Değerli tavsiyeleri için Frank Yates'e minnettarız. Bu çalışma Sup'Biotech tarafından desteklendi.

1. Inocula hazırlığı
<ol><li>Deneyden önce, 5 μL Trichoderma spp döşeyin. SBT10-2018 sporları patates dekstroz agar ortamında (PDA) 4 °C'de saklanır ve konidia oluşumunu teşvik etmek için düzenli ışığa maruz kalarak 30 °C'de 4 gün kuluçkaya yatar42 (Şekil 1, panel A). NOT: Trichoderma spp. SBT10-2018 ahşaptan izole edilmiştir ve hızlı büyümesi ve spor kurtarma kolaylığı için bu çalışmada model olarak kullanılmaktadır. Bu suş laboratuvarımız tarafından korunuyor.</li>
	<li>Conidia'yı kurtarın (Şekil 1, panel A)<ol>
<li>Trichoderma miselyum üzerine 3 mL% 0.05 Tween-20 döşeyin.</li>
		<li>Konidiayı konidiophores'tan serbest bırakmak için bir tırmık kullanın; hyphae'nin yırtılmasını önlemek için miselyuma bastırmaktan kaçının.</li>
		<li>Agar ortamı tarafından emilmemesi için çözeltiyi bir mikropipette ile hızla kurtarın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Hemositometre kullanarak toplam spor sayısını sayın ve 3 x 106 spor/mL içeren bir çözelti hazırlayın. NOT: Hyphae'nin ayıklanmasını önlemek için bu adım dikkatlice gerçekleştirilmelidir. Spor hazırlığı daha sonra mikroskop altında kontrol edilir. Sonunda, son derece havadan ve kabarık miselyum sunan suşlar için, artık miselyum parçasını ortadan kaldırmak için 40 μM süzgeç filtresi kullanarak bir filtrasyon adımı eklenebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mantar plakalarının hazırlanması(Şekil 1,panel B)
<ol><li>925 spor/5 mm çaplı agar fişine karşılık gelen4.800 spor/cm 2 elde etmek için PDA ortamı içeren 9 cm çapında petri kabı üzerine bir mikropipette ile 3 x 10 6 spor/mL'nin 100 μL'sini biriktirin.</li>
	<li>Steril bir spatula ile 10 g 2 mm çapında cam boncuk ekleyin ve sporları agar yüzeyine eşit olarak dağıtmak için operatörün koluna paralel ve dik ileri ve geri hareketler gerçekleştirin.</li>
	<li>Plakayı 90° döndürün ve dönen hareketleri tekrarlayın (bölüm 2.2'de olduğu gibi); plaka tamamen döndürülene kadar bu adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Sporları gerektiren deneyler ayarlamak veya erken hyphae veya miselyum gerektiğinde plakaları 17 saat veya 24 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırmak için hemen plakayı kullanın. NOT: Miselyum tak-devret ve miselyum disk aktarımı sonrası ölçülen antifungal aktiviteyi karşılaştırmak için steril cımbız kullanın ve steril 5 mm selüloz diskleri spor yayıldıktan sonra agar plakasının yüzeyine rastgele yerleştirin.</li>
</ol>3. Antifungal bileşiklerin hazırlanması
<ol><li>Bitki türevi ürün hazırlama: sarımsak-toz hazırlama<ol>
<li>Taze sarımsak karanfillerini soyun ve karanfilleri neşter bıçağı kullanarak 2-3 mm genişliğinde dilimler halinde kesin.</li>
		<li>Dilimleri 40 °C'de 2 gün boyunca havayla kurulayın.</li>
		<li>İnce bir toz elde etmek için dilimleri bir bıçak değirmeni kullanarak 3 x 15 saniye boyunca öğütün.</li>
		<li>Sarımsak tozlarını kullanmadan önce 50 mL tüplerde 4 °C'de saklayın. NOT: Sarımsak otomatik olarak kapatılmayacağı için (sıcaklığa duyarlı antifungal bileşiklerin bozulmasını önlemek için) öğütücüyü, neşteri ve hava kurutucuyu kullanmadan önce% 70 etanol ile temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uçucu yağ hazırlama<ol>
<li>%0,5, %1, %2,5, %5 ve %20 Timus vulgaris uçucu yağ çözeltilerini %0,5 Ara-80'de hazırlayın.</li>
		<li>PDA ortamına eklemeden önce bir emülsiyon oluşturmak için iyice karıştırın (bkz. bölüm 4.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carbendazim hazırlığı<ol>
<li>200 mg/L etanol çözeltisi hazırlamak için carbendazim'i tartın (carbendazim suda zayıf çözünür).</li>
		<li>Çözeltiyi PDA ortamına eklemeden önce oda sıcaklığında saklayın (bkz. bölüm 4.2). DİkKAT: Carbendazim sağlık ve çevresel tehlike arz eder. Bu ürünü kullanırken eldiven ve maske takın. Havalandırılmış bir alanda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Temas-inhibisyon tahlilleri
<ol><li>Sarımsak tozu içeren agar plakalarının hazırlanması<ol>
<li>PDA ortamını hazırlayın ve otoklavlayın.</li>
		<li>Genellikle 0,25 mg/mL ile 16 mg/mL arasında değişen konsantrasyonlar elde etmek için istenen sarımsak tozu miktarını steril bir spatula kullanarak 50 mL'lik bir tüpe tartın.</li>
		<li>Bileğin iç kısmına ortamın sıcaklığını kontrol ettikten sonra 10 mL PDA ekleyin. Hassas moleküllerin bozulmasını önlemek için sıcaklık mümkün olduğunca düşük olmalıdır. İdeal olarak, bu sıcaklık 45 ° C olmalıdır.</li>
		<li>Tozu PDA ortamına eşit olarak dağıtmak için tüpü ters çevirerek dikkatlice homojenize edin. 5 cm çapında bir Petri kabına (Şekil 1 , panel C)10mL hızla dökün.</li>
		<li>Petri kabı oda sıcaklığına yerleştirilmişken, agar katılaşana kadar bekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esansiyel yağ veya karbendazim içeren agar plakalarının hazırlanması<ol>
<li>50 mL'lik bir tüpe 10 mL PDA sok. Bölüm 4.1.3 için sıcaklığı kontrol edin.</li>
		<li>%0,005, %0,01, %0,025, %0,05 ve %0,2 çözüm elde etmek için PDA'daki Thymus vulgaris esansiyel yağının farklı çözeltilerinden 100 μL ekleyin (bkz. bölüm 3.2.1).</li>
		<li>0.0625-2 mg/L arasında değişen çözümler elde etmek için 200 mg/L çözeltisinden gerekli karbendazim hacmini ekleyin (bkz. bölüm 3.3.1).</li>
		<li>Tüpü ters çevirerek dikkatlice homojenize edin, 5 cm çapında bir Petri kabına 10 mL hızla dökün(Şekil 1, panel C).</li>
		<li>Petri kabı oda sıcaklığına yerleştirilmişken, agar katılaşana kadar bekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temas inhibisyon tahlilleri (Şekil 1)<ol>
<li>5 mm çapında steril paslanmaz çelik boru ile, antifungal bileşikler de dahil olmak üzere PDA veya PDA içeren Petri kaplarının ortasına bir daire çizin. Agar silindirini steril bir kürdan (panel C) kullanarak atın.</li>
		<li>5 mm çapında steril paslanmaz çelik boru ile bölüm 2'den mantar plakalarına rastgele daireler çizin. Plaka başına 15-20 daire (panel B) arasında çizim yapın.</li>
		<li>Sporlar, erken hyphae veya miselyumla kaplı agar silindirlerini steril bir kürdanla dikkatlice çekin ve fişleri antifungal bileşikler (panel C) dahil olmak üzere PDA veya PDA içeren Petri tabaklarının boş alanına yerleştirin.</li>
		<li>Spor içeren plakaları 30 °C'de 48 saat, erken hyphae içeren plakalar için 31 saat ve miselyum (panel C) ile kaplı plakalar için 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Radyal büyümenin çapını ölçün ve formülü kullanarak mantar büyümesi inhibisyonunun kontrol üzerindeki yüzdesini hesaplayın (panel D) % mantar büyüme inhibisyonu = (C - Klima)* 100 burada C, PDA ortamında radyal büyümenin çapı ve antifungal bileşikleri içeren PDA ortamında radyal büyümenin çapıdır. NOT: Miselyum tak-devret ve miselyum disk aktarımı sonrası ölçülen antifungal aktiviteyi steril cımbız kullanarak karşılaştırmak için, daha önce antifungal bileşikler içeren PDA veya PDA içeren Petri kaplarının ortasına mantar plakalarının yüzeyine (bölüm 2 not) bir adet 5 mm çapında disk aktarın ve tam olarak agar-plug transferine devam edin</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Buhar Fazı inhibisyon tahlilleri
<ol><li>Sarımsak tozu içeren agar plakalarının hazırlanması<ol>
<li>Bölüm 3.1'deki gibi devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esansiyel yağ veya karbendazim içeren agar plakasının hazırlanması<ol>
<li>Bölüm 3.2 ve 3.3'teki gibi devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantar plakalarının hazırlanması<ol>
<li>Bölüm 2'deki gibi devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buhar fazlı antifungal inhibisyon tahlili (Şekil 1)<ol>
<li>10 mL PDA ortamı içeren 5 cm çapındaki Petri kaplarının kapağına 10 mL PDA ortamı veya antifungal bileşikler içeren 10 mL PDA ortamının kapağına tabakların dibine dökün. Agarın oda sıcaklığında (panel C) tamamen katılaşmasını bekleyin.</li>
		<li>Kapağın ortasında bir PDA çemberi elde etmek için kalibrasyon aracı olarak 50 mL santrifüj tüp kullanın; PDA'yı steril bir spatula (panel C) ile dairenin etrafından çıkarın.</li>
		<li>5 mm çapında steril paslanmaz çelik boru ile kapağın içine yerleştirilmiş PDA ortamının ortasına bir daire çizin. Agar silindirini steril bir kürdanla (panel C) atın.</li>
		<li>Bölüm 4.3.2'de (panel B) olduğu gibi mantar plakalarına rastgele 5 mm çapında steril paslanmaz çelik boru ile fişler takın.</li>
		<li>Steril bir kürdan kullanarak, sporlar, erken hyphae veya miselyum ile kaplı fişleri mantar plakalarından tahlil plakalarının kapaklarına (panel C) dikkatlice aktarın.</li>
		<li>Bölüm 4.3.4'te olduğu gibi 30 °C'de kuluçkaya yatır (C paneli).</li>
		<li>Radyal büyümenin çapını ölçün ve bölüm 4.3.5'teki (panel D) formülü kullanarak mantar büyüme inhibisyonunun yüzdesini hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Burada sunulan yaklaşım, minimum işlenmiş bitki türevi ürünlerin antifungal özelliklerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu protokolde, agar yüzeyindeki sporların homojen dağılımı 2 mm cam boncuk kullanılarak elde edilir. Bu adım, boncukları düzgün bir şekilde dağıtmak ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için elleçleme becerilerini gerektirir ve sonuçta mantar büyümesinin farklı aşamalarında antifungal etkilerin karşılaştırılmasına izin verir. Yayılma sırasında homojenizasyon...

Küresel meyve ve sebze kayıpları üretimin% 50'sine kadar ulaşabilir1 ve çoğunlukla tarlada veya hasat sonrası depolama sırasında mantar bozulmasının neden olduğu gıda çürümesinden kaynaklanabilir2,3, yirminci yüzyılın ortalarından bu yana sentetik mantar öldürücülerin kapsamlı istihdamına rağmen4. Bu maddelerin kullanımı, ciddi çevresel ve sağlık tehlikelerini temsil ettiği için yeniden gözden geçiriliyor. Kullanımlarının zararlı sonuçları ekosistemler boyunca ortaya çıktıkça ve potansiyel sağlık etkilerinin kanıtları biriktiğinden5,6, hasat öncesi ve sonrası tedaviler için eski profilaktik stratejilere yeni alternatifler geliştirilmektedir7,8,9. Bu yüzden karşılaştığımız zorluk ikiye katlanıyor. Yeni mantar öldürücü stratejiler, öncelikle fitopatojenlere karşı gıda korumanın etkinlik düzeylerini korumalı ve ikinci olarak, tarım uygulamalarının çevresel ayak izini önemli ölçüde azaltmaya katkıda bulunmalıdır. Bu iddialı hedefi gerçekleştirmek için, antimikrobiyal özellikleri için 1000'den fazla bitki türü vurgulandığı için bitkilerde geliştirilen doğal savunmalardan ilham alan stratejiler önerilmektedir8. Örneğin, fitopatojenlerle savaşmak için doğal mantar öldürücüler geliştiren bitkiler, yeni biyokontrol ürünlerinin geliştirilmesini keşfetmek için yeni bir kaynaktır2. Uçucu yağlar bu tür amiral gemisi molekülleridir. Örneğin, Origanum esansiyel yağı domates bitkilerini seralarda gri küfe karşı korur 10 ve Solidago canadensis L. ve cassia esansiyel yağlarının hasat sonrası çilekleri gri küf hasarından koruduğu gösterilmiştir11,12. Bu örnekler, biyokontrol ve özellikle bitki kaynaklı ürünlerin biyolojik etkinlik ve çevresel sürdürülebilirliği birleştiren bir çözümü temsil ettiğini göstermektedir.
Bu nedenle, bitkiler mahsul koruma endüstrisi için potansiyel ilgi alanı olan moleküllerin önemli bir kaynağıdır. Bununla birlikte, genellikle güvenli, fitotoksik olmayan ve çevre dostu olarak kabul edilseler de biyokontrol ürünleri olarak kullanılmak üzere sadece bir avuç bitki ürünü önerilmiştir2. Laboratuvardan alana transpozisyonda, in vivo2,9'dauygulandıktan sonra etkinliğin azalması gibi bazı zorluklar gözlenmiştir. Bu nedenle, laboratuvar testlerinin alan etkinliğini daha iyi tahmin etme yeteneğini geliştirmek önemli hale gelir. Bu bağlamda, bitki kaynaklı ürünler için antifungal test yöntemleri hem antifungal etkinliklerini değerlendirmek hem de kullanım için en uygun koşullarını tanımlamak için gereklidir. Özellikle, biyokontrol ürünleri genellikle kimyasal mantar öldürücülerden daha az verimlidir, bu nedenle uygun formülasyonlar önermek, alanlardaki uygulama modunu tanımlamak ve patojenin hangi gelişim aşamasının aday biyoproduct'a karşı savunmasız olduğunu tanımlamak için eylem modlarının daha iyi anlaşılması önemlidir.
Antibakteriyel ve antifungal aktiviteleri ele alan güncel yaklaşımlar arasında agar-disk difüzyonu, seyreltme, biyoautografi ve akış sitometrisi gibi difüzyon yöntemleri yer almaktadır.13. Bu tekniklerin çoğu ve daha spesifik olarak, standart antifungal duyarlılık testi - agar-disk difüzyon ve seyreltme tahlilleri - sıvı süspansiyonlardaki bakteriyel ve mantar sporları üzerindeki çözünür bileşiklerin antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için iyi uyarlanmıştır.14. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle kurutulmuş bitki tozu gibi katı bileşiklerin test etmek veya miselyum büyümesi sırasında antifungal aktiviteyi ölçmek için uygun değildir, çünkü agar plakalarına yayılan spor seyreltme veya spor ve/ veya antifungal bileşiklerin seyreltilmesini gerektirirler.13. Gıdadan zehirlenen yöntemde, antifungal ajanı içeren agar plakaları, miselyuma başlamanın kesin miktarı dikkate alınmadan 7 günlük bir mantar kültüründen örneklenen 5-7 mm çapında bir diskle aşılanır. İnkübasyondan sonra, antifungal aktivite radyal büyüme inhibisyonunun bir yüzdesi olarak belirlenir.17,18,19. Bu yaklaşımla misel büyümesi üzerindeki antifungal aktiviteyi değerlendirebiliriz. Buna karşılık, agar seyreltme yöntemi, antifungal bileşikleri içeren agar plakasının yüzeyine doğrudan aşılanan sporlar üzerindeki antifungal aktiviteyi belirlemek için gerçekleştirilir.13,20,21. Bu iki yaklaşım antifungal aktivite üzerinde tamamlayıcı sonuçlar verir. Bununla birlikte, antifungal bileşiklerin sporlar ve miselyum üzerindeki göreceli etkinliğinin doğru bir şekilde yan yana karşılaştırılmasını sağlamayan paralel olarak kullanılan iki bağımsız tekniktir.17,20,22 başlangıç mantar malzemesi miktarı iki yaklaşımda farklılık gösterir. Ayrıca, bitki türevi bir ürünün antifungal aktivitesi genellikle bitkiler tarafından sentezlenen antifungal moleküllerin patojenlerle yüzleşmek için birleştirilmesinden kaynaklanır. Bu moleküller proteinleri, peptitleri kapsar23,24ve polifenoller, terpenler, alcaloïds gibi farklı molekül sınıflarına ait ve geniş kimyasal çeşitliliğe sahip metabolitler25, glukozinolatlar8ve organosülfur bileşikleri26. Bu moleküllerin bazıları patojen saldırısı sırasında uçucudur veya uçucu hale gelir27. Bu ajanlar genellikle, bazıları antimikrobiyal faaliyetleri iyi kurulmuş olan uçucu yağlar olarak su damıtma yoluyla geri kazanılması gereken zayıf suda çözünür ve yüksek buhar basınçlı bileşiklerdir.28. Buhar fazı ile buharlaşma ve göçten sonra uçucu bileşiklerin antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için buhar fazı aracılı duyarlılık tahlilleri geliştirilmiştir.29. Bu yöntemler, mikrobiyal kültürden uzak bir mesafede antifungal bileşiklerin tanıtılmasına dayanmaktadır.29,30,31,32,33. Yaygın olarak kullanılan buhar fazlı agar tahlilinde, uçucu yağlar bir kağıt diske biriktirilir ve agar ortamına yayılan bakteriyel veya mantar sporları süspansiyonundan uzakta Petri kabının kapağının ortasına yerleştirilir. Büyüme inhibisyon bölgesinin çapı daha sonra agar-disk difüzyon yöntemi ile aynı şekilde ölçülür.20,24. İnhibitör buhar faz aracılı antimikrobiyal aktivitenin hesap edildiği et suyu seyreltme yönteminden elde edilen esansiyel yağların buhar fazı antifungal duyarlılığının nicel ölçümünü sağlamak için başka yaklaşımlar geliştirilmiştir.32veya agar-disk difüzyon testlerinden türetilmiştir31. Bu yöntemler genellikle buhar fazı aktivite çalışmalarına özgüdür ve temas-inhibisyon testlerine uygun değil. Bu, uçucu ve uçucu olmayan ajanların karmaşık bir biyoaktif karışımın antifungal aktivitesine göreceli katkısının belirlenmesini önler.
Geliştirdiğimiz nicel yöntem, kurutulmuş bitki tozunun kontrollü miktarlarda sporlar üzerindeki antifungal etkisini ölçmeyi amaçlamaktadır ve bitkilerin enfeksiyonu sırasında fitopatojenlerin havadan büyümesini çoğaltmak için bir agar ortamının yüzeyinde biriken miselyum15 ve birbirine bağlı bir misel ağı16. Yaklaşım, aynı deneysel kurulumda hem uçucu hem de uçucu olmayan antifungal metabolitlerin katkısının yan yana ölçülmesine izin veren agar seyreltme ve gıdadan zehirlenmiş yöntemlere dayanan değiştirilmiş bir deneysel kurulumdur. Bu çalışmada, yöntem iyi karakterize edilmiş üç antifungal preparatın aktivitesi ile karşıttır.

<table><tbody><tr><td>Autoclave-vacuclav 24B+</td><td>Melag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbendazim</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>378674-100G</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Falcons tubes</td><td>Sarstedt</td><td>547254</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Five millimeters diameter stainless steel tube</td><td>retail store</td><td></td><td>/</td></tr><tr><td>Food dehydrator</td><td>Sancusto</td><td></td><td>six trays</td></tr><tr><td>Garlic powder</td><td>Organic shop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>CLOUP</td><td>65020</td><td>&lt;img alt=&quot;Equation 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png&quot;/&gt; 2 mm</td></tr><tr><td>Hemocytometer counting cell</td><td>Jeulin</td><td>713442</td><td>/</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td>&amp;nbsp;UM400</td><td>30 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Knife mill</td><td>Bosch</td><td>TSM6A013B</td><td></td></tr><tr><td>Manual cell counter</td><td>Labbox</td><td>HCNT-001-001</td><td>/</td></tr><tr><td>Measuring ruler</td><td>retail store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbiological safety cabinets</td><td>FASTER</td><td></td><td>FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Mettler-Toledo</td><td>17014407</td><td>100 - 1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Mettler-Toledo</td><td>17014411</td><td>20 - 200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Mettler-Toledo</td><td>17014412</td><td>2 - 20 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Sarstedt</td><td>82-1194500</td><td>&lt;img alt=&quot;Equation 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png&quot;/&gt; 55 mm</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Sarstedt</td><td>82-1473&amp;nbsp;</td><td>&lt;img alt=&quot;Equation 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png&quot;/&gt; 90 mm</td></tr><tr><td>Pipette Controllers-EASY 60</td><td>Labbox</td><td>EASY-P60-001</td><td>/</td></tr><tr><td>Potato Dextrose Agar</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>70139-500G</td><td></td></tr><tr><td>Precision scale-RADWAG</td><td>Grosseron</td><td>B126698</td><td>AS220.R2-ML 220g/0.1mg&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rake</td><td>Sarstedt</td><td>86-1569001</td><td>/</td></tr><tr><td>Reverse microscope AE31E trinocular</td><td>Grosseron</td><td>M097917</td><td>/</td></tr><tr><td>Sterile graduated pipette</td><td>Sarstedt</td><td>1254001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Thymus essential oil</td><td>Drugstore</td><td></td><td>Essential oil 100%</td></tr><tr><td>Tips 1000 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>70.762010</td><td></td></tr><tr><td>Tips 20 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>70.760012</td><td></td></tr><tr><td>Tips 200 &amp;micro;L</td><td>Sarstedt</td><td>70.760002</td><td></td></tr><tr><td>Tooth pick</td><td>retail store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma spp strain</td><td></td><td></td><td>Strain of LRPIA laboratory</td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P1379-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Labbox</td><td>FORS-001-002</td><td>/</td></tr></tbody></table>

measuring volatile and non-volatile antifungal activity of biocontrol products

Açıklanan protokol, mikroorganizma miktarlarının ve gelişim aşamalarının doğru belirlenmesini sağlayan bir tak-transfer tekniğine dayanmaktadır. Belirtilen sayıda spor bir agar tabağına yayılır. Bu agar plakası, inkübasyonun gerekli olmadığı sporlar dışında mantarların beklenen gelişim aşamasına ulaşmasını sağlamak için belirli bir süre kuluçkaya yatırılır. Sporlar, hyphae veya miselyum ile kaplı agar fişleri daha sonra çekilir ve mantarlardan uzak bir yere veya temas halinde test edilecek antifungal bileşiği içeren agar ortamına aktarılır. Bu yöntem hem sıvı özleri hem de katı numuneleri (tozları) test etmek için geçerlidir. Özellikle uçucu ve uçucu olmayan ajanların biyoaktif karışımlardaki göreceli katkılarını ölçmek ve özellikle sporlar, erken hyphae ve miselyum üzerindeki etkilerini belirlemek için çok uygundur.
Yöntem, biyokontrol ürünlerin, özellikle bitki kaynaklı ürünlerin antifungal aktivitesinin karakterizasyonu için son derece önemlidir. Gerçekten de, bitki tedavisi için, sonuçlar uygulama modu seçimine rehberlik etmek ve tetik eşiklerini belirlemek için kullanılabilir.

Nicel yöntemin farklı antifungal bileşiklerin etki şeklini ayırt etme yeteneğini değerlendirmek için, üç iyi bilinen antifungal ajanın etkinliğini karşılaştırdık. Carbendazim, bitkilerde çok çeşitli mantar hastalıklarını kontrol etmek için yaygın olarak kullanılan uçucu olmayan sentetik bir mantar ilacıdır39,40. Timus vulgaris esansiyel yağı büyük ölçüde antibakteriyel ve antifungal aktivitesi için tanımlanmıştır ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products at JoVE.com

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Bitki türevi ürünlerin antifungal etkilerini ölçmek için tasarlanmış modifiye edilmiş bir agar bazlı yöntemi açıklıyoruz. Antifungal aktiviteye hem uçucu hem de uçucu olmayan katkılar bu protokol ile değerlendirilebilir. Ek olarak, mantarlara karşı etkinlik tek bir deneysel kurulumda önemli gelişim aşamalarında ölçülebilir.

Biyokontrol Ürünlerin Uçucu ve Uçucu Olmayan Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

measuring-volatile-non-volatile-antifungal-activity-biocontrol

Research

JoVE Journal

Environment

6.2K Görüntüleme.  Sup’Biotech. Bitki türevi ürünlerin antifungal etkilerini ölçmek için tasarlanmış modifiye edilmiş bir agar bazlı yöntemi açıklıyoruz. Antifungal aktiviteye hem uçucu hem de uçucu olmayan katkılar bu protokol ile değerlendirilebilir. Ek olarak, mantarlara karşı etkinlik tek bir deneysel kurulumda önemli gelişim aşamalarında ölçülebilir.

Video: Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

İnsektisit Direnci İzleme için biyoanalizlere

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Biyoloji

Biyokontrol için Doğal Ürünleri Tanımlamak için TLC-Direct Bioautography Testini Kullanma

Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are antagonistic against a target pathogen. It is a rapid, inexpensive, and simple option for the bioassay-guided isolation and identification of NPs that hinges on separation by TLC coupled with the direct application of a target pathogen to examine bioactivity. It is typically used for the analysis of bioactive plant extracts, detecting inhibitory activity against bacteria, fungi, and enzymes. That being said, it has great potential in bacterial NP discovery, particularly for evaluating bacterial NPs against pertinent agricultural pathogens, which is valuable for discovering and developing novel biopesticides for the agriculture industry. Furthermore, it is a tunable protocol that could be applied to other target pathogens or sources of NPs in research programs concerning the discovery and identification of bioactive compounds. Herein, we describe a model system for discovering and identifying biopesticide NPs using TLC-DB with Bacillus spp. and the agricultural pathogen Sclerotinia sclerotiorum.

Yazar Spotlight: Biyoaktif Toprak Mikroplarından Elde Edilen Doğal Ürünlerden Yeni Biyopestisitlerin Keşfedilmesi

We describe the use of thin-layer chromatography direct bioautography assay and liquid chromatography-mass spectrometry to identify microbial natural products that display antagonism against fungal pathogens using the pathogen Sclerotinia sclerotiorum and biopesticidal Bacillus isolates as a model system.

İnce Tabaka Kromatografisi-Doğrudan Biyootoografi ile Biyokontrol için Doğal Ürünlerin Biyotahlil Kılavuzluğunda Tanımlanması

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are ...

Biyokimya

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation on implanted devices or catheters, which is associated with increased virulence and mortality. Biofilms produced by different Candida species exhibit enhanced resistance against various antifungal drugs. Therefore, there is a need to develop effective immunotherapies or adjunctive treatments against Candida biofilms. While the role of cellular immunity is well established in anti-Candida protection, the role of humoral immunity has been studied less.
It has been hypothesized that inhibition of biofilm formation and maturation is one of the major functions of protective antibodies, and Candida albicans germ tube antibodies (CAGTA) have been shown to suppress in vitro growth and biofilm formation of C. albicans earlier. This paper outlines a detailed protocol for evaluating the role of antibodies on biofilms formed by C. tropicalis. The methodology for this protocol involves C. tropicalis biofilm formation in 96-well microtiter plates, which were then incubated in the presence or absence of antigen-specific antibodies, followed by a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) assay for measuring the metabolic activity of fungal cells in the biofilm.
The specificity was confirmed by using appropriate serum controls, including Sap2-specific antibody-depleted serum. The results demonstrate that antibodies present in the serum of immunized animals can inhibit Candida biofilm maturation in vitro. In summary, this paper provides important insights regarding the potential of antibodies in developing novel immunotherapies and synergistic or adjunctive treatments against biofilms during invasive candidiasis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

A 96-well microtiter plate-based protocol using a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reduction assay is described herein, to study antibodies' effects on biofilms formed by C. tropicalis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

Toprak Örneklerinden İntomopatojenik Mantarların İzolasyonu ve Seçimi ve Böcek Zararlılarına Karşı Mantar Virülansının Değerlendirilmesi

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

Traditional methods for performing antifungal susceptibility testing for Candida albicans are time-consuming and lack quantitative results. For example, a common approach relies on plating cells treated with different concentrations of antifungal molecules on agar plates and then counting the colonies to determine the relationship between molecule concentration and growth inhibition. This method requires many plates and substantial time to count the colonies. Another common approach eliminates the plates and counting of colonies by visually inspecting cultures treated with antifungal agents to identify the minimum concentration required to inhibit growth; however, visual inspection produces only qualitative results, and information on growth at subinhibitory concentrations is lost. This protocol describes a method for measuring the susceptibility of C. albicans to antifungal peptides. By relying on optical density measurements of cultures, the method reduces the time and materials needed to obtain quantitative results on culture growth at different peptide concentrations. The incubation of the fungus with peptides is performed in a 96-well plate using an appropriate buffer, with controls representing no growth inhibition and complete growth inhibition. Following the incubation with the peptide, the resulting cell suspensions are diluted to reduce peptide activity and then grown overnight. After overnight growth, the optical density of each well is measured and compared to the positive and negative controls to calculate the resulting growth inhibition at each peptide concentration. The results using this assay are comparable to the results using the traditional method of plating the cultures on agar plates, but this protocol reduces plastic waste and the time spent on counting colonies. Although the applications of this protocol have focused on antifungal peptides, the method will also be applicable to testing other molecules with known or suspected antifungal activity.

Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

This protocol describes a method for obtaining quantitative data on the antifungal activity of peptides and other compounds, such as small-molecule antifungal agents, against Candida albicans. Its use of optical density rather than counting colony-forming units to quantify growth inhibition saves time and resources.

Peptitlerin Candida albicans'a Karşı Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Traditional methods for performing antifungal susceptibility testing for Candida albicans are time-consuming and lack quantitative results. For example, a ...

Biyokontrol Ürünlerin Uçucu ve Uçucu Olmayan Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

İnsektisit Direnci İzleme için biyoanalizlere

İnce Tabaka Kromatografisi-Doğrudan Biyootoografi ile Biyokontrol için Doğal Ürünlerin Biyotahlil Kılavuzluğunda Tanımlanması

İnce Tabaka Kromatografisi-Doğrudan Biyootoografi ile Biyokontrol için Doğal Ürünlerin Biyotahlil Kılavuzluğunda Tanımlanması

İnce Tabaka Kromatografisi-Doğrudan Biyootoografi ile Biyokontrol için Doğal Ürünlerin Biyotahlil Kılavuzluğunda Tanımlanması

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Toprak Örneklerinden İntomopatojenik Mantarların İzolasyonu ve Seçimi ve Böcek Zararlılarına Karşı Mantar Virülansının Değerlendirilmesi

Peptitlerin Candida albicans'a Karşı Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi