Ringraziamo tutta la vita Sigma Science Mission Obiettivi ID squadra Biblioteca di sviluppo, in particolare Kevin Gutshall per trovare la tecnologia e negoziare i termini della licenza, e Heather Holemon per il suo sostegno e la partecipazione alle discussioni fruttuose risoluzione dei problemi. Ringraziamo anche il Dott. Joop Gäken di King College di Londra per la libera condivisione dei risultati inediti e suggerimenti, e Hamid Qazi di RxBiosciences per preparare un grande lotto di cDNA e la sua persistenza nel ottenerlo clonato. Vorremmo riconoscere Nan Lin e Scott Bahr da RdC per l&#39;esecuzione di array di cDNA e analisi dei dati. MISSION è un marchio registrato di Sigma-Aldrich Biotecnologie LP

<ol>
	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li><li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desperately+seeking+microRNA+targets.">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li><li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li><li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer.">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li><li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-221+and+miR-222,+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas,+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle.">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene.">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncoding+RNA,+miR-126,+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers.">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Gli autori dichiarano rapporti finanziari con gli enti commerciali che hanno un interesse per il lavoro presentato.

microRNA sono 20-24 nucleotidi RNA che regolano l&#39;espressione genica post-trascrizionale di mRNA inibendo traduzione, e spesso, destabilizzando l&#39;mRNA bersaglio (recensione in [6]). Un singolo miRNA può regolare centinaia di mRNA per controllare la risposta di una cellula di segnali di sviluppo e ambientali. Identificazione e validazione mRNA bersaglio è essenziale per determinare il ruolo di un miRNA e la funzione in queste vie. Tuttavia, l&#39;identificazione di destinazione non è semplice perché, negli animali, i miRNA ei loro siti bersaglio non sono del tutto complementari. La regione &quot;seme&quot;, si basa da 2 a 7 dalla 5&#39;-end del miRNA, di solito è complementare ai suoi obiettivi. Tuttavia, ci sono molte eccezioni alla regola seme, ed a valle di base di accoppiamento in grado di compensare per una partita di semi imperfetta. Un certo numero di algoritmi informatici sono stati sviluppati per prevedere obiettivi miRNA basate sulla corrispondenza dei semi e la compensazione a valle, struttura di destinazione unoposizione d, conservazione della sequenza, e vari altri parametri che sono stati osservati per i target validati sperimentalmente (recensione in [7]). Mentre in silico previsioni sono convenienti e fare identificare numerosi obiettivi miRNA validi, la maggior parte dei geni non prevede test di validazione sperimentale, e molti obiettivi reali non sono previsti. Inoltre, poiché gli algoritmi informatici sono basate su bersaglio precedentemente determinate, non consentono scoperta di bersagli che si discostano da ciò che è già noto. Un certo numero di sistemi sperimentali sono stati utilizzati con successo per identificare o scoprire bersagli funzionali miRNA nelle cellule viventi. Questi metodi di screening globali includono microarray e sequenziamento RNA, RNA co-immunoprecipitazione (RIP), all&#39;imballaggio e all&#39;etichettatura isotopi stabili di aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC), un metodo proteomico (recensione in [7]). Ogni metodo ha vantaggi e svantaggi. Dal momento che miRNA di mira spesso destabilizza un mRNA e porta alla sua degradazione, perdita ogain r in livello di mRNA, dopo l&#39;introduzione di un miRNA imitare o inibitore, rispettivamente, in grado di identificare bersagli miRNA. Questa perdita di guadagno o mRNA viene prontamente rilevata da microarray o sequenziamento profondo. Mentre i metodi di rilevazione di mRNA sono più semplici e più sensibili rispetto ai metodi di rilevazione delle proteine, rilevamento mRNA mancherà tutti gli obiettivi miRNA che non sono degradati. Recenti rapporti dal laboratorio Bartell confrontando i risultati bersaglio miRNA dal rilevamento RNA con quelli provenienti da SILAC [8] o profiling ribosoma [9] indicano che i microRNA di mammifero prevalentemente agiscono riducendo i livelli di mRNA bersaglio. Tuttavia, molti altri laboratori che lavorano con gli obiettivi di miRNA individuali hanno rilevato cambiamento di proteine, ma nessun cambiamento nel livello di mRNA. Rapporti di quelli che sembrano essere regolazione traduzionale senza perdita di mRNA rilevabile comprendono: miR-10b su HOXD10 [10], il miR221/222 p27Kip1 [11], miR-21 in Pdcd4 [12], miR-126 su p85β [13] , miR-34 in SIRT1 [14], miR-21 in PTEN [15], miR-302d su Arid4b [16], miR-200c su JAG1 [17], e miR-299, 297, 567, unond 609 sulla VEGFA [18]. Inoltre, Clancy et al [19] ha recentemente riferito che la regolamentazione traslazionale dal let-7 è stato rilevato solo quando i singoli isoforme di mRNA che contengono il sito di let-7 di destinazione sono stati rilevati in modo selettivo. Quest&#39;ultimo suggerisce che, almeno in alcuni casi, regolazione traduzionale può essere trascurata in un profilo composito - cioè, quando tutte le isoforme di mRNA vengono rilevati come un mRNA - come ottenuta con microarray molti e analisi della sequenza. Co-immunoprecipitazione di complessi miRNA-mRNA tramite Argonaute (di solito Ago2) o un&#39;altra proteina associata (RNA immunoprecipitazione, o RIP) isolerà obiettivi miRNA indipendentemente dal meccanismo di regolazione. Inoltre, rileva RIP endogena, e presumibilmente biologicamente rilevanti, interazioni. Tuttavia, non è noto se tutti i miRNA-mRNA interazioni sono funzionali, e RIP avrebbe perso tutti gli obiettivi di mRNA che associano solo transitoriamente o sono rapidamente degradato. Inoltre, specifici miRNA-mRNA partner deve essere dedotto bioinformatimente perché tutti i miRNA-mRNA coppie di co-precipitato insieme. Infine, SILAC identifica direttamente il prodotto finale della regolamentazione miRNA, la stessa proteina, ma è insensibile e manca quindi proteine ​​rare e piccole modifiche volte dei livelli di proteine. Alla luce delle limitazioni con i metodi attuali miRNA bersaglio di identificazione, ci siamo sentiti un test aggiuntivo globale per identificare gli obiettivi miRNA funzionali da un meccanismo alternativo era necessario. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo concesso in licenza una tecnologia inventata da Joop Gaken e Azim Mohamedali di King College di Londra. La loro invenzione è un doppio proteina di fusione di selezione, in particolare, una chinasi-timidina zeocin fusione, regolata da una libreria di cDNA di sequenze bersaglio potenziali miRNA nella sua 3&#39;UTR. Cellule stabilmente trasfettate con esprimendo TKzeo-cDNA costrutti possono essere selezionati con zeocin, come illustrato in Figura 2. Dopo aver espresso uno miRNA di interesse, obiettivi che miRNA possono essere selezionati with ganciclovir, come illustrato in Fig. 3. Ganciclovir uccide le cellule che esprimono timidina chinasi, che è, le cellule che esprimono TKzeo-cDNA mancanza di un obiettivo per il miRNA di interesse. Mirato cDNA può essere isolato mediante amplificazione PCR di DNA da cellule che sopravvivono ganciclovir utilizzando primer che fiancheggiano i prodotti di cDNA, e PCR possono essere sequenziati per identificare bersagli. Abbiamo sviluppato una tecnologia Collegio del Re in un nuovo strumento per l&#39;identificazione globale e la scoperta di obiettivi funzionali miRNA umani - il Target Biblioteca MISSIONE ID. Con l&#39;ID della libreria di destinazione, gli utenti possono isolare bersagli miRNA da una serie di transfezione mammiferi coltura cellulare e fasi di selezione di droga. La Biblioteca è completo, e contiene 66-79% dei geni umani. I primi risultati indicano che sia già scoperto così come nuovi obiettivi può essere isolato dalla libreria ID MISSIONE Target. Sebbene il protocollo sia di una certa lunghezza,l&#39;utilizzo della Libreria ID di destinazione richiede tecniche standard di laboratorio molecolari - colture cellulari di mammifero, trasfezione, la selezione dei farmaci, PCR, e il sequenziamento - e quindi, dovrebbe essere ampiamente nelle possibilità della maggior parte dei biologi. Suggeriamo che l&#39;attenzione sufficiente attenzione alla corretta progettazione sperimentale, ottimizzando le condizioni di coltura, e, soprattutto, pre-test di ogni tipo di nuova cella per determinare i livelli di farmaco ottimali per fasi di selezione (kill-curve) per assicurare il successo con la Libreria ID Target. Come con tutti i metodi di miRNA bersaglio di identificazione, è altamente raccomandato che gli obiettivi individuati dalla screening della Biblioteca ID di destinazione essere convalidato con un secondo metodo, come ad esempio microarray, qRT-PCR, test reporter (cioè, luciferasi), o analisi occidentale.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute mammiferi Genomic DNA Kit Miniprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Cella k Nucleofection specificoessa </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Obiettivo ID Biblioteca </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

La Biblioteca ID di destinazione è stato progettato per aiutare a obiettivi di individuazione e identificazione dei microRNA (miRNA). La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide libreria di cDNA clonato nei 3&#39;UTR valle del dual-selezione proteina di fusione, la timidina chinasi-zeocin (TKzeo). Il primo turno di selezione è per trasformanti stabili, seguita con l&#39;introduzione di un miRNA di interesse, e, infine, selezionando per cDNA contenenti obiettivo del Mirna. CDNA selezionati sono identificati mediante sequenziamento (si veda la Figura 1-3 per flusso di lavoro Biblioteca ID Target e dettagli). Per garantire un&#39;ampia copertura del trascrittoma umano, Target ID Biblioteca cDNA sono stati generati tramite oligo-dT priming con un pool di RNA totale preparati da diversi tessuti umani e linee cellulari. CDNA risultante intervallo da 0,5 a 4 kb, con una dimensione media di 1,2 kb, e sono stati clonati nel dual-selezione p3TKzeo plasmide (vedi figura 4 per la mappa del plasmide). Gli obiettivi gene rappresentati nel library si possono trovare sul sito Sigma-Aldrich. I risultati di sequenziamento Illumina (Tabella 3), mostra che la biblioteca comprende 16.922 dei 21,518 geni unici in UCSC RefGene (79%), o 14.000 geni con 10 o più letture (66%).

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide collezione di cDNA clonati utilizzati per identificare gli obiettivi miRNA. Qui mostriamo il suo utilizzo ed applicazione.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

genome-wide-screen-for-mirna-targets-using-mission-target-id

Research

JoVE Journal

Biology

17.4K Views.  Sigma-Aldrich. La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide collezione di cDNA clonati utilizzati per identificare gli obiettivi miRNA. Qui mostriamo il suo utilizzo ed applicazione.