır. Aktif membranlara hücrelerinde hücre zarı faaliyet oranda bağımlı bir yapıları, içselleştirilmiş ve metabolize olacaktır. </li><li> Ölü hücreler genellikle FSL yapıları yüksek düzeyde içeren, bu canlı hücreler cansız hücreleri ayırmak için kullanılabilir. </li><li> Kodecytes lipid (veya in vivo olarak kullanılan) saklanır içeren medya / serum / plazma yapı gibi ortamlarda, yavaş yavaş, saat ya da gün bir süre boyunca sıcaklık ve lipid konsantrasyonları / kompozisyonlar bağlı olarak, membran Zehir olacaktır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: <ol><li> Aşağıdaki temsilcisi sonuçları bağlıdır inşa kullanılmıştır (Tablo 1), takılı konsantrasyon ve algılama sistemi (ler) bağıl duyarlılık ve özgünlük. FSL yapıları, genel olarak 1 saat sonra hücrelerin içine gireceğiz ama her durum için en uygun koşulların oluşturulması gerekmektedir. </li><li> FSL yapıları, canlı hücreleri çeşitli 3-9,11,14 dışında etiketlemek için kullanılabilir . Şekil gösterilen örnekler farklı aşamalarında az 2 embriyolar (kırılgan bir hücre gibi) kullanılmıştır, ancak diğer hücrelere (Şekil 3) veya zarflı virionlar (Şekil 4) de etiketli olabilir. FSL-biotin ve diğer FSL yapıları (Şekil 5) kendi varlığını göstermek için ikincil bir algılama sistemi (genellikle avidin / antikorlar / lektinler) kullanımı gerekebilir FSL-Floresein, doğrudan etiketleme yüzeyler (Şekil 2-4) sağlar . </li><li> Kırmızı hücrelerin 4-9 (Şekil 6) da dahil olmak üzere hücreleri, insan veya hayvan özgüllüğü Kan grubu işaretleri eklenebilir. FSL miktarı bir kodecyte yapı olarak kontrol edilebilir ve tekrarlanabilir 4-6, antikor kantitatif için kodecytes yapılabilir (Tablo 2 ve Şekil 6). Gerçek hücre kaynağı önemli değildir, onlar herhangi bir türün, hatta antikor kaynağı olarak aynı kökenli, böylece sadece uyumsuz bir antijen sağlamak FSL 7,8 (Şekil 6) tarafından tanıtılan . </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tablo 2" /> Tablo 2, üç farklı FSL-A (üç) kırmızı hücre kodecytes Temsilcisi serolojik reaksiyonlar monoklonal anti-A dilüsyonları karşı test . FSL-A (üç) grup O kırmızı hücreler eşit hacmi ile inkübe 50 mcM çözüm 1:512 dilüsyon monoklonal anti-A tarafından tespit olabilir güçlü bir antijen pozitif hücreler, üretti. 5 - 10 kat daha düşük FSL-A (üç) çözümleri, daha az kan grubu A antijeni ifade kodecytes üretti. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="FSL inşa genel bakış" /> Şekil 1 FSL inşa genel bakış . Bir çiçek FSL yapıları gibi üç ana bileşenden oluşur. FSL inşa halinde fonksiyonel kafası farklı biyolojik olarak fonksiyonel gruplar, çeşitli membran uzak F boşluk neden su dispersiyon geliştirmek ve serum ile non-reaktif olarak tasarlanmış bir boşluk (S), (F) diacyl lipit sağlar yapı kendiliğinden yüzeyler dahil. (I), kan grubu, 3 GB (veya P k) FSL-GB3 epitop Galα4Galβ4Glcβ trisaccharide. (II) FSL-A (üç) kan grubu A trisaccharide epitopu GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-Floresein. (IV) tek bir biotin F benzer parçaları ile FSL-biotin. Yapı IV ayırıcı carboxymethylglycine-adipat dayalı iken, I-III yapıların fonksiyonel grup dioleoylphosphatidylethanolamine aktive adipat türev (DOPE) konjuge. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="FSL-Floresein etiketli fare embriyoları" /> Şekil 2 FSL-Floresein fare embriyoları etiketli. Tüm görüntüler canlı embriyo zona pellusida (ZP) (yani FSL inşa içinde embriyo etiket ZP geçirilir) sağlam olduğu zaman etiketli. Görüntüler I-IV FSL-Floresein asit tyrodes yazılan etiketleme ile ZP serbest ZP-embriyoların. Özdeş boyama embriyolar ZP sağlam veya ZP ücretsiz FSL ile değiştirilmiş olup olmadığını ne olursa olsun meydana gelir. Embriyolar, 2 saat 37 ° C yöntem serum serbest hücre kültürü medya tarafından doğrudan, FSL-Floresein etiketli yıkanır ve floresan mikroskobu altında incelendi. (I) ZP ücretsiz iki hücreli fare embriyo, aynı zamanda klasik yoğun kutup vücut boyama gösteren. (II-III) ZP ücretsiz dört hücreli, sekiz hücreli fare embriyoları, çıkışları olan hücreleri gösteren hem de gölgeli boyamaide mikroskop odak düzlemi. (IV) ZP ücretsiz 16 hücreli fare embriyo. (V) hem de embriyo ve zona etiketli ZP sağlam fare blastosist embriyolar (d4-d5). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-Floresein ve zebrafish" /> Şekil 3 FSL-Floresein ve zebrafish 14. (I) Microangiography 52 hpf (saat sonra döllenme) Zebra balığı larvaları FSL-Floresein dolaşımını doğrudan enjekte. Zebrafish damarsal lekeli. (II) FSL-Floresein heterojen Zebra balığı böbrek doku hücrelerinin (ZK kodecytes), ex vivo oluşturulan mikro-52 hpf alıcı Zebra balığı dolaşımı içine enjekte edilir. ZK kodecytes in vivo gözlemler görüntüleme 2 saat sonrası enjeksiyon yapıldı time-lapse mikroskobu ile floresan altında damarsal. Gösterilen büyük yavaş hareketli veya hareketsiz hücreler (portakal oklarla gösterilen) ve hızlı hareket eden hücreler (yeşil oklarla belirtilen hareketi nedeniyle bulanık görüntüleri) ile tek bir video karesi. Etiketleme, davranış ve ZK kodecytes biodistribution in vivo gözlem gerçek zamanlı sağlar . (III) FSL-Floresein Oral alımı çeker tarafından 5 gün medya içeren FSL-Floresein zebrafish embriyolar elde etti. Yıkama hiçbir FSL yapıları (en az 6 saat gereklidir, ancak birkaç gün için olabilir) içeren ortama embriyoların transferi ile elde edilmiştir. (IIIa) Aydınlık alan mikroskobu bitişik floresan görüntü (IIIb) karşılık gelen FSL-Floresein tedavi zebrafish. Fluoresence tercihen bağırsak yer oldu. Boyama, tedavi edilmeyen kontrol embriyolar (IVa ve IVb) gözlenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="Virionlar FSL-Floresein etiketleme" /> Şekil 4 virionlar 10 VSV ve H1N1 FSL-Floresein etiketleme. (I) veziküler stomatit virüsü (VSV), doğrudan 37 10 mcg / ml 2 saat FSL-Floresein etiketli ° C,% 4 paraformaldehid ve ardından flow sitometri ile tespit izledi. VSV kodevirion Mesaj FSL etiketleme hiçbir arıtma gerekli oldu. (II), insan, A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) ile enfekte domuz testis hücrelerinin Flow sitometri FSL-Floresein kullanarak etiketli kodevirions. Enfekte olmamış hücrelerdeki siyah bir çizgi olarak görülür, floresan hücre (kırmızı çizgi) ST hücreleri sonuçları ile H1N1 kodevirion füzyonu. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="FSL-biotin işaretli hücrelerin" /> Şekil 5 etiketli avidin 7,8 ile FSL-biotin etiketli hücreleri ve sonraki görselleştirme. Tüm hücreler ilk 1 saat 37 ° ° C FSL-biotin ile etiketlenmiş sonra avidin etiketli florofor floresan mikroskopi için monte yıkanmış ve ıslak ile reaksiyona yıkanmış edildi. (I) bir fare embriyo blastosist konfokal görüntü Derlenmiş. (II) önceki görüntü embriyo Orta konfokal dilim. (III) Canlı hareketli insan sperm bulanıklık kendi hareketinin bir sonucu olarak ortaya çıkar. (IV) Sabit (% 4 paraformaldehid mesaj ekleme) İnsan sperm. (V) İnsan eritrosit. (VI) Sabit (% 4 paraformaldehid ekleme öncesi) RL95 insan endometrial karsinom. (VII) Sabitlenmemiş RL95 endometrial insan karsinom hücre hattı. (VIII) Biotin RBC (VIIIb) alanında mevcut iki kodecytes belirlenmesi, floresan altında görüntülenen aynı alanda ise 2 saat (VIIIa), ışık mikroskobu altında incelendi bir alanı temsil eden kodecytes intravenöz infüzyon yazılan alınan bir kan örneği gözlenen kodecytes görüntüsü. Etiketsiz hücreleri kodecytes oranının hesaplanması hayatta kalma bir göstergesi olarak kullanmak olabilir. (IX) Canlı insan endometrial biotin kodecytes avidinylated boncuk bağlanarak tarafından görüntülendi. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-Karbonhidrat serolojik profil için kan grubu belirteçleri eklemek için" /> Şekil 6 serolojik profil için kan grubu belirteçleri eklemek için FSL-Karbonhidrat. (I) İnsan kırmızı hücre Galili kodecytes FSL-Galili bir konsantrasyon (500 mg / ml) ile oluşturulan ve insan serum dilüsyonları karşı test edilmiştir. İnsan kırmızı kan hücrelerinin doğal xenoantigen Galili antijen ile meydana gelmez. Böyle kodecytes kantitatif serum antikor düzeylerine kullanılabilir. Bu örnekte donör 01:32 bir anti-Galili titresi tespit edildi. (II) antikor tespit etmek için FSL azalan seviyeleri (&quot;antijen titreleri&quot;), optimal bir antijen düzeyi kodecytes oluşturarak (bu örnekte Le bir) tespit edilebilir. Hücreler antikor düzeyi belirli bir titresi aştığında olumlu bir sonuç vermek için oluşturulabilir. Pozitif sonuç vermesi için gerekli FSL antijen antikor kalite ve seviye tespit edilmelerini bağlıdır. Karbonhidrat antijenleri için 100 mcg / mL FSL çözüm genellikle güçlü bir pozitif reaksiyon neden olur. (III) İnsan grubu O kırmızı hücreleri belirli bir düzeyde bir karınca için modifiye edilmiştirigen (A kodecytes standardize), doğru ve tekrarlanabilir insan serumunda anti-A ölçmek için kullanılır. Bu örnekte anti-A grubu O serum test titresi 1:32 ve kodecytes donör kendi kırmızı kan hücrelerinin hazırlanmıştır. (IV) Kan grubu A ve B antijenleri, aynı anda tek bir grup O kırmızı hücre örneği takılı zayıf bir B zayıf kodecytes oluşturmak için kullanılır. Bu kodecytes ABO kalite kontrol amaçlı kullanılabilir. Bu sonuç, özel olarak formüle edilmiş anti-A ve anti-B reaktifler karşı test edilmiş ve zayıf reaksiyonlar beklenen verir zayıf bir B zayıf kodecyte analizi gösterir .

<ol>
	<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Strable, E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+of+viruses+and+virus-like+particles.">Chemical modification of viruses and virus-like particles.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 327, 1-21 (2009).</li><li>Henry, S., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+synthetic+peptidolipids,+glycolipids+and+other+lipid-linked+structures+to+create+designer+red+cells.">The development of synthetic peptidolipids, glycolipids and other lipid-linked structures to create designer red cells.</a> Transfusion. 48, 194A-194A (2008).</li><li>Frame, T., Carroll, T., Korchagina, E., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+glycolipid+modification+of+red+blood+cell+membranes.">Synthetic glycolipid modification of red blood cell membranes.</a> Transfusion. 47, 876-882 (2007).</li><li>Hult, A. K., Frame, T., Henry, S., Olsson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+evaluation+of+red+blood+cells+transformed+with+variable+amounts+of+synthetic+A+and+B+glycolipids.">Flow cytometry evaluation of red blood cells transformed with variable amounts of synthetic A and B glycolipids.</a> Vox Sang. 95, 180-180 (2008).</li><li>Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+red+blood+cells+for+laboratory+quality+control+use.">Modification of red blood cells for laboratory quality control use.</a> Curr. Opin. Hematol. 16, 467-472 (2009).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neutralization+of+anti-A+and+successful+transfusion+of+A+antigen+incompatible+red+cells+in+an+animal+model.">In vivo neutralization of anti-A and successful transfusion of A antigen incompatible red cells in an animal model.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+transfusion+reactions+and+predicting+in+vivo+cell+survival+with+kodecytes.">Modeling transfusion reactions and predicting in vivo cell survival with kodecytes.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Heathcote, D., Carroll, T., Wang, J. J., Flower, R., Rodionov, I., Tuzikov, A., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antibody+screening+cells,+MUT+Mur+kodecytes,+created+by+attaching+peptides+onto+erythrocytes.">Novel antibody screening cells, MUT+Mur kodecytes, created by attaching peptides onto erythrocytes.</a> Transfusion. 50, 635-641 (2010).</li><li>Hadac, E. M., Federspiel, M. J., Chernyy, E., Tuzikovb, A., Korchagina, E., Bovin, N. V., Russell, S. J., Henry, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+and+radiolabeled+Function-Spacer-Lipid+constructs+allow+for+simple+in+vitro+and+in+vivo+bioimaging+of+enveloped+virions.">Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions.</a> J Virol Meth. 10, (2011).</li><li>Blake, D., Lan, A., Love, D., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-kodecytes+-+fluorescent+function-spacer-lipid+(FSL)+modified+cells+for+in+vitro+and+in+vivo+analyses.">Fluorophore-kodecytes - fluorescent function-spacer-lipid (FSL) modified cells for in vitro and in vivo analyses.</a> FEBS J.. 277, 199-199 (2010).</li><li>Harrison, A. L., Olsson, M. L., Brad Jones, R., Ramkumar, S., Sakac, D., Binnington, B., Henry, S., Lingwood, C. A., Branch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+globotriaosylceramide+analogue+inhibits+HIV-1+infection+in+vitro+by+two+mechanisms.">A synthetic globotriaosylceramide analogue inhibits HIV-1 infection in vitro by two mechanisms.</a> Glycobiology. 27, 515-524 (2010).</li><li>Barr, K., Diegel, O., Parker, S., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-Spacer-Lipid+(FSL)+constructs+enable+inkjet+printing+of+blood+group+antigens.">Function-Spacer-Lipid (FSL) constructs enable inkjet printing of blood group antigens.</a> FEBS J. 277, 235-235 (2010).</li><li>Lan, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling inflammatory bowel disease [dissertation]. , (1988).</li></ol>

Deborah A. Boş ve Stephen M. Henry code Biotech çalışanları ve hissedarları code teknolojisinin patent sahibi Limited. Dan Bess bu video-makale üretimi sponsor oldu Sigma-Aldrich, bir çalışanın.

FSL yapıları ile değiştirmek hücreleri ve virionlar çok basit ve sağlam bir tekniğin 3-11 . Tanımlamak ve FSL değiştirilmemiş hücrelerden değiştirilmiş hücreler ve virionlar inşa ayırmak için sırasıyla kodecytes ve kodevirions 6-10 denir, ama tanıtıldı fonksiyonel grup, membran üzerinde mevcut olması gösterilebilir sadece. Kodecytes FSL yapıları farklı konsantrasyonları ile yapıldığında, örneğin 15 mg / ml kodecytes ya da birden fazla FSL sonra ise kombine bir dönem, onları oluşturmak için kullanılan FSL inşa çözüm konsantrasyonu anılacaktır. A + biotin kodecytes 7,8 gibi. Farklı hücreler açıklama hücre tipi de dahil olmak üzere, karşılaştırılabilir zaman tavsiye edilir, örneğin kırmızı hücre biotin kodecytes veya endometrium biotin kodecytes 7,8. Yerleştirme işlemi, (farklı oranlarda olsa da) çok sağlam ve ekleme olmakla birlikte 4 ila geniş bir sıcaklık aralığında meydana gelir - 37 ° C ve saat dakika içinde, temas süresi, sıcaklık, FSL konsantrasyonu (tekrarlanabilir ekleme sıkı kontrol elde etmek için ) seyreltici formülasyonu dahil olmak üzere, daha az oranda hücre konsantrasyonu gereklidir. Bugüne kadar, tüm FSL yapıları aynı tekniğin 4-11 hücreleri değiştirmek için kullanılır olabilir, ancak belirli koşullar hücre / modifiye edilmesi virionlar iş akışı ve / veya optimal işleme gereksinimleri için daha elverişli olması beklenmektedir. . Istenen etkiyi elde etmek için tam FSL konsantrasyonu 4 kullanıcı tarafından tespit edilmesi gerekmektedir. Çıkan FSL değiştirilmiş hücreler inşa / virionlar genellikle biyolojik ya da analitik sistemler 4-11 değiştirilmemiş bir hücre / virion aynı şekilde kullanılabilir. FSL yapıları lipid çözümler 7,8 ile temas ettiğinde yavaş yavaş değiştirilmiş yüzeylerden Zehir, ya da aktif hücreler 11 tarafından tüketilmesi olarak, bu konularda zaman dönemler boyunca elde edilen sinyal ya da aktivite düzeyi açısından dikkate alınmalıdır. Ekleme fiksatif lipid salınımlı solventler içermez ve fonksiyonel grup fiksatif ile uyumlu sonra Kodecytes (örneğin glutaraldehid / formalin) sabit olabilir. Alternatif olarak sabit hücreler FSL yapıları değiştirilebilir. FSL yapıları değişiklik hücre ve virion yüzeylerin yanı sıra aynı zamanda dolaşımdaki hücrelerin in vivo Modifikasyon 7 neden laboratuvar hayvanları dolaşıma doğrudan infüze edilebilir ve virüsler 12, toksinler, 12 ve antikorlar 7 inhibe . FLS yapıları da süslemek için lipozomlar kullanılır ve onlar hareketsiz kağıt yüzeyler 13, üzerine basılabilir ve daha sonra tanı testleri kullanılabilir . FSL yapıları giderek artan sayıda canlı hücreleri kolayca değiştirmek için yetenek, hücre yüzeyinde biyoloji çalışma için yararlı bir araştırma ve geliştirme aracı olarak kanıtlamak gerekir.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tablo 1" /> 1. Ticari olarak kullanılabilir FSL yapıları bu yazıda açıklanan Tablo.

fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability

Değiştirmek / biyolojik yüzeyler görselleştirmek ve ardından bir dizi in vitro ve in vivo ortamlarda değiştirilmiş hücre / virion çalışma yeteneği belirli molekülleri ya da tüm varlık işlevi içine daha fazla anlayış kazanıyor esastır. Biyolojik yüzey modifikasyonu çalışmalar genellikle organizmanın genetik mühendisliği ya da hücre yüzeyinde 1,2 kimyasal moieties kovalent eki sınırlıdır. Ancak bu geleneksel teknikleri, kimyasal reaktanları hücre maruz kalmaktadır, ya da, istenilen sonucu elde etmek için önemli bir manipülasyon, bunları hantal hale gerektirir ve onlar da yanlışlıkla değiştirilmiş hücre canlılığı / işlevselliği etkileyebilir. Zararsız hücre yüzeyi değiştirmek için basit bir yöntem gereklidir. Son zamanlarda yeni bir teknoloji, code Teknoloji yeni yapıları üç bileşenden oluşan bir dizi tanıttı: fonksiyonel bir kafa grubu (F), bir ayırıcı (S) ve lipid kuyruk (L) ve Fonksiyon-Spacer-Lipid veya FSL olarak bilinir constructs3. Boşluk (S), suda dağılabilir bir yapı sağlamak üzere seçilen, ancak kendiliğinden ve istikrarlı bir şekilde bir zar içine dahil edecektir. FSL (F), bugüne kadar kan grubu ile ilgili belirleyiciler, sialik asitler, Hyaluronan&#39;ın polisakkaritler, fluorophores, biotin, radiolabels ve peptidler bir dizi 3-12 dahil olmak üzere sakkaritlerin, bir dizi fonksiyonel moieties yapı. FSL yapıları, embriyoları değiştirerek, sperm, zebrafish, epitel / endometrium hücreleri, kırmızı kan hücreleri ve virionlar hücre adezyon / etkileşim / ayırma / immobilizasyon değiştirmek için, kalite kontrol sistemleri ve teşhis paneller, oluşturmak için kullanılır, ve in vitro ve in edilmiştir hücre / virionlar 3-12 in vivo görüntüleme. Hücre / virionlar değiştirme süreci, genel ve son derece basit. En yaygın bir yöntemdir, FSL 37, 1-2 saat boyunca inşa ° 4-10 C için bir çözüm ile hücre inkübasyon (lipid ücretsiz medya ). İnkübasyon sırasında FSL membran dahil kendiliğinden oluşturur ve bu süreç tamamlandıktan. Yıkama isteğe bağlı. Virionlar kodevirions 10 iken, FSL yapıları değiştirilmiş hücreler, kodecytes 6-9 olarak bilinmektedir . Olduğu gibi doğrudan haşlama ve kodecytes / kodevirions deneysel hayvan modelleri 7,8,10 FSL oluşturur. Tüm kodecytes / kodevirions F benzer parçaları 7,8,10,11 yeni bir işlev kazanıyor süre normal canlılık ve fonksiyonelliği korumak için görünür. Biyouyumlu medya, hücre zarları içerisinde kendiliğinden birleşme ve belirgin düşük toksisite dispersiyon kombinasyonu, FSL hücreleri ve virionlar çalışma için değerli bir araştırma araçları inşa yapar.

Watch this Scientific Journal Video about FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability at JoVE.com

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Fonksiyon-Spacer-Lipid (FSL) yapıları canlılık kaybı olmadan, canlı hücreler ve virionlar yüzey özelliklerinin değiştirilmesine izin verir. Bu yöntem, sadece basit bir hücre / virion ve spontan ve kararlı bir yüzey dahil oluşur FSL inşa çözüm temas gerektirir.

FSL oluşturur: immunoseparasyon bir Aralığı Hücre / virion Yüzeyleri değiştirmek için Basit Bir Yöntem, Canlılık Etkileyen olmadan

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

fsl-constructs-simple-method-for-modifying-cellvirion-surfaces-with

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K Görüntüleme.  AUT University and KODE Biotech Ltd. Fonksiyon-Spacer-Lipid (FSL) yapıları canlılık kaybı olmadan, canlı hücreler ve virionlar yüzey özelliklerinin değiştirilmesine izin verir. Bu yöntem, sadece basit bir hücre / virion ve spontan ve kararlı bir yüzey dahil oluşur FSL inşa çözüm temas gerektirir.

Video: FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biyoloji

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

MİYOJEN Engineered Doku oluşturur imalatı

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Kompleks Biyolojik örnekler seçerek glikozile Peptitler zenginleştirin lektin HPLC Yöntemi

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Lazer Uncagable Floresein Dextran&#39;ın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Vahşi Tırtıllar gelen Hemocytes ayıklamak için basit bir protokol

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Homolog rekombinasyon Oluşumlar Recombineering<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zigotların

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.