Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Federasyon Keşif Projesi hibe #1096623 tarafından finanse edildi.

1. Rekombinasyon Vektörü Oluşturma
<ol><li>N veya C-terminally ilgi çekici geni etiketlemek için gereken 150 bp uzunluğundaki homoloji bölgelerini (sol ve sağ kollar olarak adlandırılır) tanımlayın (Bkz. Şekil 1b).</li>
	<li>Tercih edilen bir çift kısıtlama bölgesi ile ayrılmış 150 bp sol ve sağ kollardan oluşan bir oligonükleotid dizisi tasarlayın. Tüm bu dizi, sentezlendikten sonra TDS vektörüne dahil edilmesine izin vermek için ikinci bir kısıtlama sitesi çifti (ilk çiftten farklı) tarafından da kuşatılmalıdır. Oligonükleotid'i, dizilerin istenen ekleme sitesiyle çerçevede olduğu kısıtlama siteleriyle tasarlarken dikkatli olun.</li>
	<li>Sentez için oligonükleotid tasarlarken sol ve sağ kollar arasındaki kısıtlama sitelerini dahil edin, bu da tercih edilen floresan etiketin açık okuma çerçevesini kuşatanlarla eşleşmelidir (bkz. Şekil 1b). NotI kısıtlama sitesini sol kol ile floresan etiketin başlangıcı arasında üç amino asit bağlayıcı olarak kullanmak mümkündür.</li>
	<li>Bu kısıtlama sitelerini PCR ile floresan etiketinin her iki tarafına da dahil edin (bkz. Şekil 1c).</li>
	<li>Sentezlenen parçayı TDS vektörüne klonla.</li>
	<li>Floresan etiketi, homolojinin sol ve sağ kol bölgeleri arasındaki kısıtlama alanlarını kullanarak ortaya çıkan rekombinasyon vektörüne klonlama (bkz. Şekil 1d).</li>
</ol>2. Rekombinant Virüs Üretimi
<ol><li>Şekil 2'yegöre, BS-C-1 hücrelerinin monolayerini serumsuz ortamda vaksinia virüsü ile enfekte edin, Enfeksiyon Çokluğu (MOI) > 1.</li>
	<li>Enfeksiyon sonrası 1 saat, Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile kurtarma hücreleri ve serumsuz ortamda 3:1 oranında rekombinasyon vektör plazmid ve transfection reaktif karışımı ile transfect.</li>
	<li>24 saat sonra, DMEM'de fetal sığır serumu (FBS) içermeyen hücreleri kazıyın ve kurtarın ve açık hücreleri kırmak ve virüs parçacıklarını serbest bırakmak için üç donma-çözülme döngüsü gerçekleştirin.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi% 10 FBS DMEM ve GPT seçim reaktifleri mikhenolik asit (25 μg / ml) ve ksantin (250 μg / ml) sıvı kaplaması ile bir plak analizi gerçekleştirin:<ol>
<li>BS-C-1 hücrelerinin monolayer ile 6 kuyulu bir plaka tohum.</li>
		<li>Tek tek plakların yeterli ayrılmasını sağlamak için% 100 birleştiği hücre monolayerlerini, virüs parçacıkları içeren dondurularak çözülmüş hücrelerin seri seyreltmeleriyle enfekte edin.</li>
		<li>GPT seçim reaktiflerini içeren DMEM içeren sıvı% 10 FBS ile kaplama - sırasıyla 25 μg / ml ve 250 μg / ml nihai konsantrasyonlarda mikophenolik asit ve ksantin.</li>
	</ol></li>
	<li>24 saat kuluçkadan sonra, sıvı kaplamayı çıkarın ve mCherry'nin TDS vektöründen virüse dahil edilmesine karşılık gelen dağınık kırmızı floresan gösteren plakları aramak için floresan bir mikroskop kullanın. Hedef gen ve seçilen floresan etiketine bağlı olarak, etiketli genin lokalize floresanları da aynı kırmızı plakta görülebilir.</li>
	<li>Hücreleri bir Eppendorf tüpüne aktarmak için bir pipet ucu ve DMEM içeren% 5 FBS'nin 100 μl'si ile lokalize kazıma yaparak her rekombinant virüs için birden fazla plak seçin, ardından rekombinant virüsleri serbest bırakmak için kazınmış hücrelerin üç tur dondurularak çözülmesi.</li>
	<li>Büyüme ortamlarındaki GPT seçim reaktifleri ile rekombinant virüsleri güçlendirmek için 12 kuyulu bir plakadaki tek katmanlı hücrelere dondurarak çözülmüş virüs içeren DMEM'i ekleyin. Başarılı amplifikasyonları 24 saat sonra enfeksiyon kazıyın.</li>
	<li>Kırmızı floresan sergileyen başarıyla yükseltilmiş plakların bir plak testini gerçekleştirin, bu kez agarose kaplama ve GPT seçimi ile aşağıdaki gibi:<ol>
<li>BS-C-1 hücrelerinin monolayer ile 6 kuyulu bir plaka tohum.</li>
		<li>Rekombinant virüslerin seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve FBS içermeyen DMEM'de artan bir virüs seyreltme ile kuyuları enfekte edin.</li>
		<li>Enfeksiyon sonrası 1 saat, sıvı ortamı çıkarın ve GPT seçim reaktifleri ile birlikte% 2.5 FBS, 292 μg / ml L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 μg / ml streptomisin içeren minimum esansiyel ortamda (MEM)% 0.5 agarose ile her kuyuyu kaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Enfeksiyon sonrası 2-3 gün, hem kırmızı hem de seçilen floresan etiketin rengini gösteren floresan gösteren plakları tekrar yükseltmek için seçin, bu sefer GPT seçimi olmadan.</li>
	<li>Bir sonraki plak testini, seçimsiz bir agarose kaplama ile gerçekleştirin.</li>
	<li>Dağınık kırmızı floresanlarını kaybetmiş plakları seçin, ancak tercih edilen etikete karşılık gelen lokalize floresanları koruyun.</li>
	<li>mCherry ve gpt seçim genlerini kaybetmiş ancak seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresanları koruyan saf bir rekombinant virüs stoğu elde etmek için hiçbir seçim yapmadan plak saflaştırmaya devam edin. Kontrol stokları plak testine göre saftır, tüm plaklar benzer bir plak fenotipine sahip olmalıdır.</li>
	<li>Viral stokların saf olduğundan emin olmak için genomik DNA'nın PCR taramasını kullanın.<ol>
<li>Floresan gen ekleme bölgesini kuşaten astarlar ve eklenen floresan geninin kendisini güçlendiren astarlar tasarlayın. Bu astarların farklı kombinasyonları, gen yerleştirmeyi algılayacak ve saflığı gösterecek PCR ampliconları üretecektir.</li>
		<li>BS-C-1 hücrelerinin 12 kuyu plakalı monolayerinin bir kuyusunda PCR olarak taranacak viral stokları güçlendirin.</li>
		<li>Enfeksiyon sonrası 24 saat, enfekte hücreleri 250 μl DMEM'e kazıyın.</li>
		<li>Santrifüj enfekte hücreler (10 dk, 4 °C için 18.000 x g), %0,1 (v/v) SDS ile 500 μl TE'de (10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA, pH 8) süpernatant ve resüspend hücre peletini çıkarın. Girdap'dan Iyse hücrelerine.</li>
		<li>Karıştırmak için ters çevirin, 500 μl fenol-kloroform-izoamil akohol ekleyin. Santrifüj (4 dk, 4 °C için 18.000 x g). Üst saltanayı al ve tekrar et.</li>
		<li>Karıştırmak için ters çevirin, 1 ml 100% etanol (soğutulmuş) ve 50 μl sodyum asetat ekleyerek süpernatant üzerinde bir etanol çökeltisi gerçekleştirin.</li>
		<li>Gece boyunca -20 °C veya 1 saat boyunca -80 °C'de bırakın. Santrifüj (30 dk, 4 °C için 18.000 x g), tüm sıvıyı çıkarın ve çökemiş DNA'nın havayla kurumasını bekleyin. 50 μl TE'de yeniden dirildi.</li>
		<li>Bunu genomik DNA PCR taraması için bir şablon olarak kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Birden Fazla Etiket Taşıyan Rekombinant Virüslerin Üretimi
<ol><li>Çift veya üç etiketli virüsler oluşturmak veya Protokol 1'den prosedürü tekrarlamak için floresan rekombinant virüslerle aynı hücre monolayerini farklı bir etiketle coinfect edin.</li>
	<li>Virüsleri plak fenotipine veya virüs izole genomik DNA'sının PCR taramasına dayanarak arındırın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventures+with+poxviruses+of+vertebrates.">Adventures with poxviruses of vertebrates.</a> FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).</li><li>Goebel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+DNA-Sequence+of+Vaccinia+Virus.">The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus.</a> Virology. 179, 247-266 (1990).</li><li>Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide-sequence+of+42+kbp+of+vaccinia+virus-strain+WR+from+near+the+right+inverted+terminal+repeat.">Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat.</a> J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).</li><li>Roberts, K. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+morphogenesis+and+dissemination.">Vaccinia virus morphogenesis and dissemination.</a> Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).</li><li>Gammon, D. B., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3+'-to-5+'+Exonuclease+Activity+of+Vaccinia+Virus+DNA+Polymerase+Is+Essential+and+Plays+a+Role+in+Promoting+Virus+Genetic+Recombination.">The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination.</a> J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).</li><li>Yao, X. D., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+DNA+structure+and+homology+length+on+vaccinia+virus+recombination.">Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination.</a> J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).</li><li>Ward, B., Isaacs, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. 16, 205-218 (2004).</li><li>Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Poxvirus+Vectors+Have+Capacity+for+at+Least+25,000.">Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000.</a> Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).</li><li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-etch+EM+reveals+that+the+early+poxvirus+envelope+is+a+single+membrane+bilayer+stabilized+by+a+geodetic+&amp;#34;honeycomb&amp;#34;+surface+coat.">Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic &amp;#34;honeycomb&amp;#34; surface coat.</a> J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).</li><li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+host+cell+entry.">Poxvirus host cell entry.</a> Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).</li><li>Ward, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+characterization+of+the+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+intracellular+mature+virions.">Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions.</a> J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).</li><li>Carter, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+cores+are+transported+on+microtubules.">Vaccinia virus cores are transported on microtubules.</a> J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).</li><li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera.">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).</li><li>Rodriguez, J. F., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+size+phenotype+as+a+selectable+marker+to+generate+vaccinia+virus+recombinants.">Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants.</a> J. Virol. 63, 997-1001 (1989).</li><li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+on+the+basis+of+plaque-formation.">Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation.</a> Gene. 158, 157-162 (1995).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+-+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).</li><li>Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+vectors+utilizing+the+beta-galactosidase+assay+for+rapid+selection+of+recombinant+viruses+and+measurement+of+gene-expression.">Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression.</a> Gene. 47, 193-199 (1986).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia-coli+gpt+gene+provides+dominant+selection+for+vaccinia+virus+open+reading+frame+expression+vectors.">Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors.</a> J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).</li><li>Liu, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+(Tian-Tan+strain)+expressing+hepatitis-B+virus+surface-antigen+by+using+beta-galactosidase+as+a+marker.">Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker.</a> Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).</li><li>Dom&#237;nguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+expressed+by+a+recombinant+vaccinia+virus+permits+early+detection+of+infected+cells+by+flow+cytometry.">Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).</li><li>Cordeiro, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F11-Mediated+Inhibition+of+RhoA+Signalling+Enhances+the+Spread+of+Vaccinia+Virus+In+Vitro+and+In+Vivo+in+an+Intranasal+Mouse+Model+of+Infection.">F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection.</a> Plos One. 4, (2009).</li><li>Jensen, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+major+membrane+and+core+proteins+of+vaccinia+virus+by+two-dimensional+electrophoresis.">Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis.</a> J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).</li><li>Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+Fine-Structure+of+a+Vaccinia+Virus+Gene+Encoding+an+Envelope+Antigen.">Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen.</a> J. Virol. 58, 757-764 (1986).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for.</a> 22, 445-449 (2004).</li><li>Shu, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> Plos Biol. 9, (2011).</li><li>Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+recombinant+poxviruses+using+a+compact+GFP-blasticidin+resistance+fusion+gene+for+selection.">Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection.</a> J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).</li><li>Broder, C. C., Earl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 62, 173-197 (1997).</li><li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vaccinia+virus+formation+and+cell-to-cell+virus+transmission+are+prevented+by+deletion+of+the+gene+encoding+the+37,000-dalton+outer+envelope+protein.">Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein.</a> J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).</li><li>Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J., Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+Navigating+the+subcellular+space:+Lessons+from+vaccinia+virus.">Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus.</a> Viral Transport, Assembly and Egress. , 155-177 (2011).</li><li>Jeshtadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Poxvirus+Intracellular+Mature+Virion+Proteins+with+the+TPR+Domain+of+Kinesin+Light+Chain+in+Live+Infected+Cells+Revealed+by+Two-Photon-Induced+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy.">Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.</a> J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).</li><li>Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+N-WASP+exchange+limits+the+extent+of+ARP2/3-complex-dependent+actin-based+motility.">The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility.</a> Nature. 458, (2009).</li><li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid,+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression.">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).</li><li>D&#233;nes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+oncolytic+Vaccinia+viruses+for+non-invasive+optical+imaging+of+tumors.">Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors.</a> Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+Potentiates+Vaccinia-Induced+Actin+Polymerization+to+Facilitate+Viral+Spread.">Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread.</a> Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).</li><li>Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-viral+imaging+of+vaccinia+virus+using+super-resolution+microscopy.">Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy.</a> J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).</li><li>Horsington, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A36-dependent+Actin+Filament+Nucleation+Promotes+Release+of+Vaccinia+Virus.">A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li></ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Bu teknik, floresan etiketli viral proteinleri ifade eden rekombinant virüslerin oluşturulması için etkili ve modüler bir protokolü açıklar. Yöntem, viral genomdaki tek değişikliğin, geride seçim işareti bırakmadan bir etiket veya işaretleyici eklenmesi olmasını sağlar. Homolog rekombinasyon için gereken kısa kol uzunluğu, doğrudan sentezini sağlar, pcr ve klonlamanın birkaç zaman alıcı turunu ortadan kaldırırken, mCherry ve metabolik GPT seçiminin floresanları viral rekombinasyon aralarını izole etmek için kullanılır. Bu ara ürünler, seçimin kaldırılmasını takiben, etiketli bir gene sahip bir virüse veya ebeveyn tipine geri çözülebilir. Hem floresan hem de metabolik seleksiyon kullanımını içeren benzer bir yöntem daha önce27 olarak tanımlanmıştır, ancak bu çalışmada kullanılan yöntem homolojinin daha kısa, sentezlenmiş bölgelerini kullanarak, ilgi çekici etiketli genin floresanını görüntüleyerek istenen rekombinant virüsün tanımlanmasını sağlar. Bu ikincil seçim sadece bir plak testinde yeterli floresan üreten yüksek oranda ifade edilen viral genlerin etiketlenmesi için geçerlidir. Alternatif olarak, örneğin güçlü bir viral promotör altında floresan bir protein gibi tam bir ifade kasetinin yerleştirilmesini öngörebilirim. Bu durumda sol ve sağ kollar etiketlenecek viral gen yerine ekleme noktasını tanımlar.
Deneysel prosedür sırasında yararlı olduğu kanıtlandı bazı önemli adımlar vardır. Yukarıda açıklanan adım 2.3.3'teki sıvı kaplama, kırmızı/yeşil floresan plakların tespiti ve izolasyonu için çok önemli olduğunu kanıtladı. GPT seçim reaktifleri ve agarose kaplamasının kombinasyonunun rekombinant virüslerin büyümesini caydırdığını ve bu nedenle transfeksiyondan sonra virüsleri güçlendirmenin ilk adımı için sıvı bir kaplamaya geçtiğini inanıyoruz. Sol kol rekombinasyonundan kaynaklanan ara ürünler, sol kolda da bir promotör dizisi içeriyorsa plaklarda gözlenen yaygın floresan ile sonuçlanabileceğinden, zenginleştirme ve saflaştırma için lokalize etiket rengi floresan gösteren floresan plakların seçimi de önemlidir. TDS vektöründeki mCherry işaret geni de gfpile değiştirilebilir , örneğin, mCherry'nin floresan etiketi olarak kolayca birleştirilmesine ve seçilmesine izin vermek için.
Yukarıda açıklanan bazı teknikler, rekombinant vaksinia virüsü oluşturmanın yerleşik yöntemlerinden biraz farklılık gösterir. Örneğin, rekombinant oluşturmak için kullanılan virüsün MOI'si normalde1 28'den azdır , ancak daha yüksek MOI'lerin kullanımı bu yöntemle rekombinant vaksinia virüsünün oluşturulması için yeterli olmuştur. GPT seçim reaktiflerinin kullanımı normalde hücrelerin seçim reaktifleri18ile önkökasyonunu gerektirir , ancak enfeksiyon sonrası kurtarma aşamasında eklenmesi, özellikle floresan seçim işaretleyicisinin varlığı nedeniyle hala istenen rekombinantların yeterli seçimini sağladı.
Daha önce de belirtildiği gibi, bu tekniğin sınırlamalarından biri, ikincil floresan seçim adımının, bir plak testinde gözle algılanmasını sağlayan bir düzeyde, ilgi çekici etiketli proteinin yüksek oranda ifade edilmesine dayanmasıdır. Bu olmadan, sadece mCherry floresan sergileyen virüsleri arındırmak mümkün olacaktır, bunlardan en az% 50'si, yukarıdaki adım 2.12'de açıklanan PCR gibi moleküler stratejilerle tanımlanabilecek istenen rekombinant virüsleri içerecektir. Diğer bir sınırlama, etiketlemelerinin bir sonucu olarak bazı proteinlerin inaktivasyonu olabilir. Floresan etiketi mutasyona uğrayabilir veya zaman içinde geçen rekombinant virüs tarafından eksantasyona uğrayabilir. Bu nedenle rekombinant virüs stoklarının mikroskopi ve PCR ile düzenli örneklemesi önerilir. Son olarak, tek bir virüse dahil edilebilen floresan etiketli proteinlerin sayısının bir sınırı olabilir. Bunun bir yönü, hepsini aynı anda görselleştirme yeteneğidir; mevcut floresan etiketlerin emisyon spektrumunun çakışan doğası göz önüne alındığında, minimum spektral kanama sağlamak için bunları dikkatlice seçmek önemlidir. Ek olarak, GFP ve Cerulean gibi yakından ilişkili etiketlerin kullanılması, rekombinant genomdaki konumlarına bağlı olarak ikisi arasında yeniden birleştirme olasılığını açar.
Bu tekniğin modüler yapısı, floresan etiketlerin diğer boyama ve/veya etiket seçenekleriyle uyumluluğa dayalı olarak basit bir şekilde değiştirilmesini sağlar. Seçilebilir belirteçleri uyararak, TDS yöntemi çeşitli floresan proteinlerin seri olarak eklenmesine veya fenotipik analizler için TDS tabanlı gen silme ile TDS tabanlı etiketlemenin kombinasyonuna izin verir29. Bu yaklaşımın yararı için bir örnek olarak, virüs çekirdeklerini ve WV zarını etiketleyen çift etiketli bir floresan virüs oluşturuldu. Bu virüsle yapılan görüntüleme çalışmaları, virüs replikasyon sırasında virüsün hareketini, morfogenezini ve sarılmasını incelemek için kullanılabilir. Henüz keşfedilmemiş vaksinia viral proteinleri de bu teknikle etiketlenebilir ve incelenebilir.
Vaksinia virüsü, canlı hücreli mikroskopiye elverişli olan virüsün birçok özelliği nedeniyle görüntüleme çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Floresan etiketler viral genomdan ifade edilir, transfeksiyon ihtiyacını ortadan kaldırır, enfekte hayvanlardan veya dönüştürülemez hücrelerden elde edilen birincil hücrelerin kolayca analiz edilmesine olanak tanır. Başlangıçta, floresan VACV'ler virüs hareketinin basit hücre altı takibi için kullanıldı30, ancak daha yeni yaklaşımlar FRET çalışmaları31, tek virüs parçacıklarında FRAP32, promotör muhabirleri33, intravital görüntüleme34ve yapısal çalışmalar35-37'yi içerecek şekilde yardımcı programını genişletti. Tüm bu teknikler, rekombinant floresan virüsler oluşturma yöntemi ile birlikte daha kolay ve daha yakın ulaşılabilir olabilir.

Vaksinia virüsü (VACV) prototipik poksvirüstür ve çiçek hastalığının etken maddesi olan variola virüsü ile oldukça ilişkilidir. Bu virüslerin her ikisi de maymunpox ve ektromelia virüsü (mousepox)1gibi diğer önemli patojenleri içeren ortopedi cinsinin üyeleridir. Ortopediksler, tahmin edilen 200 açık okuma çerçevesinin2,3'ünekadar kodlayan büyük çift iplikli DNA genomlarına (180-220 kb) sahiptir. Bu virüslerin replikasyonu, olgun virüslerin (MV) yapıldığı bir perinükleer virüs fabrikasının ve MV'nin bir alt kümesinin sarılmış virüsler (WV) oluşturmak için iki ek membran edindiği trans-Golgi ağının oluşumunu içerir (Roberts ve Smith4tarafından incelenmiştir). Ortopedik genomlar, VACV genom replikasyonunun bir özelliği olan ve viral DNA polimeraz5tarafından aracılık edilen yüksek derecede genetik rekombinasyon nedeniyle genetik manipülasyona oldukça elverişlidir. Rekombinant virüslerin üretilmesi, vaksinia virüslü hücrelerde rekombinasyona aracılık etmek için yeterli olan 12 bp kadar küçük homologlara sahip homolog rekombinasyon ve doğrusal DNA moleküllerine dayanır6. Vaksinia virüsünün floresan etiketlemesi, virion başına birçok floresan proteinin birleştirilmesine izin veren ortopedik parçacıkların büyüklüğü nedeniyle son derece parlak virüs parçacıkları verebilir7. Vaccinia, yabancı DNA8'in büyük parçalarını taşıma kapasitesine sahiptir ve ayrıca, sert kapsid simetri eksikliği, endojen loci9'larındanviral protein gen füzyonlarını ifade ederken bir dereceye kadar esneklik sağlayabilir. VACV proteinlerinin floresan etiketlemesi, özellikle virüs girişi10, transport 11-13ve morfogenez, özellikle sarılmış virionlar7alanında, hücre altı düzeydekonak-patojenetkileşimlerinin incelenmesi için paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır.
Rekombinant virüsler zayıflatılmış büyüme fenotipi14,15, metabolik seleksiyon16-18veya bir işaret geninin ekspresy ekspresyasyonu ile seçilebilir (örneğin X-gal19 veya floresan protein13,20). Burada floresan ve metabolik seçimin güçlü bir kombinasyonunu kullanarak floresan virüslerin seçimini açıklıyoruz. Faulkner ve Moss (1990)21tarafından geliştirilen geçici baskın seleksiyon (TDS) vektörleri, işaretleyicilerin istenen floresan etiketli ilgi geni ile birlikte entegre edilmesine izin verir. Metabolik seleksiyon çıkarıldığında, seçim genlerini ekseren, ancak floresan etiketli virüs proteinini sağlam bırakan ikincil bir rekombinasyon olayı meydana gelebilir. Aşağıdaki Şekil 2 deneysel prosedüre genel bir bakış sunmaktadır. Bu çalışmada kullanılan seçim genleri mCherry ve Escherichia coli guanine fosforibosyltransfeaz(gpt)genidir, her ikisi de sentetik erken / geç viral promotörden ifade edilir ve daha önce Cordeiro ve ark. 22 Ek olarak, ilgi çekici etiketli füzyon proteininin floresan vardır. Metabolik seçim kaldırıldığında, seçilebilir belirteçler (mCherry ve gpt) çıkarılır, sadece doğru rekombinant virüslerin tanımlanmasına izin veren etiketli genin floresanını bırakır. Seçim işaretleyicilerinin eksizyonu, birden fazla floresan etiketi birleştirme imkanı sağlar ve aynı anda birkaç viral proteini floresan olarak etiketleme yeteneğine sahip virüsler oluşturmamızı sağlar. Önceki çalışmalar, vaksinia virüslü hücrelere transklüzyona bulaşan doğrusal ve dairesel DNA moleküllerinin vaksinia rekombinasyonu için minimum homoloji gereksinimlerinibelirlemiştir 6. Gpt-mCherry TDS vektöründeki farklı homoloji uzunluklarındaki kanatlanma kollarının rekombinasyon verimliliklerini vaccinia viral genomuna dahil edilmesi yoluyla belirlemek istedik. TDS vektöründeki 100 bp'lik homolog bölgelerin, homolog rekombinasyon ile rekombinant DNA'nın VACV genomuna yerleştirilmesini hedeflemek ve aracılık etmek için yeterli olduğu belirlenmiştir (Şekil 4). Daha küçük homoloji uzunlukları da rekombinasyona olanak sağlarken, 100 bp homoloji uzunlukları metabolik ve floresan seçimle kolayca tanımlanabilecek yeterli rekombinant virüs sağladı. Bu büyüklükteki DNA parçaları nispeten düşük maliyetle ticari olarak sentezlenebilir ve rekombinant virüslerin oluşturulması için birden fazla vektörün üretimini büyük ölçüde kolaylaştırır. Yan bölgelerin oligonükleotid dizisinin sentez maliyetlerini düşük tutarken daha fazla rekombinasyon sıklığı sağlamak için homoloji uzunluğunu 150 bp'ye çıkarmayı tercih ettik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mycophenolic acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3536-50MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 0.1N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xanthine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X0626-5G</td>
			<td>Dissolve in 0.1N NaoH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE HD transfection reagent</td>
			<td style="width:95px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td>
			<td style="width:95px;">Olympus, Chroma</td>
			<td style="width:119px;">BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

Viral proteinlerin floresan proteinlerle etiketlenmesi, virüs konak etkileşimleri anlayışımızı ilerletmek için vazgeçilmez bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. Çiçek hastalığının yok edilmesinde kullanılan canlı aşı olan Vaksinia virüsü (VACV), büyük virion büyüklüğü ve genom seviyesinde mühendislik kolaylığı nedeniyle floresan canlı hücreli mikroskopiye özellikle elverişlidir. Burada rekombinant virüsler üretmek için optimize edilmiş bir protokol bildiriyoruz. Yapı oluşturmanın basitleştirilmesine izin veren vaksinia replikasyonu sırasında hedeflenen homolog rekombinasyon için minimum gereksinimler belirlendi. Bu, geçici baskın seçimin (TDS) floresan bir muhabir ve metabolik seçim ile ittifakının, floresan olarak etiket viral proteinlere hızlı ve modüler bir yaklaşım sağlamasını sağladı. Floresan rekombinant virüslerin neslini kolaylaştırarak, virüs replikasyonu sırasında ortaya çıkan virüs ana bilgisayar etkileşiminin birçok yönünün gelişmiş görüntüleme analizi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırabiliyoruz.

Şekil 1, bu yordam için gerekli olan ve sentezlenen (Şekil 1b ve 1c) veya klonlama adımlarıyla oluşturulan çeşitli yapıları listeler (Şekil 1d). Şekil 2, seçim sürecinin her adımı için gösterilen bir A3-GFP rekombinant VACV'nin temsili floresan plak görüntüleri ile deneysel prosedürün bir taslağını sağlar. Şekil 3'te, sırasıyla iç virüs çekirdeği23 ve dış zarf24'ünbir parçası olan viral yapısal proteinler A3 ve F13'ü hedefleyen floresan belirteçlerle etiketlenmiş proteinleri ifade eden rekombinant vaksinia virüsleri gösterilmiştir. Oluşturulan rekombinant virüslerin her biri için viral plakların ve enfekte hücrelerin gözlemleri tasvir edilir. Vektörlerin VACV genomuna homolog rekombinasyonunun verimliliği test edilmiş ve sonuçlar Şekil 4'tetasvir edilmiştir. 100 bp homoloji içeren vektörlerle rekombinasyondan yapılan viral plakların tanımlanmasının göreceli başarısı, 150 bp uzunluğundaki sol ve sağ homoloji kollarını hedef gen haline sentezlemeyi seçmenin arkasındaki nedendi.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Şekil 1. Geçici Dominant Seçim (TDS) rekombinasyon vektörü. (a) GPT ve mCherry seçim işaretleyicileri ile TDS vektörü. (b) Homolojinin sol ve sağ kolları, homoloji kollarının arasında ve yanında belirli kısıtlama bölgeleri ile tasarlanmıştır. Bu yöntemde kullanılan sol ve sağ kollar arasındaki kısıtlama bölgeleri NotI ve BamHI, NotI sitesi de gen ve floresan etiketi arasında bir bağlayıcı olarak kullanılmaktadır. (c) Bu yöntemle uyumlu floresan etiketler ilgili kısıtlama siteleri tarafından kuşatıldı. Kullanılan bazı etiketler GFP (yeşil floresan protein), RFP (kırmızı floresan protein), Cerulean (EKFP üzerinde bir gelişme, bir camgöbeği floresan proteini, haline yönlendirilmiş mutagenezi25tarafından) ve aydınlatma26'daEM tarafından çözülebilir bir ürün oluşturan GFP'den tasarlanmış bir floresan protein olan mini SOG'dir. (d) Son TDS rekombinasyon vektörün üretilmesinde rol oynayan adımları klonlama. Sol ve sağ yan kolları içeren sentezlenmiş oligonükleotid ilk olarak TDS vektörüne klonlanır. Bu, sol ve sağ kollar arasında bulunan kısıtlama sitelerine klonlanarak herhangi bir seçim etiketinin içeri ve dışarı mekik dokuyabileceği bir rekombinasyon vektörü sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Şekil 2. Rekombinant vaksinia virüsü oluşturmak için deneysel prosedürün ana hatları. Genetik ve hücresel düzeyde meydana gelen olaylar, A3-GFP etiketli floresan vaksinia virüsünün oluşturulmasını takip eden adımları özetleyen temsili plak görüntüleri ile birlikte tasvir edilir. (A) Vaksinia virüsü ile enfekte olan hücreler TDS rekombinasyon vektörü ile transkriptörlenir. (B) Bu şekilde, yalnızca sol rekombinasyonun sonucu gösterilmiştir ve örnek GFP'yi tercih edilen floresan etiketi olarak kullanır. Sağ el rekombinasyonu, tüm TDS plazmidinin genoma benzer şekilde dahil edilmesine neden olur, ancak etiket ara adımda, yani C adımında tüm hedef genle kaynaşır. Rekombinasyon karışımı ile bir hücre monolayer üzerinde plak tahlili yapılır ve GPT seçimine tabi tutulur. (C) Sırasıyla mCherry ve GFP ekspresyonlarına karşılık gelen hem kırmızı hem de yeşil floresan sergileyen plaklar toplanır ve yükseltilir. Seçim kaldırıldıktan sonra, gpt ve mCherry genlerinin(D)kaybına karşılık gelen kırmızı floresan kaybı olacaktır ve sadece yeşil floresan sergileyen plaklar toplanır ve yükseltilir (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Şekil 3. TDS rekombinasyon sisteminin temsili sonuçları. Görüntüler, 48 saat sonra(a, c, e; ölçek çubuğu 100 μm) hücreleri enfekte eden rekombinant VACV'nin tüm plaklarını, karşılık gelen rekombinant virüsün 8 saat sonra enfekte ettiği tek bir hücrenin görüntüsü eşliğinde(b, d, f; ölçek çubuğu 10 μm) tasvir eder. Virüs parçacıklarını görselleştirmek için virion lokalize proteinlere karşılık gelen genler seçildi. A3, vaksinia virionunun (a, b) çekirdek proteinidir ve F13 (c, d) viral bir zarf proteinidir. Hem floresan olarak A3 hem de F13 (e, f) etiketli çift etiketli bir virüs de gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Şekil 4. Rekombinant vektörler ile VACV genomları arasındaki rekombinasyon verimliliklerinin nicel analizi. BS-C-1 monolayerleri VACV ile enfekte oldu ve VACV genomuna 500 bp, 100 bp veya 70 bp homoloji bölgeleri içeren üç rekombinasyon vektörü ile enfeksiyon sonrası 1 saat trans enfekte oldu. Her vektör ayrıca gpt ve mCherry seçim genlerinden oluşan TDS kasetini de içeriyordu. Hücreler enfeksiyondan 24 saat sonra kurtarıldı ve oluşan rekombinant virüsleri serbest bırakmak için lysed edildi. GPT seçim ortamı ile hücre lysates üzerinde plak tahlilleri yapıldı ve mCherry floresan gösteren plaklar başarılı rekombinantlar olarak sayıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Şekil 5. Birden çok klonlama sitesini gösteren gpt-mCherry TDS vektörün haritası. Vektör daha önce22 olarak tanımlanmıştır ve vektör haritası Zhang Lab Group'tan (SCU) EZ Plasmid Map v1.9 yardımıyla oluşturulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins at JoVE.com

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Görüntüleme.  University of Sydney. Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Video: Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Egzersizle indüklenen Lenfosit Apoptoz belirlenmesi için parmak sopa Kan Örnekleme Metodolojisi

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...