Biz ona destek ve sorun giderme verimli tartışmalara katılım için tüm Sigma Hayat Bilgisi Misyon Hedef Kimliği Kütüphane geliştirme ekibi, özellikle teknoloji bulmak ve lisans koşullarını müzakere Kevin Gutshall ve Heather Holemon teşekkür ederiz. Biz de özgürce klonlanmış almak büyük bir cDNA parti ve onun kalıcılığını hazırlamak için yayımlanmamış sonuçlar ve öneriler ve RxBiosciences ve Gazi Hamid paylaşımı için King College London Dr Joop Gäken teşekkür ederim. Biz cDNA dizileri ve veri analizi gerçekleştirmek için SAFC gelen Nan Lin ve Scott Bahr kabul etmek istiyorum. MİSYON Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP tescilli markasıdır

<ol>
	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li><li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desperately+seeking+microRNA+targets.">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li><li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li><li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer.">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li><li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-221+and+miR-222,+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas,+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle.">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene.">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncoding+RNA,+miR-126,+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers.">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Yazarlar gönderilen eser bir ilgi ticari kuruluşlar ile mali ilişkileri beyan ederim.

microRNA inhibe mRNA çeviri post-transkripsiyonel gen ekspresyonu düzenleyen ve sık sık, hedeflenen mRNA ([6] Yorumlar) istikrarsızlaştırma 20-24 nükleotid RNA&#39;lar vardır. Tek miRNA gelişimsel ve çevresel sinyallere bir hücre tepkisi kontrol etmek için birçok yüz mRNA&#39;ların düzenleyebilir. Belirlenmesi ve hedef mRNA doğrulayarak bu yolları bir miRNA rolü ve fonksiyonu belirlemede önemlidir. Hayvanlarda, miRNA&#39;lar ve hedef siteler tamamen tamamlayıcı değildir, çünkü Ancak, hedef tespit kolay değildir. &quot;Tohum&quot; bölge, miRNA ve 5&#39;-ucundan 2 ile 7 arasındaki dayandırır, genelde hedeflerini tamamlayıcısı oluyor. Ancak, tohum kuralın pek çok istisnası vardır ve taban-eşleştirme aşağı bir kusurlu tohum maçı telafi edebilir. Bilgisayar algoritmaları Bir çok tohum eşleştirme ve mansap tazminat, hedef yapısına dayalı miRNA hedefleri tahmin etmek geliştirilmiştird konumu, sıra korunması ve deneysel olarak doğrulanmış hedefler ([7] Yorumlar) için gözlenmiştir diğer çeşitli parametreler. Öngörüleri uygun olan ve tanımlamaya pek çok geçerli miRNA hedefleri do silico iken, en genler deneysel doğrulama testleri başarısız ve birçok gerçek hedefleri tahmin edilmiyor öngördü. Bilgisayar algoritmaları önceden belirlenmiş hedef özelliklere dayalı Dahası, bunlar zaten bilinen sapan hedeflerin keşfi izin vermez. Deneysel sistem bir dizi canlı hücrelerin işlevsel miRNA hedefleri belirlemek veya keşfetmek için başarıyla kullanılmaktadır. Bu küresel tarama yöntemleri mikroarrayler ve RNA sıralama, RNA co-immünopresipitasyon (RIP), ve Hücre kültüründe Amino asitler ile Kararlı İzotop Etiketleme (SILAC), bir proteomik yöntemi ([7] &#39;de gözden) içerir. Her yöntemin avantajları ve dezavantajları vardır. Hedefleme miRNA genellikle mRNA oynattığını ve onun bozulması, kaybolması o yol açar yanaBir miRNA sırasıyla, taklit ya da inhibitör tanıttıktan sonra mRNA düzeyinde r kazanç, miRNA hedefler belirleyebilir. MRNA Bu kaybı veya kazancı kolaylıkla mikroarray veya derin sekanslama tarafından tespit edilir. MRNA algılama yöntemleri basit ve protein tespit yöntemleri daha duyarlı iken, mRNA algılama bozulmuş olmayan herhangi bir miRNA hedefleri özleyeceğim. SILAC gelenler RNA algılamayı miRNA hedef sonuçlarını karşılaştırarak Bartell laboratuvar gelen son haberler [8] veya ribozom profilleme [9] memeli miRNA&#39;lar ağırlıklı hedef mRNA düzeylerini azaltarak etki gösterir. Ancak, bireysel miRNA hedefleri ile çalışan diğer birçok laboratuvarlarında protein değişir ama mRNA düzeyinde herhangi bir değişiklik tespit ettik. Saptanabilir mRNA kaybı ile translasyonel düzenlemesi için ne görünür Raporları şunlardır: miR-10b HOXD10 [10] p27kip1 üzerine, miR221/222 [11] Pdcd4 üzerine, miR-21 [12], miR-126 p85β üzerinde [13] , SIRT1 üzerine miR-34 [14] PTEN [15], miR-302d Arid4b [16], miR-200C JAG1 [17], ve miR-299, 297, 567, bir üzerine, miR-21VEGFA üzerine nd 609 [18]. Ayrıca, Clancy ve ark [19] yakın let-7 hedef sitesi içeren bireysel mRNA izoformları seçici tespit edildiğinde let-7 tarafından translasyonal yönetmelik sadece tespit edildiğini bildirdi. Tüm mRNA izoformları bir mRNA olarak tespit edildiğinde yani, - - kadar mikroarray ve sekans analizi ile elde edilen ikinci en azından bazı durumlarda, translasyon düzenlemesi, bir kompozit profili göz ardı edilebilir, göstermektedir. Argonaute (genellikle ago2) veya başka bir ilişkili protein (RNA immünopresipitasyon veya RIP) ile miRNA-mRNA komplekslerinin Co-immünopresipitasyon bağımsız regülasyon mekanizması miRNA hedefleri izole olacaktır. Ayrıca, RIP, etkileşimleri endojen ve muhtemelen biyolojik ilgili algılar. Ancak, tüm miRNA-mRNA etkileşimleri fonksiyonel olup, RIP, yalnızca geçici ilişkilendirmek veya hızla bozulmuş olan herhangi bir mRNA hedefleri kaçıracağı olup olmadığı bilinmemektedir. Ayrıca, özel miRNA-mRNA ortakları bioinformati varılabilir gerekirTüm miRNA-mRNA çiftleri birlikte co-çöktürülmüş Cally çünkü. Son olarak, SILAC doğrudan miRNA düzenlemesi, protein kendisinin son ürün tanımlar, fakat duyarsız olduğunu ve bu nedenle nadir proteinler ve protein düzeyleri küçük değişiklikler kat bahsi. Mevcut miRNA hedef belirleme yöntemleri ile sınırlamalar ışığında, biz alternatif bir mekanizma ile fonksiyonel miRNA hedefleri belirlemek için ek bir küresel analiz ihtiyaç hissettim. Bu ihtiyacı karşılamak üzere, Joop Gaken ve King s College London Azim Mohamedali tarafından icat edilmiş bir teknoloji lisanslı. Bunların buluş, bir çift seçimi füzyon proteini olup, özellikle, bir timidin kinaz-zeocin füzyon, onun 3&#39;UTR potansiyel miRNA hedef dizilerinin bir cDNA kütüphanesi düzenlenir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, stabil bir şekilde TKzeo-yapıları cDNA ile transfekte edilmiş ve eksprese eden hücreler, zeocin seçilebilir. Bir ilgi miRNA ifade ettikten sonra, bu miRNA hedefleri wi seçilebilirth gansiklovir, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Gansiklovir, herhangi bir hücre ilgi miRNA için bir hedef yoksun TKzeo-cDNA ifade edilir timidin kinaz, Salgılayan hücrelerin öldürür. Hedeflenen cDNA kanadını cDNA ve PCR ürünleri hedefleri tespit etmek için diziliş edilebilir gansiklovir kullanılarak hayatta primerler hücrelerinden DNA&#39;nın PCR amplifikasyonu ile izole edilebilir. MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane - Fonksiyonel insan miRNA hedeflerinin küresel kimlik ve keşif için yeni bir araç haline King &#39;s College teknolojisi geliştirdi. Hedef Kimliği Kütüphane ile kullanıcılar, memeli hücre kültürü transfeksiyon ve ilaç seçimi bir dizi adım tarafından miRNA hedefleri ayırabilirsiniz. Kütüphane kapsamlı olduğunu ve insan genlerinin% 66-79 içerir. İlk sonuçlar, hem daha önce keşfedilen yanı sıra yeni hedefler MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane izole edilebileceğini göstermektedir. Protokolü, bazı uzunluğunun olmasına rağmenmemeli hücre kültürü, transfeksiyon, ilaç seçimi, PCR ve sıralama - - Hedef Kimliği Kütüphane kullanımı standart moleküler laboratuvar teknikleri gerektirir ve bu yüzden biyologların çoğu, araçlarının içinde de olmalıdır. Biz yeterince ilgi kültür koşullarının optimize, uygun deneysel tasarım için para ve en önemlisi, Hedef Kimliği Kütüphanesi ile başarı sağlamak için seçim adımları (kill-eğrileri) için optimum ilaç düzeylerini belirlemek için her yeni hücre tipi ön test edilmesini önerme. Tüm miRNA hedef tanımlama yöntemleri olduğu gibi, son derece Hedef Kimliği Kütüphane eleme tarafından belirlenen hedefler gibi mikroarray, QRT-PCR, reporter assay (yani, lusiferaz) veya Batı analizi gibi ikinci bir yöntem ile doğrulanması önerilir.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Gansiklovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> Memeli Genomik DNA Miniprep Takımı GenElute </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre Özgül Nucleofection ko </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Hedef Kimliği Kütüphane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

Hedef Kimliği Kütüphane mikroRNA keşif ve kimlik (miRNA) hedeflerine yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Hedef Kimliği Kütüphane çift seçimi füzyon proteini, timidin kinaz-zeocin (TKzeo) den 3&#39;UTR aşağı klonlanmış bir plazmid tabanlı, genom cDNA kütüphanesi olduğunu. Seçimin ilk turunda, istikrarlı transformantlar için bir ilgi miRNA tanıtımı ile takip, ve nihayet, miRNA hedefi içeren cDNAlarının için seçimi olduğunu. Seçilen cDNAlarının sıralama (Hedef Kimliği Kütüphane İş Akışı ve ayrıntılar için bkz. Şekil 1-3) ile tanımlanır. Insan transcriptome geniş kapsama sağlamak için, Hedef Kimliği Kütüphane cDNAlarının birden fazla insan doku ve hücre hatları hazırlanan toplam RNA havuzu kullanarak oligo-dT astar ile oluşturulmuştur. 1.2 kb arasında bir ortalama boyutu olan, 0.5 ile 4 kb için cDNA aralığı çıkan ve (plazmid haritası için bakınız Şekil 4) p3TKzeo ikili seçme plasmid içine klonlandı. Li temsil gen hedefleribrary Sigma-Aldrich web sayfasında bulunabilir. Illumina sekanslama (Tablo 3), elde edilen sonuçlar, kütüphanesi UCSC RefGene içinde 21.518 eşsiz genlerin 16.922 (% 79), ya da 10 ya da daha fazla okur (% 66) ile 14.000 genler dahil olduğunu göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

genome-wide-screen-for-mirna-targets-using-mission-target-id

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K Görüntüleme.  Sigma-Aldrich. Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.