We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

protokol aşağıda C57BL / 6 ve C3H / He (retinally dejenere) Fare nöronal doku hazırlanmasını tarif, ancak benzer teknikler diğer türlere uygulanabilir. Bütün hayvanlar, sağlıklı ve standart sıcaklık koşulları, nem, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde, yiyecek ve suya serbest erişim ile ele ve herhangi bir amacıyla güç uyaran olmadan. Bütün deneyler onaylanmış ve Batı Sydney Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik komitesi göre yapılan ve hayvan kullanımı ve bakımı ana hatları (Hayvancılık Araştırma Kurumu # A9452, # A10396 ve # A8967) göre edildi. 1. Beyin Dilim Hazırlık <ol><li> izofluran (% 5) inhalasyon yoluyla hayvan anestezisi ve bir kemirgen giyotin kullanarak başını kesmek. Daha önce 9 tarif edildiği gibi hızlı bir şekilde beyin çıkarın ve buz gibi soğuk fizyolojik çözelti (ACSF) (mM olarak) içine yerleştirin: 125 NaCl, MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 25 2.5 KCI, 1NaHCO 3, 25 dekstroz ve karbojen ile doyurulmuş (% 95 O 2/5% CO2 karışımı 310 mOsm, pH 7.4). </li><li> titreşimli mikrotom ile 300 mikron kalınlığında, ilgilenilen bölgede, beyin dilimleri kesin. </li><li> Daha önce 10, 11 açıklandığı gibi, carbogen akışı ve sıcaklık - yakından izler ve pH düzeyini (7.4 pH 7.2) kontrol eden bir özel inşa kuluçka sistemi dilim aktarın. </li><li> 15 ila 35 ° C, ilk reaktör sıcaklığı ayarlama - 30 dakika, ve daha sonra yavaş yavaş 15 azaltmak - Şekil 1C&#39;de gösterildiği gibi, 16 ° C. kadar gerekli sonra ya elektrofizyoloji veya görüntüleme için, kuluçka sisteminin dilimleri kuluçkaya yatmaktadır. NOT: dilimleri kalsiyum görüntüleme için kullanılacak ise, RT altında doku soğutmadan önce aşağıdaki adımları izleyin. </li></ol> 2. Retina Wholemount Hazırlama ve İç Limitan Membran Soyulması <ol><li> Ya normal koşullarda retina wholemounts hazırlayınlaboratuvar aydınlatma koşulları veya loş kırmızı / kızıl ötesi ışık. </li><li> servikal dislokasyon ve hemen aydınlatmak gözler hayvan Euthanize. Ames ortam veya ACSF içeren ya küçük ora serrata&#39;dan boyunca kesilmiş ve yer (mM) sağlayın: 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glukoz, 0.5 L-glutamin ve karbojen ile doyurun (2/5,% CO2 karışımı% 95 O, ~ 300 mOsm, pH 7.4) ilave edilir. </li><li> Hemen küçük bir makas ile ora serrata boyunca kesme ve forseps ile lens ve vitrözü ile kornea, lens ve vitrözü çıkarın. Oda sıcaklığında inkübasyon sistemi doku yerleştirin. Not: retinal doku 15 yavaş sıcaklık azaltma sonra, göz fincan korunabilir - ihtiyaç kadar inkübasyon sistemine&gt; 24 saat boyunca, 16 ° C. </li><li> Earl&#39;s- 30 U / ml papain, 1 mM L-sistin, 0.5 mM EDTA ve% 0.005 DNaz içeren küçük bir cam kavanoza retina içeren göz fincan transfer ILM kaldırmak için20 dakika için 37 ° C &#39;de dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS). Kapaktan çözüm% 95 O 2 /% 5 CO 2 uygulayın, ancak kabarcık yok. Genç hayvanların (&lt;6 hafta) doku kullanılırsa, yarı gücü seyreltilir. <ol><li> Earl BSS 10 dakika süreyle bir ovomukoid (10 mg / ml) ve BSA (10 mg / ml) çözelti içinde doku yerleştirerek, enzimatik sindirim durdurun. 16 ° C - Yıkama doku iyice aCSF ile inkübasyon sistemine aktarılmadan önce ve 15 sıcaklığını düşürmek. </li></ol></li><li> ihtiyaç kadar göz fincan retina dokusu korumak. mikroskop transfer için, göz bardaktan retina izole ve bir traş bıçağı ile 4 parçalar halinde kesilmiş. Tüm retina gerekiyorsa, düz yalan izin vermek için retinanın periferinde dört küçük kesikler yapın. NOT: görüntüleme deneyleri, kuluçka sistemine aktarılmadan önce kalsiyum boya ile yük için aşağıya bakın. </li></ol> 3. enkubatörde Doku bakımı <ol><li&gt; PH ve sıcaklık ölçümleri için sondaları (Şekil 1A, B) içeren ana odasında Yeri doku. </li><li> Çözelti içinde kayan bakteri saçmak için (5W / 2P sterilizatör UV lambası, 254 nm), ana bölmeden izole edilmiş ve UVC ışığı B 1.1 maruz (daha önce tarif edildiği gibi 12 inşa UVC odası), bir ikinci bölme ile aCSF sirküle (Şekil 1A). aCSF aşırı ısınmayı önlemek için 30 dakika - her 15 dk 15 ila 26 değişen zamanlarda ON döner rastgele özelliğini kullanarak programlanabilir zamanlayıcı ile kontrol UVC ışığı zamanlama. </li><li> 12 ml UVC odasında akış hızını ayarlamak / dk önce olduğu gibi 12 bildirdiler. nöronal dokulara zarar verebilir odasının dışında UVC aydınlatma önlemek için alüminyum folyo ile UVC odasına örtün. NOT: koyu adapte retina dokusunun için, ışık dışlamak için ana odaya ısmarlama kapak uygulayın. </li><li> Sirkü bir peristaltik pompa kullanmakte iki odaları aracılığıyla çözüm (CSF) ve 0 aralığında istenilen sıcaklıklara serin veya ana odayı ısıtmak birine soğutucu Peltier termoelektrik soğuk plaka - 50 ° C. Uzun vadeli canlılığı için 16 ° C - Optimum doku inkübasyon için, 15 kullanın. </li></ol> 4. Kalsiyum Boya Yükleme <ol><li> Bireysel araştırmacının tercihine göre kalsiyum boyalar seçin. Burada Fura-2AM, Flu-8 am veya Flu-4 am kullanın. Bununla birlikte, bu yöntem, aynı zamanda, diğer boyalar için uygulanabilir: 1 mM solüsyonu ve% 1 blok kopolimerleri DMSO içinde kalsiyum boyalar çözülür (örneğin, pluronik asit 127), 10 dakika boyunca son bir 50 uL hacmi ve sonikasyon. </li><li> Retina 10 uM, beyin kesitleri% 0.01 blok kopolimerleri ve 20 uM (retina),% 0.02 blok kopolimerleri nihai konsantrasyona aCSF çözüm ekleyin. F; 37 ° C (Fura-02:00) ya da oda sıcaklığında (Fluo-4 AM genç hayvanlarda, 45 dakika için banyo yükten retinae (papain muamele edilmiş) ve beyin dilimleriluo-08:00). <ol><li> yetişkin hayvanların, (&gt; 12 haftalık) için doğrudan beyin dilimleri üzerine boyalar (50 uL) pipet ve derin katmanlarına boyanın daha iyi nüfuz izin vermek için 75 dakika boyunca muhafaza edilir. </li><li> Boya inkübasyon sırasında su altı dilim yeterli oksijen sağlamak için, aCSF 2.5 mL içinde seyreltilmiş kalsiyum boyalar ile kapalı bir kapak (çap 2.5 cm, dairesel kavanoz, 3,5 cm yükseklik) olan bir cam yükleme bölmesine hazırlar. % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile sürekli oksijen. kabarcık etmeyin. </li></ol></li><li> Deneysel kullanıma kadar 16 ° C - boya yükleme sonrasında yavaş yavaş 15 sıcaklığını düşürmek, kuluçka sisteminin aCSF ve transfer ile doku yıkayın. </li></ol> 5. Elektrofizyolojik Kayıtlar ve Görüntüleme <ol><li> mikroskop altında dalgıç bir kayıt odasına doku yerleştirin ve 4 bir akış oranında oksijenli ACSF serpmek - RT (~ 22 ° C) ya da fizyolojik sıcaklıkta 5 mL / dakika, ya (~ 35 ° C). Holgerilir ve altın veya platin tel U şeklinde bir parça üzerinde yapıştırılmış bir naylon veya altın parçacıkları imal &#39;harp&#39; özel yapılmış kullanılarak yerine D dokusudur. </li><li> elektrofizyoloji için: <ol><li> 5-6 MQ nihai direncini elde etmek için bir mikropipet çektirmenin kullanarak 1.5 mm (1.19 mm ID) borosilikat cam kayıt pipetler hazırlayın. </li><li> Daha önce 13 açıklandığı gibi iç çözümü 4 mcL ve bir CCD kamera kullanarak kızılötesi Diferansiyel Girişim Kontrast (IR-DIC) altında hücrelerin görselleştirmek - 3 pipet doldurun. Hücre içi çözüm dikkatlice deneysel sonuçlar elde etmek için her bir deney uygun olmalıdır. </li><li> Pozisyon pipet, pozitif basınç korurken bir micromanipulator kullanarak bir hücre zarında yer alan, pipet tutucu bir emme portu aracılığıyla başvurdu. ILM retina kaldırıldı beri, önceden zar kazıma gereklidir. Pipet hücre üzerinde sonra, nazik negatif uygulamakpipet basınç gigaohm mühür elde etmek. Daha sonra bir negatif basınç kısa bir miktarı ile, hücre zarı yırtılabilir. </li><li> uygun şekilde standart teknikler kullanılarak bütün hücre akım-veya voltaj-kelepçe kayıtları sağlayın. </li></ol></li><li> Kalsiyum-görüntüleme: <ol><li> Fura-2 oran ölçer görüntüleme için, 340 nm ve 380 nm düzeyindeki uyarıcı dalga uzunluklannda sağlamak için bir ultra-yüksek hızlı dalga değiştiriciyi kullanın. 510 ± 20 nm emisyon filtresi aracılığıyla tek tek hücrelerin yayılan ışığı geçirin ve bir yüksek hassasiyet, yüksek hızlı dijital kamera ile yakalamak. </li><li> 550 nm bant geçiren filtre - Bir 515 ile 490 nm bant geçiren filtre ve yayılan ışık - Flu-4, filtre uyarma 460 ışığın tek bir dalgaboyu için. En hızlı ve en hassas kayıt için böyle bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanın. gerektiği gibi görüntü kazanır. </li><li> zamanın bir fonksiyonu ya tek bir dalga boyunda (Fluo-4) ya da dalgaboyu oranı kullanılarak floresan değişiklikleri ölçmekyöntemi (Fura-2), daha önce, 14 8 hazırlanır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+sliced+tissues.">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li><li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3.">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves.">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li><li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina.">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396 (2014).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina.">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588 (2015).</li><li>Velte, T. J., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+in+the+dendrites+of+retinal+ganglion+cells.">Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells.</a> J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).</li><li>Cameron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+AM+dyes+following+prolonged+incubation+in+acute+neuronal+tissue.">Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li><li>Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptation+of+spike+backpropagation+delays+in+cortical+neurons.">The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li><li>Breen, P. P., Buskila, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braincubator:+An+incubation+system+to+extend+brain+slice+lifespan+for+use+in+neurophysiology.">Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology.</a> Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).</li><li>Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Device+for+storing+a+tissue+sample.">Device for storing a tissue sample.</a> WIPO Patent. , (2015).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Sci Rep. 4, 4-10 (2014).</li><li>Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reactive+nitric+oxide+production+by+astrocytes+in+mouse+neocortical+slices.">Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices.</a> Glia. 52 (3), 169-176 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse.">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li></ol>

Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

Bu makale, böylece deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvan sayısının azaltılması, görüntüleme ve elektrofizyolojik deneyler için akut nöronal doku canlılığını uzatmak için bir kuluçka yöntem açıklanır. İki ana süreçleri zamanla nöronal doku bozulmasını yöneten: i) artan bakteri düzeyleri ve serbest bakteriyel endotoksin eşlik eden artış ve travmatik dilimleme işlemi 10 aşağıdaki ii) eksitotoksi. Akut nöronal doku çevre savunmasız olduğundan, pH,...

Elektrofizyoloji ve fonksiyonel görüntüleme (kalsiyum, gerilim duyarlı boyalar) nörobilim alanında en sık kullanılan deneysel teknikler ikisidir. Beyin dilim hazırlıkları ve burada ele alınacaktır retina wholemount, anestezik veya kas gevşeticiler gelen kirlenme olmadan elektrofizyolojik özellikleri ve sinaptik bağlantı inceleme olanağını sağlamaktadır. Beyin dilimleri ve retina belli devreler ve beyin ağları 1 çalışma sağlayan kültürlerin veya hücre homojenatları farklı olarak, yapısal bütünlüğünü muhafaza wholemount. İzole doku Kayıtlar kalp atışı ve solunum ile ilişkili hareketler olarak in vivo kayıtları üzerinde avantajları ortadan kalkar var. Ayrıca, doğrudan görselleştirme hedef hücre spesifik sınıfları ve farmakolojik araçlar 2, 3 lokal uygulamaya izin verir. Patch-kelepçe kayıtları ve kalkyum-yükleme boyası retina wholemount Retina Ganglion Hücre (RGC) katmanı kapsar ve hücrelere doğrudan erişimi engeller Membran (ILM), Sınırlama İç varlığı ile karmaşık. Tipik haliyle, bu membran, tek bir hücre üzerindeki bir gigaohm contanın bir yama pipet ve oluşum doğrudan uygulamaya izin vermek için bir cam pipet ile kazınarak. Buna ek olarak, küvet uygulanan kalsiyum boyalar ILM geçmez ve ya retrograd optik sinir 5 aşağıdaki enjeksiyon taşınan veya dokuya 6 boyunca elektroporasyon, bu zarın 4 altından enjekte edilmelidir. Retinitis pigmentosa kemirgen modeli kullanılırken Dahası, rd / rd fare, ILM daha kalın ve daha aşılmaz olduğunu. Burada, yama-kelepçe recordi için retina ganglion hücrelerinin her yerde kalsiyum boya yükleme ve doğrudan erişim hem de izin vermek, enzimatik sindirim 7 ile ILM kaldırmak için bir tekniği kullanırNGS 8. beyin dilimleri veya retina wholemount birinden başarılı kayıtları diseksiyon ve canlı nöronal doku inkübasyon bağlıdır. Tipik olarak, doku, deney sabahı ekstre edilir ve kayıt için kullanılana kadar yapay serebrospinal akışkan (CSF) &#39;de inkübe edilmiştir. Bu zaman penceresinde aşağıdaki önemli ölçüde bozulma ile, 8 saat - Genellikle, doku 6 canlı kalır. Ancak, beyin dilimleri ve wholemount retinae hazırlıkları hem genelde bu kısa süre içinde kaydedilebilir daha fazla doku üretir. Sonuç olarak, bağ, genellikle gün sonunda atılır ve diseksiyon sonraki günlerde daha tamamlanır. Bu, başka bir hayvan kullanılmıştır ve kurulum ve diseksiyon / tekrarlanan boyama ~ 2 saat demektir. Aşağıdaki protokol kullanılmaktadır daha az hayvan anlamına fazla 24 saat boyunca, nöronal dokuda ömrünü uzatmak için bir yöntem tarif eder, ve daha çok deneysel kez mevcuttur. Doku canlılığını Welektrofizyolojik özellikleri ve kalsiyum dinamikleri kayıt yoluyla değerlendirilir ve bu özellikleri &lt;4 saat ve&gt; 24 saat postdissection arasındaki ayırt olduğu gibi. Bu sonuçlar, uzun inkübasyondan sonra tek hücre özellikleri bozulmamış ve işlevsel değil sadece gösteriyor, ancak kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar ile değerlendirilen ağ etkinliği, 24&gt; değişmeden saat postdissection olduğunu. Ayrıca, kalsiyum boyalar herhangi bir zararlı etkiye neden olmadan uzun süreli dönemler için hücrelerde kalır olduğunu göstermektedir. Bu protokolün uygulanması dış çevre yüksek düzenlenir sonra akut nöronal dokuda nöronların fonksiyonel aktivitesi, uzun süreler boyunca muhafaza edilebileceğini göstermektedir. Doku canlılığı nedeniyle farklı inkübasyon protokolleri laboratuarlar arasında büyük farklılıklar Dahası, bu yöntem akut neu sağlığı değişkenliği azaltmak için uygulanması gereken ideal bir parametre için bir altın standardı belirlerronal dokusu.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Equiped with Leica&amp;rsquo;s Vibrocheck&amp;trade; measurement device&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&amp;nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

Diseksiyon Aşağıdaki 8 saat - nöronal doku preparatları, beyin kesitleri ve retina wholemount akut, genellikle 6 korunabilir. Bu deneysel zaman sınırlar ve çalışmanın başına kullanılan hayvanların sayısını artırır. Bu tür banyo uygulanan boyalar ile uzun süreli ön inkübasyon gerektiren kalsiyum görüntüleme gibi Bu sınırlama, özellikle etkiler protokolleri. 3 içinde Üstel bakteri üremesi - dilimleme sonra 4 saat sıkı doku sağlığı bir azalma ile ilişkilidir. Bu çalışma, büyüme faktörlerini içeren antibiyotiklere steril prosedürleri ya da doku kültürü ortamı gerek kalmadan zaman uzun süreli (&gt; 24 saat) için geçerli nöronal doku sağlamak için, akut preparasyonlarda bakterilerin üremesini sınırlamak için bir yöntem tarif eder. UV ışınlaması yoluyla dışı sıvıyı bisiklet ve 15 özel tutma odasında doku tutarak - 16 ° C, doku elektrofizyolojik özellikleri, veya kalsiyum si fark gösterir&gt; 24 saat postdissection hücre içi kalsiyum boyalar ile gnaling. Bu yöntemler akut nöronal doku kullananlar için deneysel süresini uzatmak kalmayacak, ama deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvanların sayısını azaltacak ve akut nöronal doku inkübasyon için bir altın standart ayarlar.

İnkübasyon sırasında aCSF bakteri yükü ve sıcaklık sıkı regülasyonu nöronal doku canlılığını korumak için şarttır. 16 ° C (Şekil 1) - Bu UVC ışığı ile ışınlama ve 15 aCSF sıcaklık muhafaza ile optimize edilebilir. (Şekil 1C APS), takip edildiği takdirde arasındaki değişkenliği azaltacak nöronal doku, kuluçka sırasında böylece parametreler için bir altın standart sunan, çevre koşullarının bir rekor (pH ve s...

Watch this Scientific Journal Video about Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging at JoVE.com

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

8 saat - vücuttan çıkarılır sonra, nöronal doku büyük ölçüde 6 sonra doku nihai bozulmasına sebep çevre koşullarından etkilenir. yakından takip eder ve dokunun hücredışı ortamı düzenleyen benzersiz inkübasyon yöntemi kullanılarak, doku canlılığını önemli ölçüde&gt; 24 saat boyunca uzatılabilir.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

prolonged-incubation-acute-neuronal-tissue-for-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Görüntüleme.  Western Sydney University.  8 saat - vücuttan çıkarılır sonra, nöronal doku büyük ölçüde 6 sonra doku nihai bozulmasına sebep çevre koşullarından etkilenir. yakından takip eder ve dokunun hücredışı ortamı düzenleyen benzersiz inkübasyon yöntemi kullanılarak, doku canlılığını önemli ölçüde> 24 saat boyunca uzatılabilir. 

Video: Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Nörobilim

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Establishing a Whole-Cell Configuration for Two-Photon Calcium Imaging of Brain Slices

Source: Camir&#233;, O., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56776">Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a protocol for whole-cell patch-clamp recording and two-photon calcium imaging in brain hippocampal slices. This method allows to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of different neuronal types in acute brain slices.

Beyin Dilimlerinin İki Fotonlu Kalsiyum Görüntülemesi için Tam Hücre Konfigürasyonunun Oluşturulması

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review.
1. Preliminary Preparation (Optional: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Source: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017)
This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

Uzun Süreli İnkübasyondan Sonra Bir Fare Beyin Diliminde Nöral Aktivitenin Ölçülmesi

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Dye Loading

	...

A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

Source: Cameron, M. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method for prolonged incubation of neuronal tissue of the retina. Eyecups containing retina are obtained from a mouse eye; the inner limiting membrane (ILM) is enzymatically digested to expose the neuronal cells of the retina, and either the treated eyecup or the isolated retina is transferred to a specialized incubator for prolonged incubation at a low temperature.

Retinanın nöronal dokusunun uzun süreli inkübasyonu için bir teknik

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Retinal Wholemount Preparation ...

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler